紫杉醇的提取工艺研究资料讲解
紫杉醇的提取工艺研
究
紫杉醇提取纯化方法的研究进展
紫杉醇是最早从红豆杉属植物中分离出来的三环二菇类化合物，是继阿霉素和顺铂之后最热点的抗癌新药。紫杉醇具有复杂的化学结构，分子由3个主环构成二菇核，分子中有11个手性中心和多个取代基团，母环部分是一个复杂
的四环体系，有许多功能基团和立体化学特征。分子式C
47H
51
NO
14
，分子量
853.92。同位素示踪表明, 紫杉醇只结合到聚合的微管上, 不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能,特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。
紫杉醇属于有丝分裂抑制剂,它的独特机制在于可以诱导和促进微管蛋白聚合,促进微管装配及阻止微管的生理解聚,由此抑制癌细胞纺锤体的形成,阻止有丝分裂的完成,使其停留在G2期和M期直至死亡,从而起到抗癌的作用。迄今为止紫杉醇是唯一促进微管聚合的新型抗癌药。这一新的发现引起了各国医药界的极大兴趣。现在已有包括我国在内的十多个国家批准了紫杉醇类药物的正式生产。目前有关紫杉醇研究的几个主要问题是:紫杉醇的提取;紫杉醇的人工合成;紫杉醇的临床应用(水不溶性问题的解决);紫杉醇的构效关系;紫杉醇的抗癌机理。
紫杉醇的抗癌机理
1971年,Wani等报道了紫杉醇在一些实验体系中具有抗癌活性。1978年,Schiff等发现紫杉醇在极低的浓度下(0.25μM)可以完全抑制Hela细胞的分裂,而且在对细胞4小时的培养过程中,对DNA、RNA和蛋白质的合成没有明显影响。Hela细胞在与紫杉醇共同温育20小时后被阻断在G2后期和M期。1979年Schiff等用浊度法进行了研究,发现紫杉醇能缩短微管在体外的聚合时间,使平衡向微管聚合方向移动,从而减小微管聚合临界浓度。在有GTP时,紫杉醇可以和PC-tubulin结合,计量比为1:1。他们还发现紫杉醇不影响纯化的Actin 的聚合(紫杉醇20μM)。目前,有关紫杉醇的抗癌机理的研究仍是一个非常活跃的领域。最近的一些进展是Tatebe等发现紫杉醇能导致细胞凋亡;Kavallaris 等首次报道了紫杉醇抑制卵巢上皮肿瘤与改变特定β-tubulin基因的表达有关;Vater等通过电镜和扫描力显微镜发现在Ca2+和紫杉醇存在下,微管蛋白的聚合发生畸变Dring等发现紫杉醇还可调节体内免疫功能，促进释放肿瘤坏死因子、白细胞介素、以及干扰素，对肿瘤细胞起抑制或杀伤作用。而且这种畸变结构随着加入紫杉醇和Ca2+的顺序不同而有所不同。
紫杉醇的来源
1963年美国化学家瓦尼(M·C·Wani)和沃尔(MonreE·Wall)首次从一种生长在美国西部大森林中的短叶红豆杉树皮和木材中得到了紫杉醇的粗提物并发现其具有抗癌活性。但直到1969年,紫杉醇单体才被分离出来。此后,在红豆杉属的多种植物中均发现有紫杉醇存在。红豆杉属植物为红豆杉科常绿乔木或灌木,全世界共11种,分布于北半球的温带至亚热带地区,包括短叶红豆杉(Taxus brevifolia),欧洲红豆杉(T. baccata),云南红豆杉(T.yun-nanensis),中国红豆杉(T. chinensis)等。在欧洲,更为常见的是欧洲红豆杉(Taxus baccata),具有明显的毒性,常有牲畜和人误食中毒的事情发生,其毒性源于所含有的有毒生物碱紫杉碱(taxineA、B);因而后来有一个有趣的观点:如果当年在NCI抗癌活性成分筛选计划中沃尔和瓦尼拿到的是T.baccata而非T.brevifolia的树皮,要么会因萃取物的毒性而停止分离,要么只能得到紫杉碱,都不会有机会发现Taxol。幸运的是,美国农业部的收集计划中送来的唯一样品是T.brevifolia,而其中紫杉碱的含量极微,紫杉醇从而有幸成为30年来最为公众瞩目的植物来源的化合物。迄今为止,红豆杉属植物仍是紫杉醇的最重要的来源。除了可从其树皮和枝叶中直接分离得到紫杉醇外,其树叶中含量很高的10-去乙酰巴卡亭
III也是人工半合成紫杉醇的原料。此外,紫杉醇还可以从全人工合成、真菌发酵、细胞培养及生物合成等途径获得。
紫杉醇提取工艺
随着人们对紫杉醇研究的不断深入和完善，化学合成、基因工程、细胞培养、真菌发酵等方法均可以成功获得紫杉醇，但这些方法应用于紫杉醇的生产依旧停留在实验室研究阶段。目前，国内外紫杉醇的商业化规模生产多以红豆杉植物为原料，通过一系列的分离纯化获得。针对红豆杉资源严重匾乏的现
状，相关生产企业采用人工培植的方法经过科学合理的选种育种栽培，加大红豆杉植物的人工培植规模，为紫杉醇的生产提供相对充足的原料供给。在细胞组织培养和基因工程技术等方法应用到紫杉醇的工业化生产之前，植物提取法仍是紫杉醇的主要来源。因此，开发出一套操作简便、快速高效的紫杉醇提取分离纯化技术无疑对紫杉醇原料药的产业现状发挥积极作用。
紫杉醇的提取过程可分为粗提和纯化两个阶段。红豆杉植物经粉碎干燥等预处理后，进入紫杉醇的粗提工艺程序。粗提阶段的目的在于选择合适的提取溶剂，运用可行的提取手段对原料粉末进行提取处理，获得含目标产物的原料液，然后从原料液中尽可能多的提取目标产物，提高目标产物在物料中的含量，所得物料在进行后续纯化获得纯品。紫杉醇的粗提工艺过程可分为初级提取和次级提取，两个过程因所用溶剂不同而除去不同的杂质。
1、紫杉醇的初级提取工艺
初级提取主要是用甲醇、乙醇、乙酸乙酷一丙酮或二氯乙烷一水对原料粉末进行浸提，一般浸提时间较长。为了缩短浸提时间，研究人员将超声、微波和超临界流体萃取等技术引入到紫杉醇的初级萃取，极大提高了紫杉醇的萃取效率。
1.1溶剂浸提
溶剂浸提常用于紫杉醇的粗提阶段，在此阶段主要考虑溶剂的选择。目前用
