发酵法生产紫杉醇的工艺研究
发酵法生产紫杉醇的工艺研究
(孙春艳 S2009134 )
一、项目立项依据（立项的必要性及需求分析）
紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)是从红豆杉属植物树皮中提取分离出来的一种次生代谢物，是一种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一。由于其具有显著抗癌效果，现已成为临床上治疗肿瘤的重要药物。紫杉醇的活性就表现在两个方面：1.对于迅速分裂的肿瘤细胞，紫杉醇“冻结”有丝分裂纺锤体，从而使肿瘤细胞停止在G2期和M期，直至死亡。2.紫杉醇也作用于巨噬细胞上的肿瘤坏死因子(TNF)受体，促使释放白细胞介素(IL)-1、TNF-2、IL-6、干扰素(IFN)-1、IFN-2对肿瘤细胞起杀伤或抑制肿瘤细胞迁移作用。
紫杉醇在临床上的研究既有抗癌方面的作用又有治疗非癌症方面的作用。在癌症方面，对晚期卵巢癌、转移性乳腺癌、食道癌、肺癌、头颈部癌和鳞状细胞癌均有明显疗效。在非癌症方面，对类风湿性关节炎、抗疟作用、多囊性肾病、卡波海里是肉瘤有良好的治疗及抑制作用。
随着生活水平的提高，环境污染日益加剧，给人类健康造成了危害，同时人类癌症的发生随之日益加剧，所以人们对紫杉醇的需求也随之增加。
紫杉醇在Taxus属植物树皮中含量仅为0.01%，每提取1公斤要砍伐1000-2000棵树的树皮。据估测，紫杉醇正式应用于临床后，每年约需200公斤以上，按现在的提取得率0.03%计算，每年要收集700吨树皮来提取。即使全部天然资源采伐，也只能满足短期需要，并造成对森林和人类生存环境以及生物多样性不可弥补的损失，因此紫杉醇的原料保障就成为该药能否成功走向市场的的关键。但因资源匮乏，单纯从含量甚微的天然红豆杉植物中提取紫杉醇无法满足临床需求，故紫杉醇的药源问题已引起人们的极大关注。
发酵法生产紫杉醇优点很多，既能保护生态环境，又能快速的生产出所需要的药品，是值得研究应用的。
针对紫杉醇的需求量的增加，药源少的问题，运用发酵的方法生产紫杉醇，降低它的价格，为广大人民所用，就成了迫在眉睫的任务。
二、项目目标及主要任务
抗癌新秀紫杉醇自投放市场后，其市场销售额每年以两位数增长并高居抗肿瘤药之首，1996年紫杉醇的全球销售额已达8亿美元（其中美国本土为5亿美元）。1998已超过12亿美元/年。合成的紫杉醇销售额大约在9000万美元。目前已有50多个国家已批准销售合成紫杉醇。据美国国家癌症研究所（NCI）预测，在今后10-15年内紫杉醇将成为抗癌首选药物之一，经济效益可观。
本项目的目标及任务是利用发酵方法大量的生产紫杉醇，同时把科技成果推广开来。
三、国内外现状、发展趋势及工作基础
紫杉醇最早是Wani等于1971年从短枝红豆杉(Taxusbreviifolia) 树皮中分离得到的。随后，Schiff 等证实紫杉醇具有独特的抗癌机制。
由于红豆杉系珍稀植物，而树皮中的紫杉醇含量很低，靠树皮提取紫杉醇不能满足需求，并且严重地破坏自然资源，危及生态平衡。为了解决药源紧缺状况，长期以来科学家们为解决这一巨大供求矛盾做出了很大的努力，包括筛选高产红豆杉栽培品种、化学合成、基因工程、细胞培养、真菌发酵、寻找紫杉醇类似物等，其中对紫杉醇生源途径的研究处于核心地位。
目前紫杉醇的药源途径主要有：（1）植株栽培法即通过杂交的方法：获得生长周期短、
紫杉醇含量高的红豆杉新品种，并与直接提取法相结合来分离提取紫杉醇，国内外都建立了红豆杉种植园，紫杉醇的含量也不低于野生植株，取得了一定的成效。但受土壤、气侯、季节等的影响，难以大面积堆广。（2）全合成法：紫杉醇结构复杂，母核有9个手性中心，侧链有2个手性中心，因此应有2048个非对映异构体，它的合成过程复杂，虽然Nincolaou等于1994运用逆合成分析法的战略全合成了紫杉醇，但是需要有22~25步，难度较大，要真正用于工业生产紫杉醇还有一定的距离。（3）半合成法：利用在植物中含量较大的紫杉醇杉醇前体物化学转化成紫杉醇。1988年Dents从欧洲红豆杉的针叶中得到含量为0.1%的紫杉醇前体化合物：l0-去乙酰白卡亭-Ⅲ，以此为原料半合成了紫杉醇以及同系物taxotere，后者的优点在于有效好的水溶性(从而提高了生物利用度且给药时间大为缩短)，也有广泛的体外抗癌活性。机理与紫杉醇类似。针叶资源丰富，再生能力强，半合成工艺实验室己趋于成熟，因此半合成被认为是扩大紫衫醇来源的有效途径，这是目前市场上紫杉醇类物质的主要来源。但这种方法仍然摆脱不了对红豆杉树木原料的依赖。（4）真菌培养法：从红豆杉的树皮中分离出能产生紫杉醇的内生真菌，由于真菌生长速度快，来源广，菌种选育简单，可通过发酵大规模生产。因此通过真菌发酵生产紫杉醇的前景是十分可观的。目前，真菌培养液中只能获得纳克培养，离产业化生产还很远[13]。（5）细胞培养：根据细胞全能化的观点，通过细胞培养方式可大量生产紫杉醇。细胞培养方式速度快，培养条件易于优化，培养过程易于人工控制，不受时间、地域等因素的限制。紫杉醇的工业生产受到了原料和技术两方面的制约，短期内难以突破。
最早Stierle 和Strobel 等在短叶红豆杉( T. brevifolia)的枝条上分离到一种内生真菌，能够产生紫杉醇，定名为安德列亚霉( Taxomyces andreanae)。当时这一发现对紫杉醇药源开发是一个重大的突破，为开发紫杉醇来源提供了一条新的途径。此后，各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作，陆续从西藏红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉、中国红豆杉中分离到产紫杉醇的内生真菌，其宿主植物几乎涉及红豆杉属的各个种。在红豆杉以外的树种中，研究人员也分离到了可产紫杉醇的内生真菌。Li 等从秃柏( Taxodium distichum) 的树皮、韧皮部和木质部中都分离到产紫杉醇的内生真菌Pestalotiopsis microspora 。Strobel GA 等从一种松树(Wollemia nobilis) 分离到产紫杉醇内生真菌Pestalotiopsis guepini 。这说明产紫杉醇的内生真菌不仅存在于红豆杉属植物中，在一些非红豆杉属植物中也存在，他们的研究进一步扩大了产紫杉醇内生真菌的范围。我国的学者在分离产紫杉醇内生真菌的研究中也取得了可喜的进展。1994 年邱德友等从云南红豆杉( T.yunnanensis) 的树皮中分离到80 多株真菌，其中一株可产紫杉醇。1993 年周东坡领导的课题组从百年以上的东北红豆杉( T. cuspidata) 的枝条与树皮中分离到3 株可产紫杉醇的内生真菌，发酵液中紫杉醇的产量可达51106μgPL～125170μgPL。其中2 株菌被鉴定为树状多节孢( Nodulisporiumsylviforme) ，为我国的新记录属、新记录种。张理珉等从云南红豆杉树皮分离出可产紫杉醇的内生真菌。马天有等从中国红豆杉( T. chinensis) 树皮中分离到一株内生真菌，能产紫杉醇，产量为14120μgPL。王伟等从南方红豆杉( T.chinensis var. mairei) 的主干和侧枝树皮及皮下部分分离得到91 株菌，其中6 株能分泌紫杉烷类化合物，经鉴定分别属于头孢霉属( Cephalosporium spp. ) 、轮柄梳霉属(Martensiomyces spp. ) 和无孢菌群( Mycelia sterlia) 。王建锋等也从南方红豆杉皮层中分离到一株瘤座孢菌，发酵产物分析表明可产紫杉醇，产量为18514μg PL。陈毅坚等报道从云南红豆杉( T. yunnanensis) 分离出的52 株内生真菌中，有19 株菌的发酵产物中有紫杉醇或紫杉烷类物质，分属于12 个属。胡凯等从南方红豆杉的树皮中分离得到的21 个内生真菌，发现有3 个菌株能够产生紫杉醇。到目前为止，人们已发现20 多种内生真菌可以产紫杉醇，其寄主也不仅限于红豆杉属植物，从秃柏、Wollemi 松及Torreyagrandifolia 等非红豆杉属植物中也分离到了可产紫杉醇的内生真菌。
