基因克隆的几种常见方法

基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。

1 根据已知序列克隆基因

对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为

https://www.360docs.net/doc/a3814455.html,/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为

https://www.360docs.net/doc/a3814455.html,/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。

根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。

另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。

2 根据已知探针克隆基因

这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探

针杂交后,要注意高强度(high stringent)漂洗,以避免干扰信号,即保证克隆的特异性,同时节省时间。

3 未知序列的基因打靶

根据已知序列进行基因克隆,多数是重复别人的工作,或者是在别人工作的基础上继续自己的工作,因而不存在新基因的克隆过程。对未知序列的基因克隆才是真正的创造性研究。

3．1 随机引物法克隆未知序列基因［1］随机引物PCR(arbitrarily primed PCR,AP-PCR)首先被用于基因组DNA或RNA的指纹图谱(finger print)分析,后来也有人将这种方法用于克隆与表型相关的基因或mRNA。该方法的理论依据是:表型受基因支配,在一个生物体发生了表型变化后,其基因组DNA很可能发生变化或出现不同基因的激活或关闭等;另一方面,如在寄生虫的发育过程中,不同发育阶段的虫体所表达的基因很可能不同,如将不同发育阶段的虫体mRNA提取出来,用单一引物(随机引物,其长度不超过16 nt)对不同时期的虫体mRNA进行扩增比较,即可找出导致表型变异的遗传学依据。这种方法是一种比较PCR,它要求至少有2种来自不同表型但又很类似的基因组DNA或mRNA。AP-PCR扩增后的产物必须99%是一致的,只有个别特异的产物出现在特异的表型个体中。该方法对表型或种源关系相差甚远的生物个体之间没有比较意义.

应用AP-PCR法进行2种或多种表型特征类似的个体间指纹图谱分析或表型相关基因克隆箭头所指扩增带为特异于个体(Ⅱ)的扩增产物AP-PCR的操作一般采用两步法,即前10个循环多以较低的退火温度(annealing temperature)进行扩增,后20个循环则采用较高的退火温度扩增。AP-PCR产物多较短,一般需高浓度的琼脂糖凝胶检测,也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。如扩增的模板为mRNA,通过比较扩增产物的强度,可以得知该基因在2种生物或同一生物不同发育阶段的表达强度。另外,在AP-PCR检测到与某一表型相关的基因或基因产物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整个基因或mRNA。主要操作程序为1)AP-PCR产物的提取、克隆及序列测定。首先将AP-PCR检测到的特定片段从凝胶中切下,提取DNA克隆到适宜的载体内(如TA载体),再测定其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2

个方向相反的引物(P-1,P-2,见图2)。引物长度多在20 nt以上；退火温度在60℃以上；(2)将基因组DNA做适当酶切,然后在其两端连接上相同的接头(这种接头可从生物制品公司购买)。根据接头的序列扩增。

3.2 Differential display PCR(DD-PCR)DD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RT- PCR方法,主要用于2种或多种类似生物个体在基因表达上的差异分析。其基本原理是:所有真核生物的成熟mRNA都含有不同长度的poly (A)尾部序列,根据poly (A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将所有的mRNA分子分为12类(见图3)。根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即

M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种 cDNA分别做模板进行PCR 扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于 2种种源近似生物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是来自2个生物或同一生物的不同发育

阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。

3.3 Representative difference analysis PCR (RDA-PCR)［3～5］这是一种差减杂交 (subtractive hybridizatio-n)与PCR相结合的技术，其整个操作程序完全不同于AP-PCR和DD-PCR。前2种方法是将两模板DNA或cDNA分别进行PCR扩增,最后通过扩增产物的差异,分离和克隆特异扩增带,其缺点是需要将特异扩增产物从胶中切下来,提取DNA,再扩增后才能克隆。RDA-PCR只扩增区别于某一表型的特异基因，因而更便于扩增产物的克隆与分析(见图5)。其基本原理是：用一个在种源上相近的基因组将靶基因组中所有共同的基因掩盖起来,而只暴露出特异的基因,在整个反应中只有特异基因能被扩增。其操作程序为:(1)用同一限制性内切酶(一般用Bam HI,Bgl II或Hind III)同时处理靶基因组和掩盖基因组DNA，其中掩盖基因组DNA的量至少要2倍于靶基因组DNA的量；(2)在经酶切的靶基因组片段的两端加上连接头,其序列与酶切产生的粘性末端的序列相对应；(3)将2个基因组的DNA混合后,高温变性,低温退火。由于掩盖基因组DNA的量远大于靶基因组DNA 量,那么与掩盖基因组DNA相同的靶基因就会与掩盖基因形成杂合体，而只有特异的靶基因才能重新组合,不会受掩盖基因的影响；(4)用Taq DNA聚合酶将粘性末端补齐后,加入与连接子相对应的引物,经过30个左右的PCR扩增,就可以将靶基因组中与掩盖基因不同的特异基因扩增出来。这种方法的起始操作程序较复杂,各反应步骤要求准确无误,但其检测的准确度较高。对于基因组内的点突变、重排、插入序列等变化均可检测出来。