于浸提紫杉醇的最普通溶剂是甲醇、乙醇等有机溶剂。xu和Liu采用的是甲醇-二氯甲烷(95:5，V/V)混合物，浸提时间为35~60min，而Hoke，和Powell，都选择的是纯甲醇，浸提时间则为16~48h。余广鳌等通过研究发现，在浸提过
程中，如果使用单一溶剂，则甲醇浸提效果最好。如果使用混合溶剂，要达到好的浸提效果，甲醇或乙醇等高极性有机溶剂不可缺少。锅田宪助等对于紫杉醇的提取溶剂种类进行了详细研究，结果表明:在乙酸乙酷、乙醚等溶剂中，以乙酸乙醋一丙酮(1:1)混和溶剂的提取效果最好，浸膏中紫杉醇的含量高达
0.084%，是甲醇提取所得浸膏中紫杉醇含量的3倍。也就是说用乙酸乙酷一丙酮(1:1，v/v)一次便可以使紫杉醇提取量高于以往常用溶剂所能得到的量，为后序的分离纯化工作带来很大的方便。加之乙酸乙酷一丙酮(1:l)与甲醇成本相当，因此，这一提取方法的经济性和实用性较强。
1.2超声浸提
在中草药开发利用中，探索提高有效成分提取率的理论依据是中草药现代化研究的一个重要方面。目前大多数是通过实验方法，根据影响提取率的因素选取不同的水平条件来设计实验，优化工艺条件，缺少理论上的指导。有人将这些影响因素与有效成分溶出浓度联系起来，在FICk扩散定律的基础上对常规提取的动力学建立了一些数学模型。由于超声场强化中药有效成分的提取具有降低提取温度、缩短时间和提高提取率等优点，日益受到人们的重视。
超声强化提取的湍流效应、微扰效应、界面效应和聚能效应与超声场的频率、功率及体系的温度有关。频率越高，温度越高，这四种效应作用越强，达到提取平衡时间越短，平衡时有效成分含量越高;同时在中药有效成分提取时，要考虑到有效成分的稳定性，避免在高温和长时间条件下有效成分的分解。Auriola等人也将超声技术引入紫杉醇的初级萃取，研究发现采用超声技术，可在低温下进行操作，这样可以防止紫杉醇在温度高时可能发生的异构化。1.3超临界流体萃取
超临界流体萃取过程是利用处于临界低压和临界温度以上的流体具有特异增加的溶解能力而发展出来的化工分离新技术。利用CO2超临界流体,加入甲醇或乙醇作为夹带剂,可使红豆杉树皮中的大部分紫杉醇得到有效提取,回收率达85%,选择性好,杂质少。
超临界流体萃取具有提取能力强、提取率高、萃取时间短、工艺简单、操作方便、产品质量好的优点;同时符合环保要求，与回归大自然，崇尚绿色工业的潮流一致，具有较大的发展前景。在紫杉醇的提取过程中，由于减少了含氯有机溶剂的使用从而避免了对环境的污染。超临界流体萃取过程中最常用的溶剂是CO2，本身无毒，在提取产物中无残留，因而从用要安全角度来讲，该技术应用于紫杉醇的提取具有其独特的优点。Jennings用CO2和加入乙醇改性剂的作超临界萃取溶剂，在318K的温度下和15.07~25.79MPa的压力下，进行了
CO
2
紫杉醇的提取研究，发现红豆杉树皮中的大部分紫杉醇都能得到有效的提取，而且对紫杉醇的选择性要比传统的单纯乙醇提取高; Nair等用含15%的丙酮或乙醇的CO2作溶剂，在430~101.325kpa，308K下用超临界技术提取紫杉醇也获得了满意的效果; Castor等以红豆杉枝叶和嫩芽做原料，用超临界技术提取紫杉醇时，先以纯CO2做溶剂，以除去原料中的脂类，然后加入乙醇以调节溶剂的极性，使紫杉醇的产率达到了0.04%;Vandana等利用超临界的N2O和
N
O/EtOH混合物，对短叶红豆杉树皮中的紫杉醇也做了提取研究，发现利用超2
临界的N2O，以乙醇为夹带剂，可以把树皮中的大部分紫杉醇提取出来，比以乙醇为夹带剂的超临界CO2萃取更加有效。虽然超临界流体萃取技术在紫杉醇的提取中具有收率高、节省时间和有机溶剂等优点，但该方法对仪器设备要求较高，限制了其应用。
1.4微波提取
微波是一种波长在1~0.001m、频率在300MH Z~300GH Z的电磁波。由于其具有独特的性质(似光特性、穿透特性、热特性及生物效应)而已被广泛应用于医药领域。在中草药有效成分的提取中亦有尝试和应用，但尚未在规模生产中应用。微波提取技术主要是基于微波的热特性，其加热原理是利用微波场中介质的偶极子转向极化与界面极化的时间与微波频率吻合的特点，促使介质转动能级跃迁，加剧热运动，将电能转化为热能。微波辐射导致细胞内的极性物质尤其是水分子吸收微波能量而产生大量的热量，使细胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞壁和细胞膜冲破，形成微小的孔洞。进一步加热，细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂隙。因此使胞外溶剂容易进人胞内，溶解并释放出有效成分。与传统浸提方法相比，微波提取具有穿透力强、选择性高、加热效率高等显著特点，而且其操作简便、快速、节能、高效。因此，微波技术用于中草药有效成分提取具有巨大潜力。Kas1tu等采用甲醇或乙醇作为提取溶剂，在60℃条件下对红豆杉植物进行提取，所需时间长达24~48h，在溶剂系统不变的情况下，采用微波技术，提取时间缩短到10min以内。
2、紫杉醇的次级提取工艺
初级提取得到的原料液中，紫杉醇的浓度很低，需经进一步萃取分离以获得符合纯化标准的紫杉醇浸膏。次级提取中最为常用的方法为液液萃取，此外还有固相萃取和膜分离等。
2.1液液萃取