与过去从红豆杉植物的树皮中提取紫杉醇相比，内生真菌生产紫杉醇具有更大的优势，真菌不仅能在简单的培养基上良好生长，产生大量的发酵产物，发酵周期短，还可以在生物反应器中人为控制各种参数，并可通过诱变育种等手段来提高菌种性能以提高紫杉醇产量，
所以大规模工业生产容易实现，其应用前景十分广阔；而且对于植物来源的天然药物的新生产途径的开发及濒危药用植物的保护具有十分重要的经济及生态效益，这样就为无限而有效地产生紫杉醇药物开辟了新的途径。
四、项目实施方案及实施计划
实施方案及实施办法：
1. 根据对产紫杉醇菌种的研究，从植物体内分离内生真菌，对菌种进行筛选，找到高效产紫杉醇的菌株。关键一步是对植物组织表面进行消毒，以控制表生真菌的生长，使内生真菌得以分离。目前常用次氯酸钠作为消毒剂，其分离方法是先用水冲洗植物材料，然后在75 %乙醇中浸泡60s 后，在4 %次氯酸钠水溶液浸泡0.5h ，然后在75 %酒精中再浸泡30s ，最后用无菌水冲洗。一般分离所用的培养基为1 %～2 % 麦芽浸膏琼脂MEA培养基。为了防止细菌污染可在培养基中加抗菌素，如链霉素、四环素等。一般20 ℃～25 ℃培养一个月左右。
2．紫杉醇的提取分离:真菌培养物首先要进行预处理，然后进行紫杉醇的提取。主要提取方法是用有机溶剂萃取。将培养物冷冻后用转速为10000rpm 组织捣碎机匀浆3min，用4 层纱布过滤，滤液中加入等体积的氯仿和甲醇混合液(10:1，V/V) ，充分振荡后静置8h～12h ，收集有机溶液相，并在45 ℃条件下减压蒸发，残留物溶于1mL 甲醇中作为样品溶液备用。
3.紫杉醇的纯化。金涛等探索了对紫杉醇产生菌发酵液有效脱色作用同时制备高纯度紫杉醇的树脂及层析条件。他采用了7 种树脂对紫杉醇产生菌发酵液进行脱色和提取，结果表明201 ×4 型树脂处理样品的效果最好，利用80 %的乙腈水溶液洗脱，紫杉醇的回收率达到了98.8 %。从而为提取紫杉醇提供了一种操作简单、回收率高、污染较低的树脂层析方法。
4．紫杉醇结构鉴定。采用质谱方法测定紫杉醇的结构。
5．紫杉醇含量测定。采用高效液相色谱法测定。其色谱条件：Waters 高效液相色谱系统，二极管阵列检测器；C18色谱柱，200mm ×416mm;柱温为室温；流动相为甲醇与水混合物(V 甲醇:V水= 60:40) ；波长228nm，流速110mLPmin ，注射体积10μL。
6．优化培养基及发酵条件，进行大量培养。
具体实施计划：
2010年9月—2010年11月筛选目的菌株
2010年12月—2011年4月紫杉醇的分离、纯化、结构鉴定及含量的测定
2011年5月—2011年10月优化培养基及发酵条件，进行大量培养。
可行性分析：
本实验室具有本项目研究所必须的仪器设备和其他试验条件。本研究所使用的大型仪器设备主要依托于山东省食品发酵研究设计院和山东省食品发酵重点实验室。所使用的分析仪器主要包括高效液相色谱、摇床、无菌培养箱、质谱仪等等。
五、技术支持
本项目主要依赖山东省食品发酵研究设计院各方面的大力支持，包括资金和设备支持。
第6章紫杉醇生产工艺
第六章紫杉醇的生产工艺 6.1 概述 6.1.1 紫杉醇类药物 1、紫杉醇 紫杉醇（Paclitaxel，Taxol?）的化学名称为5β,20-环氧-1β,2α,4α,7β,13α-五羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-10-乙酰基-13-[(2′R,3′S) -N-苯甲酰基-3′-苯基异丝氨酸酯] ，英文化学名称为13-[(2′R,3′S) -N-carboxyl-3′-phenylisoserine, N-benmethyl ester, 13-ester with 5β,20-epoxyl-1β,2α,4α,7β,13α-hexahydroxytax-11-en-9-one-4-acetate-2-benzoate,trihydrate。 紫杉醇具有复杂的化学结构，属三环二萜类化合物，整个分子由三个主环构成的二萜核和一个苯基异丝氨酸侧链组成（图6－1）。分子中有11个手性中心和多个取代基团。分子式为C47H51NO14，分子量为853.92，元素百分比为C：66.41，H：6.02，N：1.64，O：26.23。紫杉醇难溶于水，易溶于甲醇、二氯甲烷和乙氰等有机溶剂。 图6－1 紫杉醇的化学结构 2、多烯紫杉醇 多烯紫杉醇（多西他赛，Docetaxel，Taxotere?，图6－2）是在开展紫杉醇半合成研究过程中发现的一种紫杉醇类似物，两者仅在母环10位和侧链上3'位上的取代基略有不同。多烯紫杉醇的化学名称是5β,20-环氧-1β,2α,4α,7β,10β,13α-六羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[(2′R,3′S) -N-叔丁氧羰基-3′-苯基异丝氨酸酯]·三水合物，英文化学名称为-13-[(2′R,3′S) -N-carboxyl-3′-phenylisoserine, N-tertbutyl ester, 13-ester with 5β,20-epoxyl-1β,2α,4α,7β,10β,13α-hexahydroxytax-11-en-9-one-4-acetate-2-benzoate,trihydrate 。分子式为C43H53NO14·3H2O，相对分子质量为861.9。 1985年，法国罗纳普朗克乐安公司（Rhone-Poulenc Rorer）公司和法国国家自然科学研究中心（CNRS）以10-DAB作为母环骨架，通过半合成方法成功地合成出多烯紫杉醇，目
紫杉醇提炼步骤