4 用特异抗体克隆基因

用抗体克隆基因的关键是抗体的特异性。一般以单克隆抗体最为理想。获取特异抗体的方法主要有:(1)制备识别功能抗原的单克隆抗体;(2)将SDS-PAGE分离的蛋白质特异带切下免疫动物,其抗体只识别该特异蛋白质;(3)用

Western-blot法将识别某一蛋白质带的抗体从膜上洗脱下来。在获取理想的抗体后,便可以用这些抗体筛选表达型基因组文库或cDNA 文库,从文库中将编码

某一特异蛋白质的基因克隆出来。

5 特异基因的功能克隆

它是借助于基因产物即基因所编码的蛋白质的功能将该基因克隆出来的一种方法。基因的功能克隆主要有2种:一是phage display［6，7］,另一是 peptide display。后者的原理与前者基本相同。目前以phage display的应用最为广泛,本文只对这一方法加以介绍。

任何一种病原体，包括细菌、病毒和寄生虫,在其对宿主侵入或致病过程中,病原体本身的蛋白质成分(ligand)需要首先与宿主细胞上的受体 (receptor)相互识别连接。如口蹄疫病毒需要借助于受体细胞上的Heparan sulfate受体，并与其相互作用后才能侵入细胞内；巴贝斯虫裂殖子需借助于宿主的补体作为桥梁，才能与红细胞结合并最后侵入红细胞内。对病原体与宿主受体相互作用成分的特性与功能分析,是制订免疫预防措施及制备阻断药物的前提。phage display 法是克隆病原体ligand的一种最为理想的手段。

Phage display的基本操作过程为:(1)提取某一病原体基因组DNA,用超声波将DNA切割成500～1 500的片段;(2)将片段末端用T4DNA聚合酶处理后,与载体

DNA(phagemid)连接形成噬菌体质粒。用这些质粒与辅助噬菌体(helper phage)同时转染大肠杆菌。phagemid在大肠杆菌内包装成噬菌体,大量繁殖,同时将插入的外源基因片段表达,表达产物主要集中在噬菌体颗粒的表面；(3)将特定的受体固定于载体上(多为ELISA板),方法同一般的ELISA包被。将噬菌体悬液作适当稀释后,加入平板孔内,感作一段时间,用 PBS等缓冲液漂洗。最后,只有表达特异功能蛋白的噬菌体才能与包被在平板上的受体相互结合,那些表达非相关蛋白的噬菌体由于不能与受体连接而被洗脱; (4)用高强度NaCl液将结合在受体上的噬菌体分离下来,再感染大肠杆菌,便可将编码特异功能蛋白质的基因克隆。

一个真核生物至少含有10万个不同的基因,其中只有10%～15%的基因在不同的发育时期表达,且不同的基因表达的强度相差甚远。在致病生物中,致病力强的生物,其致病因子(往往是1种或几种功能蛋白或酶)的表达量往往多于致病力弱的生物。从基因组中将人们感兴趣的基因或其转录产物扩增并克隆出来,是进一步对所编码蛋白质作功能分析的关键。本文介绍的几种基因克隆的方法是近几年应用比较广泛的方法。在具体实验中选择哪一种方法,还要根据研究者所要克隆的基因及其所在的基因组和对该基因的研究背景来决定。

校本课程：常用的巧算和速算方法

*****校本课程数学计算方法第一讲生活中几十乘以几十巧算方法1.十几乘十几：口诀：头乘头，尾加尾，尾乘尾。例：12 X 14= ? 解：1 X仁1 2 + 4 = 6 2X4 = 8 12 X 14=168 注：个位相乘，不够两位数要用0占位。 2 .头相同，尾互补（尾相加等于10）：口诀：一个头加1后，头乘头，尾乘尾。例：23 X 27= ? 解：2+1=3 2X3 = 6 3X7 = 21 23 X 27=621 注：个位相乘，不够两位数要用0占位。 3 .第一个乘数互补，另一个乘数数字相同：