液液萃取通常分为非极性溶剂萃取、低极性溶剂萃取和碱液洗涤。对红豆杉植物进行浸提后，所获浸膏通常用非极性或低极性溶剂进行分配萃取。通常是用二氯甲烷一水或三氯甲烷一水对上述浸膏进行分配萃取。这种方法简单易行，但所得产物杂质较多。wall等对短叶红豆杉树皮的乙醇提取物用水和三氯甲烷进行分配萃取，效果较为理想;Witherup等对6种红豆杉属植物的针叶和树皮进行了分析，主要用二氯甲烷和水对提取物进行分配，溶于二氯甲烷的部分用多种溶剂抽提，来进行初分离。这种低极性溶剂萃取方法的局限是过程中伴随紫杉醇的较大损失，因为体系中含有相当量的极性较高的溶剂如甲醇、乙醇等，在除去的杂质相中仍有大量的紫杉醇，且此方法需反复多次操作，有机溶剂消耗量大，易造成污染环境。为了改善上述缺点，元英进等阔用乙酸乙醋溶解紫杉醇浸膏后，再以碱溶液进行洗涤，除去大量杂质的同时使紫杉醇几乎全部回收，此方法节约了溶剂用量，并减少了环境污染，可用于生产。
EP5533780A提出了一种分离紫杉醇及其前体的方法，包括真空干燥紫杉属植物的甲醇萃取物，用环己烷和二氯甲烷进行溶剂萃取以得到粗紫杉醇，接着进行硅胶柱HPLC分离等步骤;w094-13827提出了一种纯化紫杉醇的方法，包括用乙醇、甲醇和丙酮进行有机溶剂萃取，用活性炭或木炭作吸附剂进一步处理粗提物，接着用正相色谱法分离。Enakasha等人在分离红豆杉愈伤组织培养物时采用的次级萃取剂是氯仿。实验时首先将愈伤组织用甲醇萃取，匀浆化。过滤后将滤液调整为甲醇含量为65%，加入氯仿(3:1，v/v)，分相，最终紫杉醇回收率为87%。
2.2固相萃取
由于植物中紫杉醉含量很低，且成分复杂，提取工作困难，液一液萃取操作又常导致回收率低、分离效果差等问题。固相萃取法(Solid一PhaseExtraction，SPE)作为一种新型萃取方法，具有节省时间、降低溶剂用量、提高选择性和收率的优点。SPE实质是色谱分离方法(前沿色谱)，其主要是除去与紫杉醇极性相差较大的杂质。所用填料主要有硅胶、氧化铝和CIS反相硅胶。固相萃取法所使用的设备主要是滤筒，通常的做法是将含有紫杉烷类物质的原料加入滤筒，进行梯度洗脱。这种方法在完成液一液萃取所能达到的效果的同时还能从一定程度上达到初次色谱分离的效果。陈振德等以红豆杉科框属植物(Torreya)的假种皮为原料，直接对乙醇提取物进行硅胶柱层析，降低了制备紫杉醇的成本，扩大了其原料的来源，且保护了植物资源。Mattina等「刘在研究中比较了三种不同的固相萃取方法。在第一种方法中使用了高效
C18萃取柱作为滤筒;第二种方法将C18吸附剂装入聚丙烯过滤柱制成滤简;第三种方法中使用的设备是C18EmP0re滤板和Millipore玻璃过滤仪器。无论使用何种装置进行萃取，洗脱液的顺序如下:去离子水:20%的甲醉溶液:45%或50%的甲醇溶液:80%的甲醇溶液。大多数紫杉烷类物质都选择性地被80%的甲醇溶液洗脱下来。最后的比较结果显示，C18EmPore滤板能极大地提高粗提物的处理量，同时还能较好地回收极性较低的紫杉烷类物质。韩丽萍等选择中性氧化铝进行固相萃取，有效的去除了紫杉浸膏和紫杉口服液制剂中的杂质和干扰物，使其中的待测成份紫杉醇得到了准确有效的定量分析。
2.3膜分离技术
膜分离(MembraneS即 aration)是利用具有一定选择性、透过特性的过滤介质进行物质的分离纯化，是人类最早应用的分离技术之一。作为一种有效的
分离纯化手段，膜分离被广泛应用于食品、医药、化工等领域。它依靠膜两侧的压力差，在与溶液接触时，使溶液中分子量小于其截留分子量的溶质透过膜，分子量大于截留分子量的溶质留在原液内，通过对试样中物质分子量的不同，选择截留分子量不同的膜分离设备达到对物料中组分的分离。膜分离法近年来也用于分离紫杉烷类化合物。Carver等采用平板式、中空纤维式和管式膜组件，对超滤膜和反渗透膜在紫杉烷类物质的分离过程中的应用进行了研究，其结果表明:采用膜分离方法可以进一步浓缩粗提过程所得浸膏，使紫杉烷类物质的浓度提高5倍左右，相当于对浸膏又进行了一次预处理，从而减小了后序色谱分离的负担和紫杉醇的损失。Raymond等人用0.2m的尼龙膜和PVDF膜处理紫杉醇的组织培养液时，发现尼龙膜可以选择性地截留紫杉烷类物质。尼龙膜截留了几乎所有的10-去乙酞基紫杉醇、紫杉醇以及绝大部分的Cephal。mannine，而对其它的紫杉烷类几乎没有截留作用，而PVDF膜则截留了所有的紫杉烷类，这说明尼龙膜可以选择性地吸附紫杉烷类化合物。
2.4树脂吸附分离法
树脂吸附分离法 (ResiouSAdsorpti。 nSeparati。 nMethod，RASM)基于离子交换分离原理。离子交换分离的原理是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的技术。最常用的离子交换剂是离子交换树脂，它是由不溶性的载体、功能团和平衡离子(也称活性离子)组成的。紫杉醇是一种二菇类化合物，具有多环结构，容易被带苯环的吸附剂特异性吸附，所以近年聚苯乙烯型树脂被较多的应用到紫杉醇的前处理中，可有效的去除色素等杂质。元英进等的研究结果表明，聚苯乙烯型强碱树脂(Ps-A)及多乙烯多胺一环氧氯丙烷缩聚型弱碱树脂(PC-A)对二氯甲烷粗提物的吸附及脱色性能较
好，有望用于紫杉醇的纯化分离。张志强等采用聚苯乙烯型大孔树脂 (201x4)层析，有效地从红豆杉甲醇浸膏中分离紫杉醇和脱除色素，样品中紫杉醇含量从0.65%提高到了2.15%，回收率达99.6%。
以上各种方法得到的是低纯度的紫杉醇浸膏，实际上是紫杉烷类化合物如菇类化合物、类脂、叶绿素和酚类同时伴随有目标产物紫杉醇，要得到药用的紫杉醇，还需进一步纯化和精制。
3、紫杉醇的纯化工艺
经过粗提获得的浸膏中紫杉醇的含量很低，要获得达到医用纯度的紫杉醇还需对粗提物进一步纯化处理。紫杉醇的纯化工艺是获得高纯紫杉醇的关键步骤，这一步骤涉及的工艺占主导地位的是色谱方法。用色谱法分离纯化紫杉醇时，柱色谱被用于紫杉醇的预分离和最终分离，而薄层色谱则被用于紫杉醇的检测和纯化。目前，随着分离工艺的不断完善，色谱法有了长足进步。各种用于紫杉醇分离纯化的色谱方法有高效液相色谱(HPLC)，薄层色谱(TLC)，超临界流体色谱(SFC)、电泳色谱(MEKC)、免疫亲和色谱、高效逆流色谱(HSCCC)等。下面简单介绍几种常用的紫杉醇纯化方法。