紫杉醇规模生产工艺及方案（1500吨/年规模） 一、项目规模生产工艺方案 1、紫杉醇概述紫杉醇具有复杂的化学结构，母核部分是一个复杂的四环体系，有许多的功能基团和立体化学特征，化学名称为：5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯，分子由3个主环构成二萜核，上连1个苯异丝氨酸侧链，分子中有11个手性中心和多个取代基团，分子式为C47H51NO14，相对分子质量853.92，元素百分比（%）C：66.41，H:6.02，N:1.64，O:26.23。紫杉醇结构式为：紫杉醇为白色结晶性粉末，无臭，无味，在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。甲醇制3mg/ml 的溶液，比旋度为-48℃~56℃。甲醇制15μg/ml的溶液，在227nm处有最大紫外吸收，10mg紫杉醇加甲醇溶液10ml溶解后应澄清无色。紫杉醇注射剂是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，可能是使细胞中止于对放疗每咸的G2和M期，适用于卵巢癌和乳腺癌及NSCLC的一线的二线治疗。用于头颈癌、食管癌、精原细胞瘤，复发非何金氏淋巴瘤等治疗，静脉给予紫杉醇注射剂，药物血浆浓度呈双曲线，蛋白结合率89%~98%，主要在肝脏代谢，随胆汗进入肠道，经粪便排出体外（﹥90%），经肾清除只占总清除的1%~8%。 红豆杉浸膏
1.1操作过程： （1）浸提：将原料投入提取罐内，干红豆杉每罐填装约1.2吨的原料，加入约4吨的甲醇浸提，温度为45±5℃，每遍循环浸提大于4小时，浸提完成后，将浸提液排入浸提液储罐中，进行蒸汽吹渣，温度控制在85±5℃,压力小于等0.2Mpa，回收残余的甲醇溶液，吹渣结束后，将废渣移到废料堆场集中处理。 （2）浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中。（3）萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯（按物料：醋酸乙酯=1：1），萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。 （4）干燥：将浓缩后的醋酸乙酯萃取液抽入蒸发罐内，罐内温度不超过45±5℃，真空度为-0.06±00.1Mpa，浸膏置真空干燥箱内干燥，干燥完成后，取出产品，凉干，敲碎，经检验合格后即成为紫杉醇浸膏，用铁桶封装，入库阴凉保存。 1.2紫杉醇粗制工艺步骤 1.2.1操作过程 （1）配料、装柱：将紫杉醇浸膏约100kg按物料、重量比1：1的比例加入100-200目的硅胶搅拌均匀，真空干燥，装柱。 （2）一次层析、浓缩：配制不同极性的淋洗液（乙酸乙酯：正已烷
紫杉醇提取工艺原理及操作技术
紫杉醇提取工艺原理及操作技术 紫杉醇为白色结晶性粉末，无臭，无味，在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。紫杉醇常规的提取工艺各个生产环节需控制在低温下操作，保证产品活性。各个工时段应尽快完成，可选水浴加热提取罐(含溶剂回收装置)，旋转真空浓缩机组(低温浓缩，1-2秒完成)，层析柱(精制分离)，板式真空干燥箱(低温干燥、速度快)。 紫杉醇提取操作过程 (1)浸提：将原料投入提取罐内，干红豆杉每罐填装约1.2吨的原料，加入约4吨的甲醇浸提，温度为45±5℃，每遍循环浸提大于4小时，浸提完成后，将浸提液排入浸提液储罐中，进行蒸汽吹渣，温度控制在85±5℃,压力小于等0.2Mpa，回收残余的甲醇溶液，吹渣结束后，将废渣移到废料堆场集中处理。 (2)浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中。 (3)萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯(按物料：醋酸乙酯=1：1)，萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在 45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。 (4)干燥：将浓缩后的醋酸乙酯萃取液抽入蒸发罐内，罐内温度不超过45±5℃，真空度为 -0.06±00.1Mpa，浸膏置真空干燥箱内干燥，干燥完成后，取出产品，凉干，敲碎，经检验合格后即成为紫杉醇浸膏，用铁桶封装，入库阴凉保存。 甲醇制3mg/ml的溶液，比旋度为-48℃~56℃。甲醇制15μg/ml的溶液，在227nm处有最大紫外吸收，10mg紫杉醇加甲醇溶液10ml溶解后应澄清无色。紫杉醇注射剂是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，可能是使细胞中止于对放疗每次的G2和M期，适用于卵巢癌和乳腺癌及NSCLC的一线的二线治疗。用于头颈癌、食管癌、精原细胞瘤，复发非何金氏淋巴瘤等治疗，静脉给予紫杉醇注射剂，药物血浆浓度呈双曲线，蛋白结合率89%~98%，主要在肝脏代谢，随胆汗进入肠道，经粪便排出体外(﹥90%)，经肾清除只占总清除的1%~8%。 莱特莱德膜分离技术有限公司致力于膜分离和脱盐浓缩技术以及冷冻浓缩分离技术推广与工艺设备开发。通过多年的努力，已具备丰富的工程经验，为客户提供从小试、中试、工业化设备的工艺设计到设备生产、安装调试等一系列服务，能够提供整体解决方案和交钥匙工程，并成功应用于冶金、环保、制药、化工、食品等领域，赢得了客户和业内的良好口碑。
紫杉醇的提取和性能
紫杉醇的提取与性能 姓名:高海艳 学号:51151300057 专业:种子植物分类学
紫杉醇的提取与性能 一、紫杉醇简介 紫杉醇(T axol)就是一种复杂的具有抗癌活性的二萜类生物碱[1](结构如图一所示),就是从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)与东北红豆杉(Taxus cuspidata)的树皮中提取出来的。具有抗肿瘤、抗白血病的显著作用,主要用于治疗卵巢癌与乳腺癌[2],被人们誉为“植物黄金”。 Vidensek[3]对东北红豆杉(Taxus cuspidata)幼苗以及成树的不同部位中的紫杉醇含量作了分析结果表明成树紫杉醇的含量高低依次为树皮>树叶>树根>树干>种子>心材,幼苗的紫杉醇含量高低依次则就是树叶>树根>嫩枝条>心材。另外,对于不同植物来源的组织培养细胞中的紫杉醇含量陈未名等[4]作了大量的研究,结果表明愈伤组织中的紫杉醇含量以云南红豆杉为最高其次为欧洲红豆杉,再次为红豆杉;而悬浮培养细胞中的紫杉醇含量从高到低依次为云南红豆杉、欧洲红豆杉、红豆杉。 二、紫杉醇提取工艺 1、从原植物体中提取紫杉醇[5]: 红豆杉枝叶、树皮、树枝的采集 原料的干燥及粉碎 有机溶剂提取:甲醇 除去浸膏 固—液萃取 液—液萃取 己烷沉淀
2、细胞培养高效提取紫杉醇[6]: 1 紫杉醇就是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物,在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌与部分头颈癌与肺癌的治疗[12]。 2、紫杉醇作用于癌症的机制: 1979年,美国爱因斯坦医学院的分子药理学家Horwitz 博士阐明了紫杉醇独特的抗肿瘤作用机制:紫杉醇可使微管蛋白与组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡,诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配、防止解聚,从而使微管稳定并抑制癌细胞的有丝分裂与防止诱导细胞凋亡,进而有效阻止癌细胞的增殖,起到抗癌作用(如下图所示)[7-11]。
紫杉醇的合成