口诀：一个头加1后，头乘头，尾乘尾。

例：37 X 44= ? 解：3+1=4 4 X 4=16 7 X 4=28 37 X 44=1628 注：个位相乘，不够两位数要用0占位 4 .几十一乘几十一：口诀：头乘头，头加头，尾乘尾例：21 X 4仁？解：2 X 4=8 2+4=6 1 X 1=1 21 X 41=861 5 .11乘任意数：口诀：首尾不动下落，中间之和下拉例：11 X 23125= ? 解：2+3=5 3+1=4 1+2=3 2+5=7

2和5分别在首尾 11 X 23125=254375 注：和满十要进一。 6 .十几乘任意数：口诀：第二乘数首位不动向下落，第一因数的个位乘以第二因数后面每一个数字, 加下一位数，再向下落。例：13 X 326= ？解：13个位是3 3X 3+2=11 3X 2+6=12 3 X 6=18 13 X 326=4238 注：和满十要进一。第二讲常用巧算速算中的思维与方法（1）【顺逆相加】用“顺逆相加”算式可求出若干个连续数的和。例如著名的大数学家高斯（德国）小时候就做过的“百数求和”题，可以计算为1+2 + ....... +99+100 14 2+ 3 + .................... + 99+ 100 + ）100+ 99+98+ ........................ 十 2 +1 | 101 + 101+101 + .................... + 10HW1 所以，1 + 2+ 3 + 4+……+ 99+ 100

六年级下册数学试题-奥数思维训练：-3：巧算的方法(含答案)全国通用

六年级下册数学试题-奥数思维训练：-3：巧算的方法（含答案）全国通用巧算的方法同学们，能够在看似无序的算式中寻找到一定的规律，化繁为简，那么一定能够增强你学习数学的信心、兴趣和能力。智慧姐姐例题精选⑴ 9＋99＋999 ⑵ 84＋83＋78＋79＋80＋77 【思路点睛】⑴ 方法一：把9、99、999分别看作10、100、1000进行相加。因为每个加数都多加了1，所以要再从它们的和中减去3。 9＋99＋999 ＝10＋100＋1000－3 ＝1110－3 ＝1107 方法二：从9中分出1加给99，再分出1加给999。 9＋99＋999 ＝7＋100＋1000 ＝1107 ⑵ 观察这6个的数大小，你会发现这些数的大小相差不大，都接近80，我们可以先把这几个数都看作是80，先求6个80的和，然后再将原来的数逐一和80相比，比80大几的，就再加几，比80小几的就再减几。这种巧算的方法就叫“找基准数”。 84＋83＋78＋79＋80＋77 ＝80×6＋（4＋3－2－1－3）＝480＋1 ＝481 思维体操

1．399＋298＋197＋96 2．199＋1999＋19999 3．31＋28＋29＋30＋32＋33 4．68＋71＋72＋70＋69＋68＋71 例题精选⑴ 355＋82－123＋645－182－77 ⑵ 578＋（122－46）－（198＋54）【思路点睛】⑴ “355”与“＋645”，合起来凑整；“＋82”与“－182”加减抵消，减数大，抵消之后仍然减；“－123”与“－77”，合成“－200”。 355＋82－123＋645－182－77 ＝1000－100－200 ＝700 ⑵ 在计算有括号的运算时，先算括号里的，但有时可以先去掉括号，然后进行运算会更加简便。去括号时，如果括号前面是加号，可直接去掉括号，其它都不变；如果括号前面是减号，那么去括号后，原括号里面的运算符号要变号，加号变减号，减号变加号。 578＋（122－46）－（198＋54）＝578＋ 122－46 － 198－54 ＝700―100―198 ＝600－200＋2 ＝402 思维体操1．735－326－274 2．1409－579＋79 3．684－65＋26＋74－135

基因克隆及转基因方法

基因克隆及转基因一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物软件是https://www.360docs.net/doc/a3814455.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何；（如果克隆的话不能满足条件也没办法。）不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。步骤：一、打开PrimerSelect和EditSeq。二、在EditSeq中输入你的序列。引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；