3.1正相色谱法
正相色谱是紫杉醇分离纯化过程中普遍采用的方法，在早期分离纯化的研究中占有主导地位，至今仍在广泛使用。正相色谱一般是使用硅胶作固定相，使用一些极性较小的有机溶剂作流动相，将紫杉烷类化合物洗脱出来。正相色谱的突出优点是固定相价格低廉，用普通的硅胶即可，而且洗脱用的流动相多为挥发性很强的有机溶剂，溶剂回收简单。陈建民等以50一300目硅胶做固定相，在常压下梯度洗脱含10.48%的紫杉醇粗品，用无毒性的正构烷烃、乙酷为
洗脱剂，常压下分离纯化紫杉醇，洗脱所得馏分经真空冷冻干燥，得到99十99.5%的紫杉醇。该方法工艺简单，成本低，洗脱剂容易回收，但紫杉醇回收率较低;吕秀阳等将样品进行浸提和液液萃取后，使用了三次正相色谱分离，在三次柱层析的过程中，采用的空白硅胶目数增加，空白硅胶与拌样硅胶之比增大，而流动相的极性下降，最后结晶得到紫杉醇含量62.5%的白色棉花状结晶。
3.2反相色谱法
由于正相色谱所使用的固定相大多为硅胶，而硅胶的不可逆吸附使样品损失增大，并且硅胶固定相只能使用一次，操作十分不便，因而反相色谱的使用越来越广泛。一般情况下，反相色谱使用极性较大的有机溶剂作为流动相，先将一些杂质及色素洗脱下来，然后再增大梯度将紫杉烷类化合物洗脱出来。
雏丽娜等以东北红豆杉树叶为原料，采用正相色谱和反相色谱法分离提纯了紫杉醇和三尖杉宁碱，反相色谱中使用了一种新颖的高分子填料。东北红豆杉枝叶经过一次正相色谱分离后，再经两次反相色谱分离，分离得到两种白色针状固体。经1H NMR和13C NMR测试表明，两种物质分别为紫杉醇和三尖杉宁碱，纯度达到98%以上，回收率大于70%;张志强等选择了廉价的大颗粒烷基硅胶层析柱纯化紫杉醇粗品，并对层析操作条件进行了优化，使紫杉醇的含量提高到98%，回收率在85%以上，并且采用该固定相可以降低紫杉醇的生产成本和提高回收率;Zamir等人在分离加拿大红豆杉的根和树皮时，使用了重结晶技术和反向色谱技术相结合的方法。他们首先利用重结晶技术从粗提物中分离出了10-DAB和9-dihydro-13—acetyl-baCCatinlll，再用反相高效液相色谱分离其他紫杉烷类物质，从而避免了在分离纯化阶段多次使用色谱柱，。虽然目前反
相色谱分离纯化紫杉醇的工艺尚没有工业化的报道，但相对于正相色谱工艺，反相色谱有很多优点。首先，它不消耗大量的有机溶剂，对环境污染较小;其次，人们在开发反相填料时专门引入的一些特定的键合相使反相填料有更好的选择性，在克服正相硅胶的不可逆吸附造成目标产物回收率低方面也很有价值。
3.3薄层色谱法
薄层色谱(TLC)是分离紫杉醇的常用方法。一般先把提取液浓缩，然后在TLC硅胶板上平行点样，用丙酮、氯仿、甲醇、庚烷、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙醋等展开，再进行紫杉醇的定位。定位的方法有:与标准样进行对照，在
254nm紫外灯下进行定位标记，刮下每一部位，装入小柱。用甲醇洗脱，将洗脱液蒸干，从而使紫杉醇得到分离。薄层色谱技术早期多用于紫杉烷类化合物的定性及半定量分析。TLC结合核磁共振(NMR)、质谱(MS)技术，己成功地分离获得多种新的紫杉烷类化合物，显示出在定性分析方面的优势。
Matysik等报道了一种分步梯度TLC结合光密度扫描定量测定紫杉醇的方法，该方法采用混合溶剂两步梯度展开，亦获得满意结果;由Stasko等人开发的多维薄层色谱法(MTLC)使TLC法获得了极大的发展。该项研究采用了三种薄层板:氰基板，二苯基板和氨基板，分别进行正相和两维洗脱。结果发现氰基板和二苯基板能有效分离紫杉醇和Cephalomafinine，而氨基板效果较差。虽然此项研究却是提供了从 TaxuSbrevifolia原料浸膏中精确分离紫杉烷类物质的方法，但还是无法对紫杉醇和其他紫杉烷类物质进行定量化。
3.4高效逆流色谱法
高效逆流色谱技术是当前国际上较新型的一种液液分配技术。该法具有分离效果好，溶剂用量少的优点，同时也具有无固体载体逆流色谱的内在优点。目前用于紫杉醇的分离有用正己烷一乙酸乙酷一乙醇一水(6:3:2:5，v/v/v/v)和正己烷-乙酸乙酷-甲醇-水(1:1:1:l)从红豆杉粗提物中分离纯化了紫杉醇、cepha1omannine、巴卡亭ш;采用石油醚(40℃~65℃)一乙酸乙酷一甲醇一水(50:70:80:65)为两相体系从混合物中分离得到纯的紫杉醇和
cepha1omannine。Chiou等使用循环的高速逆流色谱分离紫杉醇和Cephalomannine的混合物，循环两次后两种物质谱峰的分离度由0.7上升到1.27。HSCCC有望成为紫杉醇的大规模生产技术。
3.5电泳色谱法
电泳色谱是一种新型色谱分离方法，这种方法和高效液相色谱比较，更迅速更经济，而且使用的溶剂量很小。近年来该法在紫杉醇的分离纯化方面得到应用。Chan等人利用电泳色谱分离紫杉醇和它的6种类似物中发现，使用此种方法能在15分钟内将这7中紫杉烷类物质成功地分开。Shao等用毛细管凝胶电泳色谱分离紫杉醇和14种相关的紫杉烷类化合物，用含有表面活性剂(十四烷基磺酸钠)的乙睛水溶液做缓冲剂，取得了很好的分离效果。乙睛在其中的作用还不明确，但是如果没有这种有机调节剂就不能实现这15种物质的分离。尽管使用电泳色谱分离紫杉烷类物质具有很多优点，但是由于其处理量微小，操作复杂，从而影响其大规模的应用。