苏州大学研究生考试答卷封面 考试科目: 有机合成考试得分 院别: 材料与化学化工学部专业: 分析化学 学生姓名: 饶海英学号: 20114209033 授课教师: 考试日期: 2012 年 1 月8 日 天然抗癌药物紫杉醇的合成进展 摘要:本文对多烯紫杉醇的合成的各种合成方法进行了综述。 关键词:多烯紫杉醇合成抗癌 多烯紫杉醇(daxotere) 商品名为多西她赛(Docetaxel) , 化学名为[ 2aR-( 2aα, 4β, 4aβ, 6β,9α, ( aR3, βS3) , 11α, 12α, 12aα, 12bα) ] -β- [ [ (1, 1 2二甲基乙氧基)羰基]氨基] -α-羟基苯丙酸[ 12b-乙酰氧-12 -苯甲酰氧-2a, 3, 4, 4a, 5, 6, 9,10, 11, 12, 12a, 12b -十二氢-4, 6, 11-三羟基-4a, 8,13, 13 -四甲基-5-氧代-7, 11-亚甲基-1H-环癸五烯并-[ 3, 4 ]苯并[ 1, 2-b ]氧杂丁环-9-基]酯,就是法国罗纳普朗克·乐安公司开发的半合成紫杉醇的衍生物,它对晚期乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、头颈部癌、胃癌等均有效。其作用机制就是通过与肿瘤细胞微管蛋白结合, 加强微管蛋白的聚合、抑制微管解聚,最终形成稳定的非功能性微管束, 从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂与增殖[1-3] 。 商业化生产的紫杉醇类抗癌药物大多采用半合成方法,这就是现阶段最具经济性与可操作性的合成方法。多烯紫杉醇的半合成方法就是利用从红豆杉属植物的针叶中提取的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ (10-DAB ) ,通过选择性保护部分羟基, 然后在10-DAB C13位的羟基上连接合成的手性侧链, 再去掉保护基团得到。其中以多烯紫杉醇C13位侧链的合成以及该侧链与选择性保护的母核10-DAB进行酯化反应最为重要[4-5] 。 紫杉醇的构效关系已经被众多学者所研究与总结。具有游离羟基的C13位侧链,C2与C4位的酯基,C4、C5位四元含氧环及紫杉烷的刚性环结构对抗癌活性都起着很重要的作用。 1988年,Potier等从欧洲紫杉(Taxus baccata)中分离得到10-去乙酰巴卡亭(Baccatin) Ⅲ( DAB),DAB 已被成功地用来半合成紫杉醇,并已工业化生产[6]。半
提取紫杉醇初分离工艺的研究
紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是当今一种重要的抗癌新药。早在1971年，Wani等 就从红豆杉树皮中发现并分离出了这种物质。由于它特异的临床抗癌疗效，1992年被美国FA D批准为治疗晚期乳腺癌的特效药而上市。然而，在实际药物生产中，紫杉醇的大规模制备仍 存在许多问题。首先，紫杉醇来源匮乏，其主要存在于红豆杉树皮和针叶中，其次，紫杉醇在植物中含量极低，大约为0.010%~0.013%，而紫杉醇与其它紫杉烷化合物在化学结构和极性 等方面又极为相似，要将它们完全分离困难很大。 关于紫杉醇提取分离方法，已有过不少的研究。其中以液-液萃取应用最为广泛，在文献 报道的每一种工艺中，几乎都采用过它。Willey等和Mattina等在测定样品中紫杉醇浓度时，选择了固相萃取作为HPLC分析的预处理。以分子间吸附为机理的硅胶柱层析，是制备紫杉醇 最常用的方法之一。1984年，Senilh等曾采用氧化铝柱层析处理红豆杉浸膏，但所报道的分 离效果不是太理想。1995年，Matysik等曾用制备薄层层析来少量获取紫杉醇。本研究的目的 ，在于寻找一条切实可行的工艺路线，最大程度地提高紫杉醇的回收率，以充分利用有限的红豆杉资源；采用一些高效、经济的提取分离方法，减少过程步骤，快速、简捷地提取出紫杉醇。 1 材料方法 1.1 材料 红豆杉树皮提取浸膏，云南张峰植物加工厂；紫杉醇对照品，纯度大于95%，Sigma；固 相萃取柱（C18填料，10ml），大连化学物理研究所；GF254硅胶和粗孔硅胶（100~140目），青岛海洋化工厂；层析氧化铝（200~300目），上海新诚精细化学品有限公司。 DU-7紫外/可见分光光度计及FL-750HPLC仪，Beckman公司；XZ-6A旋转蒸发器，北京科龙 仪器公司；常压层析系统，Pharmacia公司。 1.2 方法 1.2.1 液-液萃取称取红豆杉树皮浸膏于锥形瓶中，加CH2Cl2（浸膏CH2Cl2的重量比为 1：50），充分溶解，再加入与CH2Cl2等量的水，充分混合后静置分层，分液回收有机相，弃 水相。有机相再加水萃取，重复三次。将有机相中的CH2Cl2减压蒸出回收，所得固相物溶解 于甲醇中，用HPLC作定性定量分析。 1.2.2 固相萃取固相萃取过程包括四个步骤，即固定相活化、样品上柱、淋洗、样品的洗脱。全过程将速度稳定控制在5~8ml/min。固定相活化：取乙酸乙酯10ml加入柱中，抽空。 依资助加入甲醇10ml和0.01mol/L(pH5.0)的乙酸铵缓冲液10ml（乙酸铵水溶液），将液面维持在胶层上1~2mm。上样及淋洗：将样品溶于80%~90%的甲醇乙酸铵溶液中，取0.5ml加入柱中
有关紫杉醇生产的影响因素与对策
有关紫杉醇生产的影响因素与对策 紫杉醇(Taxol) 是从红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus) 植物树皮、针叶中分离出的一种四环二萜酰胺类化合物, 它能有效地治疗晚期卵巢癌, 乳腺癌和其它癌症, 被称为是过去几十年中发现的最好的抗癌药物。1992 年12月29日, 美国FDA 正式批准紫杉醇作为治疗晚期卵巢癌的新抗癌药物(商品名为Paclitaxel)。由于紫杉醇在植物体中的含量相当低,大约从3～6棵60～100年生大树的树皮中才能提取到1g 紫杉醇, 可治疗一个癌症患者。目前全球每年200kg紫杉醇的消耗量意味着要砍伐100万棵红豆杉大树, 随着紫杉醇应用范围的扩大, 其需求量必然会逐年增加, 而红豆杉树生长速度相当慢, 直径20cm的树需生长100年! 因此, 伐树生产紫杉醇的方法不仅会严重破坏该树的长期生存和分布, 也根本无法满足人们对紫 杉醇的需求。尖锐的供需矛盾在医学、化学和生物学领域中引起了一场非同寻常的广泛研究, 以增加这种化合物的来源。 目前生产紫杉醇的主要方法 紫杉醇的生产方法主要是提取分离和化学合成，提取分离的方法按来源不同又可分为三大类: 从植物中分离提取、从真菌中分离提取及从培养细胞中分离提取。 1.1 直接从红豆杉科植物中分离提取 紫杉醇含量与种、部位、生长年限、生长环境等因素有关。在所有红豆杉中短叶红豆杉中紫杉醇含量最高；从生长时间上看，生长时间越长的器官或组织紫杉醇含量越高；从生长环境上看，生长在阴处的树皮比暴露在日光下的高；就部位来看，一般树皮中紫杉醇含量较高，短叶红豆杉树皮中紫杉醇含量可达 0.069%。据估算，从2000~ 3 000棵稀有的紫杉树皮中只能提取1 kg紫杉醇，而对1例病人制备充足的药物需3~ 4棵百年的老红豆杉树。这要求人工栽培的红豆杉品种紫杉醇含量高、生长迅速。