实用巧算和速算方法

分数、小数的四则混合运算，与整数的四则混合运算一样，按先乘除、后加减的运算顺序。整数运算中的性质和定理，在分数、小数的运算中同样适用。但是，要提高分数、小数的运算速度和正确率，除了掌握这些常规的运算法则外，我们还应该掌握一些特殊的运算技巧和技能，常用的分数、小数的运算技巧和方法有凑整法、代数法、裂项法。就我个人的教学总结一下自己的方法: 如一: 2.19+6.48+0.51-1.38-5.48-0.62 当有多个数做加、减计算时，如果把一些数结合得好，就会使计算简便。因此，在计算时，需要我们从头到尾观察一下，是否可以通过前后次序的交换，把某些数结合在一起算，使计算简便。 2.19+6.48+0.51-1.38-5.48-0.62 =(2.19+0.51)+(6.48-5.48)-(1.38+0.62) =2.7+1-(1.38+0.62) =3.7-2 =1.7 本题不仅用上所学加法结合率，而且还用上了减法的性质。所以说灵活的掌握和运用所学的运算定律、性质等是简算关键。如二: (123+123123+123123123)÷(234+234234+234234234) 这道题的数比较特殊，第一个括号里，是123加上123123再加上123123123；第二个括号里，是234加上234234再加上234234234。我们可能会想到解这种题有什么规律吗？我们看：(123+123123+123123123)÷(234+234234+234234234)本题不仅适合三位数，也适合于四位数、五位数等. 如三: (1+0.23+0.34)×(0.23+0.34+0.45)-(0.23+0.34)×(1+0.23+0.34+0.45) 我们发现，每个括号里的数多次出现，即使用运算定律也比较麻烦，我们可以运用代数法，把题目中多次出现的部分用字母来表示。这时，我们可以把0.23+0.34=m，0.23+0.34+0.45=n，则1+0.23+0.34=m+1，1+0.23+0.34+0.45=n+1。这样用字母代替数，再用乘法分配律可以使计算简便。原式=(1+m)×n-m×(n+1) =n+m×n-m×n-m =n-m =(0.23+0.34+0.45)-(0.23+0.34) =0.45 用字母代替数，是计算中的一种简便方法如; (123456+234561+345612+456123+561234+612345)÷7 括号里的六个加数都是由1?6这六个数字组成，换句话说，这六个数的每一位也分别是1?6，因此，每一位的数字之和都是21。所以括号里是21个1，21个10，21个100，21个1000，21个10000，21个100000组成，它们的和可以算成21×111111。所以原式等于21×111111÷7。 (123456+234561+345612+456123+561234+612345)÷7 =111111×(1+2+3+4+5+6)÷7 =111111×21÷7 =111111×3 =333333 这道题，其实是一种分类的思想，因为这六个数的个位之和、十位之和、百位之和…都是21；这样我们在计算的时候，可以把括号里的六个数和算成是111111个（1+2+3+4+5+6），然后再计算后面的。请大家思考：如果是这种形式8个数的和怎样进行简算呢？它可以推广

4植物基因克隆的策略与方法

4植物基因克隆的策略与方法基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该

常用的巧算和速算方法

常用的巧算和速算方法【顺逆相加】用“顺逆相加”算式可求出若干个连续数的和。例如著名的大数学家高斯（德国）小时候就做过的“百数求和”题，可以计算为所以，1＋2＋3＋4＋……＋99＋100 =101×100÷2 =5050。又如，计算“3+5+7+………＋97+99=？”，可以计算为所以，3+5＋7＋……＋97+99=（99＋3）×49÷2= 2499。这种算法的思路，见于书籍中最早的是我国古代的《张丘建算经》。张丘建利用这一思路巧妙地解答了“有女不善织”这一名题： “今有女子不善织，日减功，迟。初日织五尺，末日织一尺，今三十日织讫。问织几何？” 题目的意思是：有位妇女不善于织布，她每天织的布都比上一天减少一些，并且减少的数量都相等。她第一天织了5尺布，最后一天织了1尺，一共织了30天。问她一共织了多少布？张丘建在《算经》上给出的解法是： “并初末日织尺数，半之，余以乘织讫日数，即得。”“答曰：二匹一丈”。这一解法，用现代的算式表达，就是

1匹=4丈，1丈=10尺， 90尺=9丈=2匹1丈。（答略）张丘建这一解法的思路，据推测为：如果把这妇女从第一天直到第30天所织的布都加起来，算式就是 5＋…………＋1 在这一算式中，每一个往后加的加数，都会比它前一个紧挨着它的加数，要递减一个相同的数，而这一递减的数不会是个整数。若把这个式子反过来，则算式便是 1+………………＋5 此时，每一个往后的加数，就都会比它前一个紧挨着它的加数，要递增一个相同的数。同样，这一递增的相同的数，也不是一个整数。假若把上面这两个式子相加，并在相加时，利用“对应的数相加和会相等”这一特点，那么，就会出现下面的式子：所以，加得的结果是6×30=180（尺）但这妇女用30天织的布没有180尺，而只有180尺布的一半。所以，这妇女30天织的布是 180÷2=90（尺）可见，这种解法的确是简单、巧妙和饶有趣味的。