随着紫杉醇市场的不断扩大，工业化规模的分离纯化工艺日益受到重视，分离工艺的经济性显得十分重要，所以研究人员又开发了常压和中压的正相和反相的制备色谱技术进一步完善了紫杉醇的分离工艺。Rao发明了一种制备型
反相色谱技术，将这种技术和重结晶技术相结合，能简化紫杉醇的分离纯化工艺过程，使得只用一次色谱分离就能得到良好的分离效果。Nair等研究者采用正相制备色谱分离细胞发酵液，最终可以获得纯度很高的紫杉醇。Wu等又分别对正相和反相制备色谱的填装物质进行了研究，开发了一种新型高选择性的柱装填物系一 SwTaxane，使分离效率大大提高。
第6章紫杉醇生产工艺
第六章紫杉醇的生产工艺 6.1 概述 6.1.1 紫杉醇类药物 1、紫杉醇 紫杉醇（Paclitaxel，Taxol?）的化学名称为5β,20-环氧-1β,2α,4α,7β,13α-五羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-10-乙酰基-13-[(2′R,3′S) -N-苯甲酰基-3′-苯基异丝氨酸酯] ，英文化学名称为13-[(2′R,3′S) -N-carboxyl-3′-phenylisoserine, N-benmethyl ester, 13-ester with 5β,20-epoxyl-1β,2α,4α,7β,13α-hexahydroxytax-11-en-9-one-4-acetate-2-benzoate,trihydrate。 紫杉醇具有复杂的化学结构，属三环二萜类化合物，整个分子由三个主环构成的二萜核和一个苯基异丝氨酸侧链组成（图6－1）。分子中有11个手性中心和多个取代基团。分子式为C47H51NO14，分子量为853.92，元素百分比为C：66.41，H：6.02，N：1.64，O：26.23。紫杉醇难溶于水，易溶于甲醇、二氯甲烷和乙氰等有机溶剂。 图6－1 紫杉醇的化学结构 2、多烯紫杉醇 多烯紫杉醇（多西他赛，Docetaxel，Taxotere?，图6－2）是在开展紫杉醇半合成研究过程中发现的一种紫杉醇类似物，两者仅在母环10位和侧链上3'位上的取代基略有不同。多烯紫杉醇的化学名称是5β,20-环氧-1β,2α,4α,7β,10β,13α-六羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[(2′R,3′S) -N-叔丁氧羰基-3′-苯基异丝氨酸酯]·三水合物，英文化学名称为-13-[(2′R,3′S) -N-carboxyl-3′-phenylisoserine, N-tertbutyl ester, 13-ester with 5β,20-epoxyl-1β,2α,4α,7β,10β,13α-hexahydroxytax-11-en-9-one-4-acetate-2-benzoate,trihydrate 。分子式为C43H53NO14·3H2O，相对分子质量为861.9。 1985年，法国罗纳普朗克乐安公司（Rhone-Poulenc Rorer）公司和法国国家自然科学研究中心（CNRS）以10-DAB作为母环骨架，通过半合成方法成功地合成出多烯紫杉醇，目
紫杉醇提炼步骤
紫杉醇规模生产工艺及方案（1500吨/年规模） 一、项目规模生产工艺方案 1、紫杉醇概述紫杉醇具有复杂的化学结构，母核部分是一个复杂的四环体系，有许多的功能基团和立体化学特征，化学名称为：5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯，分子由3个主环构成二萜核，上连1个苯异丝氨酸侧链，分子中有11个手性中心和多个取代基团，分子式为C47H51NO14，相对分子质量853.92，元素百分比（%）C：66.41，H:6.02，N:1.64，O:26.23。紫杉醇结构式为：紫杉醇为白色结晶性粉末，无臭，无味，在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。甲醇制3mg/ml 的溶液，比旋度为-48℃~56℃。甲醇制15μg/ml的溶液，在227nm处有最大紫外吸收，10mg紫杉醇加甲醇溶液10ml溶解后应澄清无色。紫杉醇注射剂是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，可能是使细胞中止于对放疗每咸的G2和M期，适用于卵巢癌和乳腺癌及NSCLC的一线的二线治疗。用于头颈癌、食管癌、精原细胞瘤，复发非何金氏淋巴瘤等治疗，静脉给予紫杉醇注射剂，药物血浆浓度呈双曲线，蛋白结合率89%~98%，主要在肝脏代谢，随胆汗进入肠道，经粪便排出体外（﹥90%），经肾清除只占总清除的1%~8%。 红豆杉浸膏
1.1操作过程： （1）浸提：将原料投入提取罐内，干红豆杉每罐填装约1.2吨的原料，加入约4吨的甲醇浸提，温度为45±5℃，每遍循环浸提大于4小时，浸提完成后，将浸提液排入浸提液储罐中，进行蒸汽吹渣，温度控制在85±5℃,压力小于等0.2Mpa，回收残余的甲醇溶液，吹渣结束后，将废渣移到废料堆场集中处理。 （2）浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中。（3）萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯（按物料：醋酸乙酯=1：1），萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。 （4）干燥：将浓缩后的醋酸乙酯萃取液抽入蒸发罐内，罐内温度不超过45±5℃，真空度为-0.06±00.1Mpa，浸膏置真空干燥箱内干燥，干燥完成后，取出产品，凉干，敲碎，经检验合格后即成为紫杉醇浸膏，用铁桶封装，入库阴凉保存。 1.2紫杉醇粗制工艺步骤 1.2.1操作过程 （1）配料、装柱：将紫杉醇浸膏约100kg按物料、重量比1：1的比例加入100-200目的硅胶搅拌均匀，真空干燥，装柱。 （2）一次层析、浓缩：配制不同极性的淋洗液（乙酸乙酯：正已烷