目前，曼地亚红豆杉能相对较好地满足这些要求，它是一个杂交品种，生长迅速3~ 5day后可收获两次枝叶，其针叶中紫杉醇含量为0.017% ~ 0.046%。因此，人工种植该品种生产紫杉醇的成本不会低，但是，选育优良品种提取紫杉醇无疑是一个有价值的研究方向。 1.2 直接从紫杉醇产生菌中提取 紫杉醇产生菌主要是一些红豆杉的内生真菌。真菌中最高紫杉醇含量为185.4 g/ L，可见，当前利用微生物发酵方法产生紫杉醇的量很低，难以达到工业化生产的要求。而且，真菌自身合成紫杉醇的途径还未见报道，自身是否存在紫杉醇的合成途径还需进一步研究探索。此生产方法的前景还不明朗。 1.3 化学合成法 化学合成是生产药物的一条重要途径，许多天然药物(如一些抗生素) 除了可从生物体内提取外，还可通过化学的方法合成。紫杉醇的药效被发现以来，其化学合成的方法一直受到重视并得到很多的研究探索。迄今为止，在生产上有价值的紫杉醇的全合成尚未取得成功。紫杉醇结构复杂，母核有9个手性中心，因此应有2 048个非对映异构体，紫杉醇的半合成是以天然来源的baccatin 或10-去乙酰baccatin为原料，通过13 位酯化得到紫杉醇或其它半合成衍生物。此法首先合成侧链, 然后把侧链接到baccatin或10-去乙酰baccatin 上去。紫杉醇的半合成法的问题主要在于：1) 合成原料在植物中含量不高，分离成本较高。2) 每一步反应得率低，而且有时会碰到选择性较差的问题。所以，无论是全合成还是半合成目前都取得了成功，但都难以应用于大规模的工业化生产。 1, 4 利用红豆杉细胞培养生产紫杉醇 大规模地培养微生物细胞实现了许多种抗生素的大量生产，极好地满足了病人对抗生素的需求，挽救了无数人的生命。抗生素是微生物的次生代谢产物，紫杉醇是植物细胞的次生代谢产物，能否通过大规模
紫杉醇的提取工艺设计研究方案
紫杉醇提取纯化方法的研究进展 紫杉醇是最早从红豆杉属植物中分离出来的三环二菇类化合物，是继阿霉素和顺铂之后最热点的抗癌新药。紫杉醇具有复杂的化学结构，分子由3个主环构成二菇核，分子中有11个手性中心和多个取代基团，母环部分是一个复杂的四 环体系，有许多功能基团和立体化学特征。分子式C 47H 51 NO 14 ，分子量853.92。 同位素示踪表明, 紫杉醇只结合到聚合的微管上, 不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能,特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。 紫杉醇属于有丝分裂抑制剂,它的独特机制在于可以诱导和促进微管蛋白 聚合,促进微管装配及阻止微管的生理解聚,由此抑制癌细胞纺锤体的形成,阻止 有丝分裂的完成,使其停留在G2期和M期直至死亡,从而起到抗癌的作用。迄今为止紫杉醇是唯一促进微管聚合的新型抗癌药。这一新的发现引起了各国医药界的极大兴趣。现在已有包括我国在内的十多个国家批准了紫杉醇类药物的正式生产。目前有关紫杉醇研究的几个主要问题是:紫杉醇的提取;紫杉醇的人工合成;紫杉醇的临床应用(水不溶性问题的解决);紫杉醇的构效关系;紫杉醇的抗癌机理。紫杉醇的抗癌机理 1971年,Wani等报道了紫杉醇在一些实验体系中具有抗癌活性。1978 年,Schiff等发现紫杉醇在极低的浓度下(0.25μM)可以完全抑制Hela细胞的分裂,而且在对细胞4小时的培养过程中,对DNA、RNA和蛋白质的合成没有明显影响。
紫杉醇的合成
苏州大学研究生考试答卷封面 考试科目：有机合成考试得分：________________院别：材料与化学化工学部专业：分析化学 学生姓名：饶海英学号： 033 授课教师： 考试日期： 2012 年 1 月 8 日
天然抗癌药物紫杉醇的合成进展 摘要：本文对多烯紫杉醇的合成的各种合成方法进行了综述。 关键词：多烯紫杉醇合成抗癌 多烯紫杉醇(daxotere) 商品名为多西他赛(Docetaxel) , 化学名为 [ 2aR-( 2aα, 4β, 4aβ, 6β,9α, ( aR3, βS3) , 11α, 12α, 12aα, 12bα) ] -β- [ [ (1, 1 2二甲基乙氧基)羰基]氨基] -α-羟基苯丙酸[ 12b-乙酰氧-12 -苯甲酰氧-2a, 3, 4, 4a, 5, 6, 9,10, 11, 12, 12a, 12b -十二氢-4, 6, 11-三羟基-4a, 8,13, 13 -四甲基-5-氧代-7, 11-亚甲基-1H-环癸五烯并-[ 3, 4 ]苯并[ 1, 2-b ]氧杂丁环-9-基]酯,是法国罗纳普朗克·乐安公司开发的半合成紫杉醇的衍生物,它对晚期乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、头颈部癌、胃癌等均有效。其作用机制是通过与肿瘤细胞微管蛋白结合, 加强微管蛋白的聚合、抑制微管解聚,最终形成稳定的非功能性微管束, 从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂和增殖[1-3] 。 商业化生产的紫杉醇类抗癌药物大多采用半合成方法,这是现阶段最具经济性和可操作性的合成方法。多烯紫杉醇的半合成方法是利用从红豆杉属植物的针叶中提取的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ (10-DAB ) ,通过选择性保护部分羟基, 然后在10-DAB C 13 位的羟基上连接合成的手性侧链, 再去掉保护基团得到。其中以多 烯紫杉醇C 13 位侧链的合成以及该侧链与选择性保护的母核10-DAB进行酯化反应最为重要[4-5] 。 紫杉醇的构效关系已经被众多学者所研究和总结。具有游离羟基的C 13 位侧 链，C 2和C 4 位的酯基，C 4 、C 5 位四元含氧环及紫杉烷的刚性环结构对抗癌活性都起 着很重要的作用。 1988年，Potier等从欧洲紫杉(Taxus baccata)中分离得到10-去乙酰巴卡亭(Baccatin) Ⅲ( DAB)，DAB 已被成功地用来半合成紫杉醇，并已工业化生产[6]。半合成紫杉醇被认为是除人工种植外，扩大紫杉醇来源的最有效途径。随着对紫杉醇类似物构效关系的深入研究，第一个紫杉醇类似物的半合成药物多烯紫杉醇 被开发成功。多烯紫杉醇C 13侧链中C 3 N上叔丁氧羰基取代了紫杉醇的苯羰基，其 体外对微管解聚的抑制率是紫杉醇的2倍，抗癌谱也宽于紫杉醇，水溶性高出紫
紫杉醇