小学数学中的几种巧算

小学数学中的几种巧算一、十几乘十几的巧算口诀：头乘头是高位积，尾加尾是中积，尾乘尾是末尾的积。最后再排列，遇到满十的向前位进一就是了。例如：12×13=156方法：头乘头1×1=1；尾相加2+3=5；尾相乘2×3=6。最后再排列起来就是156。 15×17=255方法：头乘头1×1=1；尾相加5+7=12；尾相乘5×7=35，最后排列时，高位积本是1，要加进上来的中位积12中的1，就是2了；中位积本是2，加尾积进上来的3就是5了；末尾积就是5。就是255。说明：这种巧算只限于十几乘十几二、多位数与11相乘的巧算例如：36×11=396方法：首积照着写3，中积是3+6=9，尾积照着写6就是了。遇到要进位的同上向前一位进一就是了。 2476×11=3236方法：首积本是2，但后面的4+7=11，要向前一位进1，首积就成了2；中间依次写是4+7=11，个位是1本应该写1，可后面的7+6=13又向前一位进1，所以就写2，再写3；尾积就是原来数中的尾数6了。说明：这种方法掌握好了，可以大大的提高运算速度，同样像乘22，33，88等一系列的乘法都可以运用此法，因为22可以分解为11×2、33可以分解为11×3…… 三、首数相同，尾数之和为十的两位数乘两位数的巧算口诀例如：26×24=624方法：首数2+1=3，3×2=6；6×4=24；排列起来就是624。 85×85=7225方法：首数8+1=9，9×8=72；5×5=25；排列起来就是7225。说明：这种方法只限于首数相同，尾数互补（相加为10）的两位数乘两位数。当然也能灵活的运用的，如42×例如：34×74=2516方法：3×7+4=25这前积；4×4=16为后积，相连就是2516。 57×57=3249方法：5×5+7=32是前积；7×7=49是后积，相连就是3249。

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点：标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

几种数学计算方法的比较

有限元法，有限差分法和有限体积法的区别有限差分方法(FDM)是计算机数值模拟最早采用的方法，至今仍被广泛运用。该方法将求解域划分为差分网格，用有限个网格节点代替连续的求解域。有限差分法以Taylor级数展开等方法，把控制方程中的导数用网格节点上的函数值的差商代替进行离散，从而建立以网格节点上的值为未知数的代数方程组。该方法是一种直接将微分问题变为代数问题的近似数值解法，数学概念直观，表达简单，是发展较早且比较成熟的数值方法。对于有限差分格式，从格式的精度来划分，有一阶格式、二阶格式和高阶格式。从差分的空间形式来考虑，可分为中心格式和逆风格式。考虑时间因子的影响，差分格式还可以分为显格式、隐格式、显隐交替格式等。目前常见的差分格式，主要是上述几种形式的组合，不同的组合构成不同的差分格式。差分方法主要适用于有结构网格，网格的步长一般根据实际地形的情况和柯朗稳定条件来决定。构造差分的方法有多种形式，目前主要采用的是泰勒级数展开方法。其基本的差分表达式主要有三种形式：一阶向前差分、一阶向后差分、一阶中心差分和二阶中心差分等，其中前两种格式为一阶计算精度，后两种格式为二阶计算精度。通过对时间和空间这几种不同差分格式的组合，可以组合成不同的差分计算格式。有限元方法的基础是变分原理和加权余量法，其基本求解思想是把计算域划分为有限个互不重叠的单元，在每个单元内，选择一些合适的节点作为求解函数的插值点，将微分方程中的变量改写成由各变量或其导数的节点值与所选用的插值函数组成的线性表达式，借助于变分原理或加权余量法，将微分方程离散求解。采用不同的权函数和插值函数形式，便构成不同的有限元方法。有限元方法最早应用于结构力学，后来随着计算机的发展慢慢用于流体力学的数值模拟。在有限元方法中，把计算域离散剖分为有限个互不重叠且相互连接的单元，在每个单元内选择基函数，用单元基函数的线形组合来逼近单元中的真解，整个计算域上总体的基函数可以看为由每个单元基函数组成的，则整个计算域内的解可以看作是由所有单元上的近似解构成。在河道数值模拟中，常见的有限元计算方法是由变分法和加权余量法发展而来的里兹法和伽辽金法、最小二乘法等。根据所采用的权函数和插值函数的不同，有限元方法也分为多种计算格式。从权函数的选择来说，有配置法、矩量法、最小二乘法和伽辽金法，从计算单元网格的形状来划分，有三角形网格、四边形网格和多边形网格，从插值函数的精度来划分，又分为线性插值函数和高次插值函数等。不同的组合同样构成不同的有限元计算格式。对于权函数，伽辽金(Galerkin)法是将权函数取为逼近函数中的基函数；最小二乘法是令权函数等于余量本身，而内积的极小值则为对代求系数的平方误差最小；在配置法中，先在计算域内选取N个配置点。令近似解在选定的N个配置点上严格满足微分方程，即在配置点上令方程余量为0。插值函数一般由不同次幂的多项式组成，但也有采用三角函数或指数函数组成的乘积表示，但最常用的多项式插值函数。有限元插值函数分为两大类，一类只要求插值多项式本身在插值点取已知值，称为拉格朗日(Lagrange)多项式插值；另一种不仅要求插值多项式本身，还要求它的导数值在插值点取已知值，称为哈密特(Hermite)多项式插值。单元坐标有笛卡尔直角坐标系和无因次自然坐标，有对称和不对称等。常采用的无因次坐标是一种局部坐标系，它的定义取决于单元的几何形状，一维看作长度比，二维看作面积比，三维看作体积比。在二维有限元中，三角形单元应用的最早，近来四边形等参元的应用也越来越广。对于二维三角形和四边形电源单元，常采用的插值函数为有Lagrange插值直角坐标系中的线性插值函数及二阶或更高阶插值函数、面积坐标系中的线性插值函数、二阶或更高阶插值函数等。对于有限元方法，其基本思路和解题步骤可归纳为 (1)建立积分方程，根据变分原理或方程余量与权函数正交化原理，建立与微分方程初边值