紫杉醇的提取和性能
紫杉醇的提取和性能 姓名：高海艳 学号：51151300057 专业：种子植物分类学
紫杉醇的提取和性能 一、紫杉醇简介 紫杉醇（T axol）是一种复杂的具有抗癌活性的二萜类生物碱[1]（结构如图一所示），是从短叶红豆杉（Taxus brevifolia）和东北红豆杉（Taxus cuspidata）的树皮中提取出来的。具有抗肿瘤、抗白血病的显著作用，主要用于治疗卵巢癌和乳腺癌[2]，被人们誉为“植物黄金”。 Vidensek[3]对东北红豆杉（Taxus cuspidata）幼苗以及成树的不同部位中的紫杉醇含量作了分析结果表明成树紫杉醇的含量高低依次为树皮>树叶>树根>树干>种子>心材，幼苗的紫杉醇含量高低依次则是树叶>树根>嫩枝条>心材。另外，对于不同植物来源的组织培养细胞中的紫杉醇含量陈未名等[4]作了大量的研究，结果表明愈伤组织中的紫杉醇含量以云南红豆杉为最高其次为欧洲红豆杉，再次为红豆杉；而悬浮培养细胞中的紫杉醇含量从高到低依次为云南红豆杉、欧洲红豆杉、红豆杉。 二、紫杉醇提取工艺 1、从原植物体中提取紫杉醇[5]： 红豆杉枝叶、树皮、树枝的采集 原料的干燥及粉碎 有机溶剂提取:甲醇 除去浸膏 固—液萃取
细胞密度 确定接种细胞培养时间 确定培养基 细胞悬浮培养配制培养基 2、细胞培养高效提取紫杉醇[6]： 三、紫杉醇药用功能及体制液—液萃取 己烷沉淀 硅胶柱层析 结晶 TLC检测高效液相色谱检测 诱导愈伤组织 配制培养基添加植物激素 制备及接种外植体红豆杉幼茎30 天 转 接 继代培养筛选抗褐化剂 柠檬酸 VC 活性炭 确定愈伤组织 直接继代 剥离后继代 分离检测紫杉醇TLC-紫外分光光度法 多次继代至生长稳定 筛选高产细胞株培养方式 普通平板培养 条件培养 看护培养 植板率 稳 定 高 产 细 胞 株 添加多种代谢调节因子 确定培养方式小剂量连续添加一次性大剂量添加 确定代谢调节因子加入时间 高效诱导体系
紫杉醇的合成
苏州大学研究生考试答卷封面 考试科目: 有机合成考试得分 院别: 材料与化学化工学部专业: 分析化学 学生姓名: 饶海英学号: 20114209033 授课教师: 考试日期: 2012 年 1 月8 日 天然抗癌药物紫杉醇的合成进展 摘要:本文对多烯紫杉醇的合成的各种合成方法进行了综述。 关键词:多烯紫杉醇合成抗癌 多烯紫杉醇(daxotere) 商品名为多西她赛(Docetaxel) , 化学名为[ 2aR-( 2aα, 4β, 4aβ, 6β,9α, ( aR3, βS3) , 11α, 12α, 12aα, 12bα) ] -β- [ [ (1, 1 2二甲基乙氧基)羰基]氨基] -α-羟基苯丙酸[ 12b-乙酰氧-12 -苯甲酰氧-2a, 3, 4, 4a, 5, 6, 9,10, 11, 12, 12a, 12b -十二氢-4, 6, 11-三羟基-4a, 8,13, 13 -四甲基-5-氧代-7, 11-亚甲基-1H-环癸五烯并-[ 3, 4 ]苯并[ 1, 2-b ]氧杂丁环-9-基]酯,就是法国罗纳普朗克·乐安公司开发的半合成紫杉醇的衍生物,它对晚期乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、头颈部癌、胃癌等均有效。其作用机制就是通过与肿瘤细胞微管蛋白结合, 加强微管蛋白的聚合、抑制微管解聚,最终形成稳定的非功能性微管束, 从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂与增殖[1-3] 。 商业化生产的紫杉醇类抗癌药物大多采用半合成方法,这就是现阶段最具经济性与可操作性的合成方法。多烯紫杉醇的半合成方法就是利用从红豆杉属植物的针叶中提取的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ (10-DAB ) ,通过选择性保护部分羟基, 然后在10-DAB C13位的羟基上连接合成的手性侧链, 再去掉保护基团得到。其中以多烯紫杉醇C13位侧链的合成以及该侧链与选择性保护的母核10-DAB进行酯化反应最为重要[4-5] 。 紫杉醇的构效关系已经被众多学者所研究与总结。具有游离羟基的C13位侧链,C2与C4位的酯基,C4、C5位四元含氧环及紫杉烷的刚性环结构对抗癌活性都起着很重要的作用。 1988年,Potier等从欧洲紫杉(Taxus baccata)中分离得到10-去乙酰巴卡亭(Baccatin) Ⅲ( DAB),DAB 已被成功地用来半合成紫杉醇,并已工业化生产[6]。半
紫杉醇提取工艺原理及操作技术