第七章 7.4 紫杉醇的生产工艺 7.4.1 概述 紫杉醇（Paclitaxel，Taxol?，图1），最早是由美国化学家Wani 和Wall于1971年从太平洋红豆杉的树皮中提取到的一种具有抗肿瘤活性的物质。它具有独特的抗癌机制，其作用位点为有丝分裂和细胞周期中至关重要的微管蛋白。紫杉醇能促进微管蛋白聚合而形成稳定的微管，并抑制微管的解聚，从而抑制了细胞的有丝分裂，最终导致癌细胞的死亡。紫杉醇1992年12月被美国FDA批准用于治疗晚期卵巢癌。1994年，批准用于治疗转移性乳腺癌，1997年FDA批准使用紫杉醇治疗爱滋病关联的Kaposi's恶性肿瘤；1998年和1999年，FDA又分别批准半合成紫杉醇与顺铂联合使用作为治疗晚期卵巢癌和非小细胞肺癌的一线用药。紫杉醇是近几年国际公认的疗效确切的重要的抗肿瘤药物之一。 -五羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-10-乙酰基-13-a,13b,7a,4a,2b,20-环氧-1b紫杉醇具有复杂的化学结构，整个分子由三个主环构成的二萜核和一个苯基异丝氨酸侧链组成。分子中有11个手性中心和多个取代基团。分子式C47H51NO14，分子量853.92，元素百分比C：66.41，H：6.02，N：1.64，O：26.23。化学名：5 [(2′R,3′S) -N-苯甲酰基-3′-苯基异丝氨酸酯] 紫杉醇的来源最初以天然提取为主，主要是从由红豆杉属植物的树皮中分离得到。红豆杉植物是生长极为缓慢的乔木或灌木，其树皮中紫杉醇的含量平均为万分之一点五，从中提取紫杉醇的收率大约为万分之一，这样制取1 kg紫杉醇就需树皮10吨，这种生产紫杉醇的方法严重破坏资源和环境。目前，包括我国在内的许多国家都已经禁止或严格限制用这种方法来生产紫杉醇。为解决紫杉醇的大量供应问题，人们曾探索通过组织和细胞培养、化学合成等方法制取紫杉醇。其中，化学合成是人们首先想到的解决紫杉醇药源问题的一条途径。这里的化学合成又有全合成和半合成之分。 如前所述，紫杉醇的分子结构十分复杂，分子中有众多的功能基团和立体化学特征，如此复杂的结构堪称是对化学合成的一个挑战。1994年，紫杉醇的全合成在实验室获得成功[1，2]。到目前为止，文献报道的紫杉醇的全合成路线共有3条，即1994年由Holton和Nicolaou研究组几乎同时完成的2条路线以及1996年Danishefsky小组报道的路线。紫杉醇的全合成中，反应步骤多达20—25步，大量使用手性试剂，反应条件极难控制，制备成本昂贵，虽然具有重要的理论意义，但不适合大规模工业生产。 为了避免合成紫杉醇复杂的母环部分，人们探索了半合成的制备方法。研究发现，红豆杉植物中除紫杉醇外，还有大量母环结构与紫杉醇类似的化合物，其中，最重要的是巴卡亭
紫杉醇提取工艺优化研究
紫杉醇提取工艺优化研究 赵万年 S1315004 立体依据 紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是Wani等[1]于1971年首次从短叶红豆杉(Taxus Bravifolia Nutt.)中分离得到的一种复杂的次生代谢产物，属二萜类化合物。其抗癌机理独特[2]，活性广谱高效，是目前所发现的惟一一种具有促进微管双聚体装配成微管, 使微管稳定, 从而阻碍细胞分裂, 将癌细胞停止在G2晚期或M期，最终导致癌细胞死亡[3]，抑制肿瘤生长的作用。由于紫杉醇的作用机理独特、疗效显著，因此已用于转移性卵巢癌、乳腺癌等的治疗，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。 虽然现在开发了多种紫杉醇的制备方法，利用半合成、全合成、生物合成、真菌发酵、植物组织细胞培养等技术手段获得紫杉醇的研究工作也取得了较大的进展［4-6］，但是要实现这些技术的工艺扩大和工业放大生产还存在一些问题，而从树皮中提取紫杉醇的工艺已经成熟且工业化，因此目前从植物中直接提取分离仍是紫杉醇的主要制备方法。但是，紫杉醇在植物中的含量非常低(含量最高的红豆杉树皮也只有万分之几)[7]，且类似物多，具有热敏性，产物在中间过程中易于分解、变性，不同产地、不同季节的植物资源成分相差甚远，因此分离提取工作难度很大。 目前紫杉醇的提取纯化工艺有溶剂萃取法、固相萃取法、制备色谱法、膜分离法、超临界萃取法、离子交换法、键合物解离法、药理作用靶点法和化学反应法[8-10]。这些工艺各有优缺点，其中溶剂萃取法和制备色谱法是最简单、最常用的方法，也已经成功应用于工业生产，但仍需改进。本课题以乙醇为提取溶剂，探求从南方红豆杉树叶中浸取紫杉醇的最佳提取条件，旨在为南方红豆杉这一药用植物资源的开发与利用提供试验依据。 研究目标 采用乙醇浸提方法，考查粉碎度、乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间
从天然植物中提取紫杉醇原料的最新工艺
Patent No. U.S. 6,759,539 Assignee: Chaichem Pharmaceuticals International, Laval, Canada Title or Subject: Process for Isolation and Purification of Paclitaxel from Natural Sources This is the first of three patents covering paclitaxel 10a that is a naturally occurring compound found in the bark of yew trees and has been shown to be useful in treating various cancer tumours. The amount of 10a obtained from the bark is low, and hence, large amounts of biomass and solvents are needed to obtain reasonable quantities. Synthetic procedures are under investigation. This patent, covering 10a and its derivatives, describes an improved process to extract 10a from twigs and needles of coniferous trees of the genus T axus. An earlier process from the same company to extract 10a involves several chromatography stages and recrystallisations, and it is not particularly amenable to large-scale production. The new procedure involves an initial aqueous extraction step to remove soluble impurities from the biomass. This is then followed by extraction of 10a with methanol, followed by its isolation by chromatography and crystallisation. The various stages of the process are summarised below: A porous bag containing twigs and needles of the tree is immersed in distilled water for 3 h at room temperature, the water is drained from the bag of biomass, and MeOH