六年级奥数速算、巧算方法及习题(推荐)

六年级奥数速算、巧算方法及习题姓名成绩一、认真思考，对号入座：（共30分）（1）一个圆的周长是6.28米，半径是（1米）。（2）一块周长是24分米的正方形铁板，剪下一个最大的圆，圆的面积是（28.26平方分米）。（3）一项工程，甲单独做要6小时完成，乙单独做要9小时完成。甲、乙合做2小时，完成了这项工程的（5/9），余下的由甲单独做，还要（8/3）小时完成。（4）以“万”为单位，准确数5万与近似数5万比较最多相差（0.5万）。（5）在推导圆的面积公式时，将圆等分成若干份，拼成一个近似的长方形，已知长方形的长比宽多6.42厘米，圆的面积是（28.26）平方厘米。（6）已知：a ×23 ＝b ×135 ＝c ÷23 ，且a 、b 、c 都不等于0，则a 、b 、c 中最小的数是（b ）。（7）甲是乙的15 ，乙是丙的15 ，则甲是丙的（1/25）。（8）六年级共有学生180人，选出男生的 131和5名女生参加数学比赛，剩下的男女人数相等。六年级有男生（91）人。（9）今年王萍的年龄是妈妈的3 1,二年前母子年龄相差24岁,四年后小萍的年龄是(16)岁。（10）六(1)班男生的一半和女生的 41共16人,女生的一半和男生的4 1共14人,这个班(40)人。（11）把一个最简分数的分母缩小到原来的1/3，分子扩大到原来的3倍，这个分数的值15/2，这个最简分数是（5/6）。（12）一个真分数，分子和分母的和是33，如分子减2，分母增加4，约简后是2/3，原分数是（16/17）。

（13）一件工作，甲做3天，乙做5天可完成1/2；甲做5天，乙做3天可完成1/3。那么，甲乙合做（9.6）天可完成。（14）把20克药粉放入180克水中，药粉占药水的（1/10）。（15）一桶水连桶共重1734 千克,把水倒出13 后,重1214 千克,空桶重（5/4）千克。二、看清题目，巧思妙算：（共27分）（1）计算下列各题 [28÷[7.8]×5] [7×[9.3]－2.3] [13.8÷[313 ]×12] =20 =60 =55 （2）3000以内有多少个数能被11整除？ [3000/11]=272 （3）有13个自然数，它们的平均值精确到小数点后一位数是18.6，那么精确到小数点后三位数是多少？ 18.55×13?13个自然数的和?18.64×13 241.15?13个自然数的和?242.32 242÷13≈18.615 （4）用最简便的方法计算。 138 7131287÷+? 6.63×45+4.37÷145 -45 =7/8 =450 (435 ×3.62+4.6×61350 )÷23 (12 +1112 )÷219 ÷(2-0.25) =4.6×9.88÷23 =19/12×9/19×7/4

整个基因克隆实验流程(完整)

一、组织总RNA的提取相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。（2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。