紫杉醇提取工艺原理及操作技术 紫杉醇为白色结晶性粉末，无臭，无味，在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。紫杉醇常规的提取工艺各个生产环节需控制在低温下操作，保证产品活性。各个工时段应尽快完成，可选水浴加热提取罐(含溶剂回收装置)，旋转真空浓缩机组(低温浓缩，1-2秒完成)，层析柱(精制分离)，板式真空干燥箱(低温干燥、速度快)。 紫杉醇提取操作过程 (1)浸提：将原料投入提取罐内，干红豆杉每罐填装约1.2吨的原料，加入约4吨的甲醇浸提，温度为45±5℃，每遍循环浸提大于4小时，浸提完成后，将浸提液排入浸提液储罐中，进行蒸汽吹渣，温度控制在85±5℃,压力小于等0.2Mpa，回收残余的甲醇溶液，吹渣结束后，将废渣移到废料堆场集中处理。 (2)浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中。 (3)萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯(按物料：醋酸乙酯=1：1)，萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在 45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。 (4)干燥：将浓缩后的醋酸乙酯萃取液抽入蒸发罐内，罐内温度不超过45±5℃，真空度为 -0.06±00.1Mpa，浸膏置真空干燥箱内干燥，干燥完成后，取出产品，凉干，敲碎，经检验合格后即成为紫杉醇浸膏，用铁桶封装，入库阴凉保存。 甲醇制3mg/ml的溶液，比旋度为-48℃~56℃。甲醇制15μg/ml的溶液，在227nm处有最大紫外吸收，10mg紫杉醇加甲醇溶液10ml溶解后应澄清无色。紫杉醇注射剂是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，可能是使细胞中止于对放疗每次的G2和M期，适用于卵巢癌和乳腺癌及NSCLC的一线的二线治疗。用于头颈癌、食管癌、精原细胞瘤，复发非何金氏淋巴瘤等治疗，静脉给予紫杉醇注射剂，药物血浆浓度呈双曲线，蛋白结合率89%~98%，主要在肝脏代谢，随胆汗进入肠道，经粪便排出体外(﹥90%)，经肾清除只占总清除的1%~8%。 莱特莱德膜分离技术有限公司致力于膜分离和脱盐浓缩技术以及冷冻浓缩分离技术推广与工艺设备开发。通过多年的努力，已具备丰富的工程经验，为客户提供从小试、中试、工业化设备的工艺设计到设备生产、安装调试等一系列服务，能够提供整体解决方案和交钥匙工程，并成功应用于冶金、环保、制药、化工、食品等领域，赢得了客户和业内的良好口碑。
紫杉醇的提取和性能
紫杉醇的提取与性能 姓名:高海艳 学号:51151300057 专业:种子植物分类学
紫杉醇的提取与性能 一、紫杉醇简介 紫杉醇(T axol)就是一种复杂的具有抗癌活性的二萜类生物碱[1](结构如图一所示),就是从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)与东北红豆杉(Taxus cuspidata)的树皮中提取出来的。具有抗肿瘤、抗白血病的显著作用,主要用于治疗卵巢癌与乳腺癌[2],被人们誉为“植物黄金”。 Vidensek[3]对东北红豆杉(Taxus cuspidata)幼苗以及成树的不同部位中的紫杉醇含量作了分析结果表明成树紫杉醇的含量高低依次为树皮>树叶>树根>树干>种子>心材,幼苗的紫杉醇含量高低依次则就是树叶>树根>嫩枝条>心材。另外,对于不同植物来源的组织培养细胞中的紫杉醇含量陈未名等[4]作了大量的研究,结果表明愈伤组织中的紫杉醇含量以云南红豆杉为最高其次为欧洲红豆杉,再次为红豆杉;而悬浮培养细胞中的紫杉醇含量从高到低依次为云南红豆杉、欧洲红豆杉、红豆杉。 二、紫杉醇提取工艺 1、从原植物体中提取紫杉醇[5]: 红豆杉枝叶、树皮、树枝的采集 原料的干燥及粉碎 有机溶剂提取:甲醇 除去浸膏 固—液萃取 液—液萃取 己烷沉淀
2、细胞培养高效提取紫杉醇[6]: 1 紫杉醇就是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物,在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌与部分头颈癌与肺癌的治疗[12]。 2、紫杉醇作用于癌症的机制: 1979年,美国爱因斯坦医学院的分子药理学家Horwitz 博士阐明了紫杉醇独特的抗肿瘤作用机制:紫杉醇可使微管蛋白与组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡,诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配、防止解聚,从而使微管稳定并抑制癌细胞的有丝分裂与防止诱导细胞凋亡,进而有效阻止癌细胞的增殖,起到抗癌作用(如下图所示)[7-11]。
提取紫杉醇初分离工艺的研究
紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是当今一种重要的抗癌新药。早在1971年，Wani等 就从红豆杉树皮中发现并分离出了这种物质。由于它特异的临床抗癌疗效，1992年被美国FA D批准为治疗晚期乳腺癌的特效药而上市。然而，在实际药物生产中，紫杉醇的大规模制备仍 存在许多问题。首先，紫杉醇来源匮乏，其主要存在于红豆杉树皮和针叶中，其次，紫杉醇在植物中含量极低，大约为0.010%~0.013%，而紫杉醇与其它紫杉烷化合物在化学结构和极性 等方面又极为相似，要将它们完全分离困难很大。 关于紫杉醇提取分离方法，已有过不少的研究。其中以液-液萃取应用最为广泛，在文献 报道的每一种工艺中，几乎都采用过它。Willey等和Mattina等在测定样品中紫杉醇浓度时，选择了固相萃取作为HPLC分析的预处理。以分子间吸附为机理的硅胶柱层析，是制备紫杉醇 最常用的方法之一。1984年，Senilh等曾采用氧化铝柱层析处理红豆杉浸膏，但所报道的分 离效果不是太理想。1995年，Matysik等曾用制备薄层层析来少量获取紫杉醇。本研究的目的 ，在于寻找一条切实可行的工艺路线，最大程度地提高紫杉醇的回收率，以充分利用有限的红豆杉资源；采用一些高效、经济的提取分离方法，减少过程步骤，快速、简捷地提取出紫杉醇。 