is added to the biomass in the tank at room temperature, the extract is collected and the solution concentrated by distilling off the MeOH, the crude solid is precipitated by addition of aqueous NaCl solution, collected by filtration, and then dried, the solid is dissolved in Me2CO, leaving resins and pigments, hexane is added to the solution to produce an oil that is collected and purified by low-pressure column chromatography at least once, the purified oil is dissolved in acetone and cooled to give crystals of 10a, and these may be recrystallised to improve the purity. --------------------------------------------------------------------------------
紫杉醇发酵生产工艺
微生物发酵生产紫杉醇 产品介绍及社会价值：紫杉醇是一种二萜 类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的 抗癌药物之一 ？。紫杉醇最早是wanj 等于 1971 年从短枝红豆杉(7lkusbreviifolia) 树 皮中分离得到的。随后， schiff 等证实 紫杉 醇具有独特的抗癌机制。随着紫杉醇 的临床应 用，对其研究也逐渐深入，其主 要抗癌机制为 抑制肿瘤细胞的微管 (Microtllbules) 合成， 以 阻断细胞分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小； 的作用，可调节机体的免疫功能。目前国际市 场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取及半合 成，迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道。 紫杉醇的工业生产受到了 原料和技术两方面的制约， 短期内难以突破。为了解决红豆杉资源短缺与紫杉醇需求量的日 益增加的矛盾，人们对生产紫杉醇进行了多方面的研究， 包括化学全合成、红豆杉细胞培养 及微生物发酵。微生物发酵法生产紫杉醇因具有明显优势， 其研究和开发越来越受到国内外 研究学者的广泛关注。 这里提出一种运用基因工程，代谢工程，发酵工程结合的方法生产紫杉醇， 该法首先将杉醇 纯合成基因克隆至大肠杆菌，让其高产紫杉二烯，再把它流加至高产紫杉醇酵母的发酵罐中， 运用代谢工程手段生产紫杉醇。 创新点：运用克隆方法，将合成紫杉二烯的代谢过程酶的结构基因， 以及调控系列克隆至大 肠杆菌，让其表达，此过程刚被 Parayil Kumaran Ajikumar 及其同事实现，而运用代谢工程手 段让高产紫杉醇酵母利用紫杉二烯这个前体高产紫杉醇，这是没尝试但可行的。 国内外研究： 1、 分离菌种：最早stierle 和strobel 等在短叶红豆杉的枝条上分离到一种内生真菌，能够产生 紫杉醇，定名为安德列亚霉。此后， 各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作， 陆续 从西藏红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉、 中国红豆杉中分离到产紫杉醇的内 生真菌，其宿主植物几乎涉及红豆杉属的各个种。周东坡领导的课题组从百年以上的东北 红豆杉的枝条与树皮中分离到 3株可产紫杉醇的内生真菌，发酵液中紫杉醇的产量可达 51.06 卩g/L ?125. 70卩g/L 。王建锋等也从南方红豆杉皮层中分离到一株瘤座孢菌，发酵产物分 析表明可产紫杉醇，产量为 185. 4卩g/L 。 2、 菌种改良： 诱变：HQD33(周东坡分离)经过紫外线、 EMS 60co 、NTG?诱变剂顺序诱变得到高产突变 株NCEUH1,其紫杉醇产量到达 314. 07卩g/L 。 原生质体融合：赵凯等人发现最佳的诱变条件为 30w 紫外灯、30cm 距离、照射50s; UV+Licl 复合 诱变、照射时间40s 。 3、构建工程菌：紫杉醇的生物合成途径为 最近Parayil Kumaran Ajikumar 及其同事通过平 衡数 种细菌和植物的酶来利用大肠杆菌发酵产 kKUUKI-A￡.IOfi -dld 另外还有类似脂多糖(IPS) 紫杉醇还可诱导细胞凋亡, iM^Edniyj dl 声苗|加静
紫杉醇提取实验方案
实验名称：紫杉醇的提取 实验探究条件： 1、原材料：红豆杉树枝、红豆杉树皮、红豆沙树叶、三者混合； 2、烘干时的温度：40℃、60℃、80℃； 3、粉碎状态：完全不粉碎、粉碎至40目、粉碎至60目、粉碎至80目、粉碎至100目； 4、有机溶剂选取：95%甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯：丙酮=1:1； 5、层析介质选取：硅胶、氧化铝、C18、苯基柱、树脂。 实验器材： 实验仪器： 实验原料： 实验过程 1、红豆杉枝叶、树皮、树枝：采集新鲜的红豆杉树枝、树皮、叶，用清水洗净； 2、干燥与粉碎：于60℃烘箱内干燥至恒重，用粉碎机粉碎至100目，分别准确称取过筛后的各种样品2g，置50mL磨口具塞三角瓶中； 3、有机溶剂提取：加入95%乙醇20mL，超声萃取30min，留上清液，沉淀复加20mL 95%乙醇，重复操作； 4、浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中； 5、萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯（按物料：醋酸乙酯=1：1），萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。 6、浸膏：合并上清液，过滤除渣，滤液于30℃减压蒸干，得浸膏；下层清液作为10-DAB 的原材料保存好，详细步骤见最后； 7、固液萃取：浸膏用20mL甲醇溶解，加入石油醚(60～90℃)(体积比1∶1)，振荡30min，脱脂； 8、液液萃取：萃取余液用三氯甲烷(体积比2∶1)振荡30min，褪色，若褪色不彻底应反复进行； 9、沉淀：由于紫杉醇有在正己烷中沉淀这一特性，所以向液液萃取后得到的紫杉醇乙酸乙酯溶液中加入体积比为10：1的正己烷溶剂，将紫杉醇沉淀下来。（较少时，紫杉醇不能
紫杉醇提取