常用巧算和速算的方法

常用的巧算和速算的方法 1、顺逆相加 1+ 2 + 3+ 4+ 5+……+100 +100+99+ 98+ 97+ 96+……+1 101+ 101+101+101+101+……+101 101×100÷2 =5050 举一反三 3+5+7+……+97+99= 2、分组计算 4.75-9.64+8.25-1.36=_____. 3.17-2.74+ 4.7+ 5.29-0.26+ 6.3=_____ 3、乘法分配律与结合律 (5.25+0.125+5.75)?8=_____. 34.5?8.23-34.5+2.77?34.5= 19.98?37-199.8?1.9+1998?0.82=_____. 常用的整十整百整千 :_________________________________________________ 4、由小推大计算“100×100”的方阵的和 1 2 3 4 5 6 (100) 2 3 4 5 6 7 (101) 3 4 5 6 7 8 (102) 4 5 6 7 8 9 (103) 5 6 7 8 9 10 (104) 6 7 8 9 10 11 (105) ……………………… 100 101 102 103 104 105 (199) 先化大为小计算“5?5”的方阵 1 2 3 4 5 2 3 4 5 6 3 4 5 6 7

4 5 6 7 8 5 6 7 8 9 对角线上五个5之和为25 ，五个斜行每个斜行数之和都为25，所以“5?5”方阵和为25×5=125 即 5?5×5=53=125 所以，“100×100”的方阵和为1003=1000 000 5、凑整方法计算13.5?9.9+6.5?10.1=_____. 1.5×105= 104× 2.5= 2.5×32×12.5= 举一反三计算 25×12 = 125×72 = 17×32-17×22= 3200÷4÷25 = 6、整体思想计算 32.14+64.28?0.5378?0.25+0.5378?64.28?0.75-8?64.28?0.125?0.5378. 原式=32.14+64.28?0.5378?(0.25+0.75-8?0.125) =32.14+64.28?0.5378?0 =32.14 举一反三 (1) 计算（2+3.15+5.87）×(3.15+5.87+7.32)-(2+3.15+5.87+7.32) ×(3.15+5.87) 的值 7、拆数加减 12 +16 + 112 +120 + 1 30 + 142 + 156 + 172 + 1 90 = 11×2 + 1 2×3 + 13×4 + 1 4×5 + 1 5×6 + 1 6×7 + 17×8 + 18×9+ 19×10 =（1-1 2）+（1 2?1 3）+(13?14)+(1 4?1 5)+(1 5?1 6)+(1 6?1 7)+(1 7?1 8)+ (1 8?1 9)+（1 9?1 10）

拟南芥基因克隆的策略与途径

拟南芥基因克隆的策略与途径拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。

常用的巧算和速算方法[1]

常用的巧算和速算方法[1].txt不要为旧的悲伤而浪费新的眼泪！现在干什么事都要有经验的，除了老婆。没有100分的另一半，只有50分的两个人。常用的巧算和速算方法【顺逆相加】用“顺逆相加”算式可求出若干个连续数的和。例如著名的大数学家高斯（德国）小时候就做过的“百数求和”题，可以计算为所以，1＋2＋3＋4＋……＋99＋100 =101×100÷2 =5050。又如，计算“3+5+7+………＋97+99=”，可以计算为 \ 所以，3+5＋7＋……＋97+99=（99＋3）×49÷2= 2499。这种算法的思路，见于书籍中最早的是我国古代的《张丘建算经》。张丘建利用这一思路巧妙地解答了“有女不善织”这一名题： “今有女子不善织，日减功，迟。初日织五尺，末日织一尺，今三十日织讫。问织几何” 题目的意思是：有位妇女不善于织布，她每天织的布都比上一天减少一些，并且减少的数量都相等。她第一天织了5尺布，最后一天织了1尺，一共织了 30天。问她一共织了多少布张丘建在《算经》上给出的解法是： } “并初末日织尺数，半之，余以乘织讫日数，即得。”“答曰：二匹一丈”。这一解法，用现代的算式表达，就是

1匹=4丈，1丈=10尺， 90尺=9丈=2匹1丈。（答略）张丘建这一解法的思路，据推测为：如果把这妇女从第一天直到第30天所织的布都加起来，算式就是 5＋…………＋1 在这一算式中，每一个往后加的加数，都会比它前一个紧挨着它的加数，要> 递减一个相同的数，而这一递减的数不会是个整数。若把这个式子反过来，则算式便是 1+………………＋5 此时，每一个往后的加数，就都会比它前一个紧挨着它的加数，要递增一个相同的数。同样，这一递增的相同的数，也不是一个整数。假若把上面这两个式子相加，并在相加时，利用“对应的数相加和会相等”这一特点，那么，就会出现下面的式子： / 所以，加得的结果是6×30=180（尺）但这妇女用30天织的布没有180尺，而只有180尺布的一半。所以，这妇女30天织的布是 180÷2=90（尺）可见，这种解法的确是简单、巧妙和饶有趣味的。

奥数速算巧算方法及习题

速算与巧算 1、凑整：43+88+57 2、带符号搬家：43+88-33 3、变加为乘： 8+8+8+8+8+8+8+7 4、加减抵消： 92-16+23-23+16 5、减法巧算： 100-36-24，88-（28+15） 6、找基准数： 52+50+49+46 7、分组： 90-89+88-87+86-85+84-83 8、等差数列（高斯公式）： 1+2+3+……+998+999+1000 单数项的等差数列： 3+5+7+9+11 = 7×5 9、金字塔数列： 1+2+3+……+98+99+100+99+98+……+3+2+1 速算第一步：观察！（是否能用公式，数字有什么特点，符号有什么特点，是否有别的简便方法……）速算思想： 1、“整”比“散”好！（100+200 比 156+288好算） 2、“小”比“大”好！（1+2 比 1257+3658好算）掌握理论：（理论对于三年级的孩子来说比较晦涩，通过简单的例子让他们记忆深刻，会用就可以了） 1、加法交换律：1+2 = 2+1 2、加法结合律：（1+2）+3 = 1+（2+3） 3、带符号搬家：加减法中数字就像逛超市，每人推着自己的小车，去哪儿都推着（即符号在前面） 43+88-33 = 43-33+88 = 88+43-33 5、减括号：5+（3-2）= 5+3-2， 5-（3+2）=5-3-2=5-（3+2 一、分组凑整法例：（1350+249+468）+（251+332+1650） =1350+249+468+251+332+1650 =（1350+1650）+（249+251）+（468+332） =3000+500+800 =4300 894-89-111-95-105-94 =（894-94）-（89+111）-（95+105） =800-200-200 =400 567+231-267+269 =（567-267）+（231+269） =300+500 =800

基因克隆的几种常见方法

基因克隆得几种常见方法基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为; （2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆得基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物得特异性。另外,在基因克隆之后，如还要进一步做表达研究，所使用得PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶，而采用其她有自我检测（reading proｏf)功能得酶,如pfｕ。这样可以避免由于扩增过程中出现得点突变或终止密码子而导致整个研究结论得错误。２根据已知探针克隆基因这也就是基因克隆得一种较直接得方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理得基因组DNＡ杂交,最后将所识别得片段从胶中切下来，克隆到特定得载体（质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中得拷贝数。

小学四年级实用小学巧算和速算方法

第一讲速算与巧算（一）一、加法中的巧算 1.什么叫“补数”？两个数相加，若能恰好凑成整十、整百、整千、整万…，就把其中的一个数叫做另一个数的“补数”。如：1+9=10，3+7=10， 2+8=10，4+6=10， 5+5=10。又如：11+89=100，33＋67=100， 22+78=100，44+56=100， 55+45=100，在上面算式中，1叫9的“补数”；89叫11的“补数”，11也叫89的“补数”.也就是说两个数互为“补数”。对于一个较大的数，如何能很快地算出它的“补数”来呢？一般来说，可以这样“凑”数：从最高位凑起，使各位数字相加得9，到最后个位数字相加得10。如：87655→12345，46802→53198， 87362→12638，… 下面讲利用“补数”巧算加法，通常称为“凑整法”。 2.互补数先加。例1巧算下面各题： ①36+87+64②99+136＋101 ③ 1361＋972＋639＋28 解：①式=（36＋64）＋87 =100＋87=187 ②式=（99＋101）＋136 =200+136=336

③式=（1361＋639）＋（972＋28） =2000+1000=3000 3.拆出补数来先加。例2 ①188＋873 ②548＋996 ③9898＋203 解：①式=（188+12）+（873-12）（熟练之后，此步可略）＝200+861=1061 ②式=（548-4）＋（996＋4） =544+1000=1544 ③式=（9898＋102）＋（203-102） =10000+101=10101 4.竖式运算中互补数先加。如：二、减法中的巧算 1.把几个互为“补数”的减数先加起来，再从被减数中减去。例3① 300-73-27 ② 1000-90-80-20-10 解：①式= 300-（73＋ 27）＝300-100=200 ②式=1000-（90＋80＋20＋10）＝1000-200＝800 2.先减去那些与被减数有相同尾数的减数。例4① 4723-（723＋189） ② 2356-159-256 解：①式=4723-723-189