紫杉醇最新提取工艺 摘要：紫杉醇为著名的抗肿瘤天然产物，来源有限，化学合成是制备紫杉醇的可能途径之一。本文主要综述了紫杉醇新的提炼方法主要是在天然提取分离、细胞培养、有机合成、紫杉醇的全合成基础上取得重要成就，从而改进得出的最新提取工艺路线。其最大的改进是少用了很多有机溶剂，为分离与纯化提供便捷。 关键词：紫杉醇；天然提取分离；细胞培养；合成 1 简介 1.1 发展史 从植物中寻找有效抗癌成分的历史至少可以追溯到公元前1500年关于纸莎草（papryrus）的研究，但真正对天然产物进行系统的科学研究却是从本世纪 50年代才开始的。50年代，Hartuell及其同事着重研究了抗癌制剂鬼臼毒素（PgdoPhyllotoxin）及其衍生物的应用。同时一系列寻找天然抗肿瘤成分的研究导致了象长春花碱（Vinblastlnc）、长春新碱（Vincristine）及秋水仙碱（Colchicine）等一系列具有代表性的抗癌药物的产生。1971年，Wanj及其同要从欧洲短叶红豆杉中分离得到一种具有细胞毒性的新化合物，命名为紫杉醇(Paclltaxel，现已商品化，其注册名为Taxol)，药理实验证明，它具有广谱抗癌作用，但由于其天然含量极低，故而在当时并未引起人们的注意，直到1977年，HorwitZ博士发现其抗癌机理在于能够与微管蛋白结合，促进微管蛋白聚合装配成微管二聚体，从而抑制细胞中微管的正常生理解聚，使细胞有丝分裂停止在G2期及M期，阻止了癌细胞的快速繁殖，这一机理与上述纺锤体毒性的抗癌药物（如长春新碱与秋水仙碱）的作用机制恰好相反，从而引起随后20多年关于该属植物的广泛研究。 1.2 自然资源
紫杉醇 红杉醇的提取分离纯化工艺
紫杉醇红杉醇的提取分离纯化工艺 紫杉醇(Pac lit axe l，商品名Ta xo1)是红豆杉属植物中独有的一种抗肿瘤天然药物，由美国化学家Wa ni和W allt等人于1971年首次分离得到，并于1992年被美国FDA正式批准为抗卵巢癌新药。由于其独特的抗癌作用机制及显著的疗效而被认为是近15年来天然抗癌药物研究领域最重大的发现。随着人们对紫杉醇研究的不断深入和完善，化学合成、基因工程、细胞培养、真菌发酵等方法均可以成功获得紫杉醇，但这些方法应用于紫杉醇的生产依旧停留在实验室研究阶段。目前，国内外紫杉醇的商业化规模生产多以红豆杉植物为原料，通过一系列的分离纯化获得。由于紫杉醇在红豆杉树皮中含量极低(<0．06％)，提取精制困难等原因，导致紫杉醇纯品价格昂贵。因此完善紫杉醇的提取纯化工艺，降低生产成本，得到更加便宜的原料对保障人类健康都具有重要的意义。 红杉醇是一种高效、低毒、安全可靠的治疗糖尿病的新药。 济南博纳生物技术有限公司通过与科研院校以及紫杉醇生产厂 家合作，开发了用于紫杉醇分离纯化的SKS-30-3氧化铝 SKP-10-4300层析树脂，并率先在提取工程中使用了陶瓷滤和纳滤，使原有生产工艺多次萃取、三步层析变为两次萃取两步层析，使得产品的产品纯度提高到98.5%以上，收率提高20%以上。并针对该产品副产品红杉醇的性质，用SKP-20-8300层析树脂对该产品进行富集洗脱析晶可以得到纯度99%以上的产品。
1、20目以上红豆杉干品甲醇水浸提陶瓷滤纳滤浓缩液含紫杉醇纳滤透过液含红杉醇。 2、纳滤浓缩液萃取浓缩 SKS-30-3氧化铝转化层析分段收集所需组分浓缩回收溶剂甲醇水溶解 SKP-10-4300层析树脂收集所需组分洗脱液纳滤浓缩结晶得紫杉醇。 3、纳滤透过液浓缩盐水溶解 SKP-20-8300层析树脂收集所需组分，浓缩结晶得红杉醇。 SKS-30-3氧化铝 SKP-10-4300层析树脂 SKP-20-8300层析树脂是济南博纳生物技术有限公司针对紫杉醇红杉醇提取开发的新型层析填料，SKP-10-4300层析树脂和SKS-30-3氧化铝的连用可以完全替代高压制备液相C18分离纯化，使紫杉醇的最后精制不再受设备的限制，在低压条件下就能够完成产品的较好的分离，包括紫杉烷类10-D ABⅢ、含7-木糖基类等副产品。将作为废液的处理的红杉醇得到很好的分离。
发酵法生产紫杉醇的工艺研究
发酵法生产紫杉醇的工艺研究 (孙春艳 S2009134 ) 一、项目立项依据（立项的必要性及需求分析） 紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)是从红豆杉属植物树皮中提取分离出来的一种次生代谢物，是一种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一。由于其具有显著抗癌效果，现已成为临床上治疗肿瘤的重要药物。紫杉醇的活性就表现在两个方面：1.对于迅速分裂的肿瘤细胞，紫杉醇“冻结”有丝分裂纺锤体，从而使肿瘤细胞停止在G2期和M期，直至死亡。2.紫杉醇也作用于巨噬细胞上的肿瘤坏死因子(TNF)受体，促使释放白细胞介素(IL)-1、TNF-2、IL-6、干扰素(IFN)-1、IFN-2对肿瘤细胞起杀伤或抑制肿瘤细胞迁移作用。 紫杉醇在临床上的研究既有抗癌方面的作用又有治疗非癌症方面的作用。在癌症方面，对晚期卵巢癌、转移性乳腺癌、食道癌、肺癌、头颈部癌和鳞状细胞癌均有明显疗效。在非癌症方面，对类风湿性关节炎、抗疟作用、多囊性肾病、卡波海里是肉瘤有良好的治疗及抑制作用。 随着生活水平的提高，环境污染日益加剧，给人类健康造成了危害，同时人类癌症的发生随之日益加剧，所以人们对紫杉醇的需求也随之增加。 紫杉醇在Taxus属植物树皮中含量仅为0.01%，每提取1公斤要砍伐1000-2000棵树的树皮。据估测，紫杉醇正式应用于临床后，每年约需200公斤以上，按现在的提取得率0.03%计算，每年要收集700吨树皮来提取。即使全部天然资源采伐，也只能满足短期需要，并造成对森林和人类生存环境以及生物多样性不可弥补的损失，因此紫杉醇的原料保障就成为该药能否成功走向市场的的关键。但因资源匮乏，单纯从含量甚微的天然红豆杉植物中提取紫杉醇无法满足临床需求，故紫杉醇的药源问题已引起人们的极大关注。 发酵法生产紫杉醇优点很多，既能保护生态环境，又能快速的生产出所需要的药品，是值得研究应用的。 针对紫杉醇的需求量的增加，药源少的问题，运用发酵的方法生产紫杉醇，降低它的价格，为广大人民所用，就成了迫在眉睫的任务。 二、项目目标及主要任务 抗癌新秀紫杉醇自投放市场后，其市场销售额每年以两位数增长并高居抗肿瘤药之首，1996年紫杉醇的全球销售额已达8亿美元（其中美国本土为5亿美元）。1998已超过12亿美元/年。合成的紫杉醇销售额大约在9000万美元。目前已有50多个国家已批准销售合成紫杉醇。据美国国家癌症研究所（NCI）预测，在今后10-15年内紫杉醇将成为抗癌首选药物之一，经济效益可观。 本项目的目标及任务是利用发酵方法大量的生产紫杉醇，同时把科技成果推广开来。 三、国内外现状、发展趋势及工作基础 紫杉醇最早是Wani等于1971年从短枝红豆杉(Taxusbreviifolia) 树皮中分离得到的。随后，Schiff 等证实紫杉醇具有独特的抗癌机制。 由于红豆杉系珍稀植物，而树皮中的紫杉醇含量很低，靠树皮提取紫杉醇不能满足需求，并且严重地破坏自然资源，危及生态平衡。为了解决药源紧缺状况，长期以来科学家们为解决这一巨大供求矛盾做出了很大的努力，包括筛选高产红豆杉栽培品种、化学合成、基因工程、细胞培养、真菌发酵、寻找紫杉醇类似物等，其中对紫杉醇生源途径的研究处于核心地位。 目前紫杉醇的药源途径主要有：（1）植株栽培法即通过杂交的方法：获得生长周期短、