1 材料方法 1.1 材料 红豆杉树皮提取浸膏，云南张峰植物加工厂；紫杉醇对照品，纯度大于95%，Sigma；固 相萃取柱（C18填料，10ml），大连化学物理研究所；GF254硅胶和粗孔硅胶（100~140目），青岛海洋化工厂；层析氧化铝（200~300目），上海新诚精细化学品有限公司。 DU-7紫外/可见分光光度计及FL-750HPLC仪，Beckman公司；XZ-6A旋转蒸发器，北京科龙 仪器公司；常压层析系统，Pharmacia公司。 1.2 方法 1.2.1 液-液萃取称取红豆杉树皮浸膏于锥形瓶中，加CH2Cl2（浸膏CH2Cl2的重量比为 1：50），充分溶解，再加入与CH2Cl2等量的水，充分混合后静置分层，分液回收有机相，弃 水相。有机相再加水萃取，重复三次。将有机相中的CH2Cl2减压蒸出回收，所得固相物溶解 于甲醇中，用HPLC作定性定量分析。 1.2.2 固相萃取固相萃取过程包括四个步骤，即固定相活化、样品上柱、淋洗、样品的洗脱。全过程将速度稳定控制在5~8ml/min。固定相活化：取乙酸乙酯10ml加入柱中，抽空。 依资助加入甲醇10ml和0.01mol/L(pH5.0)的乙酸铵缓冲液10ml（乙酸铵水溶液），将液面维持在胶层上1~2mm。上样及淋洗：将样品溶于80%~90%的甲醇乙酸铵溶液中，取0.5ml加入柱中
紫杉醇的分离工艺
⒉紫杉醇的分离工艺 红豆杉针叶、树皮、根的采集 原料的干燥及研磨 初级萃取 次级萃取 水相（含键合相）有机相 色谱纯化 纯品紫杉醇 图11-4紫杉醇分离纯化工艺 紫杉醇的分离纯化工作开展较早，最早的分离巩义市1966年采用400根试管的逆流分配色谱法，从12g太平洋红豆杉树皮中提取了少量紫杉醇，历时两年，这种工艺十分琐碎，收率极低。随着相关科学技术的不断发展，分离工艺也获得了很大的改进。一般来说，紫杉醇的分离工艺可以分为粗提和纯化两个阶段，分离纯化过程可用图11-4表示。 ⒊紫杉醇粗提工艺 粗提阶段的目的在于从原料液中尽可能多的提取目标产物，所得到的物料在进行后续的提纯直至获得纯品。粗提过程中初级萃取和次级萃取所采用的溶剂不同可以导致除去杂质不同，不同时期研究者对这两个过程的研究结果列于表11-5中。 目前用于提取紫杉醇的最普遍的初级萃取剂是乙醇（甲醇）和水，采用95:5的甲醇和二氯甲烷的混合物，萃取时间35～60min；采用纯甲醇，所需萃取时间则为16～48h。在大多数情况下还需对甲醇初级萃取物进行次级萃取。一般是在初级萃取物中加入二氯甲烷和水的混合物，即液-液萃取，该方法可以有效地除去萃取液中50％（质量比）的非紫杉醇烷类物质。如果采用一个较为复杂的分离体系，发现所有的紫杉醇都在氯仿相中。 次级萃取除了可采用各种有机溶剂进行液-液萃取外，还可以采用固相浸取法和超临界流体萃取法。这两种方法的共同特点是有机溶剂用量少，减少了环境的污染。若用枝叶为原料，由于枝叶特别是枝叶中含有许多色素和蜡质，无疑将大大增加紫杉醇的提取分离难度。这要求首先在甲醇粗提取物中加入低极性溶剂如正已烷以除去此物质，该法可除去红豆杉枝叶中多达72%的可溶于正已烷的杂质。 五、正相色谱过程为核心的紫杉醇分离纯化工艺
从紫杉植物中提取紫杉醇的简化方法
从紫杉植物中提取紫杉醇的简化方法 红豆杉Taxus又名紫杉，也称赤柏松，生于海拔1000～1200m处的山地，是世界上公认的濒临灭绝天然珍稀植物，从其根、皮、茎、叶中提取的紫杉醇taxol是目前世界上最有效的抗癌药物之一。全球每年大约需要1500～2500kg紫杉醇，而1 kg树皮仅能提取50～100mg。 10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ又称10-脱乙酰基浆果赤霉素Ⅲ，10-deacetylbaccatinⅢ，10-DABⅢ为有抑制肿瘤作用的紫杉烷二萜类化合物。Bissery等报道，可利用10-DABⅢ合成具有比紫杉醇更高抗癌活性的多烯他赛docetaxel。紫杉醇主要存在于树杆和树皮中，10-DABⅢ主要存在于树叶中，其含量大大高于紫杉醇的含量。 红豆杉是国家珍稀保护植物，生长缓慢，如果直接从红豆杉树皮中提取紫杉醇，不仅资源有限，而且不利于资源保护。以10-DABⅢ为原料采用酶催化半合成工艺方法来制备紫杉醇，可大大简化合成过程，使紫杉醇骨架修饰所需步骤更少，操作更简单，提高了紫杉醇合成的选择性和生产率，进而为在更大规模上进行紫杉醇生产提供了技术支持，最终使紫杉醇的化学合成半合成的产业化有了实现的可能。 目前文献报道从各种紫杉植物中提取紫杉醇的方法，均需经过繁冗的分离过程。本实验采用了一种适合于以各种紫杉植物树叶或树枝做原料，通过极性梯度溶剂萃取的方法逐步脱除大量不相干杂质，得到合成紫杉醇的前体10-DABⅢ的方法，然后通过反相层析柱加成，即可获得抗癌活性成分紫杉醇； 材料与方法 1 材料与仪器 南方红豆杉Taxus mairei枝叶取自浙江宁海红豆杉种植基地，8年树龄。10-DABⅢ对照品为Sigma公司产品，纯度98％；所用甲醇；乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、氯仿、正己烷、石油醚、乙腈等均为分析纯试剂。JJ一1精密增力电动搅拌仪，江苏金坛市江南仪器厂；SENCO R一201旋转蒸发仪，上海申顺生物科技有限公司；玻璃硅胶柱为2cm×40cm，杭州常盛科教器具厂；UV一2802PC／PCS型分光光度计，UNICO上海仪器有限公司；Sigma一3K18低温离心机4℃，转速18000rmin；LabAlliance高效液相色谱仪美国SSI公司。 2 实验方法 取南方红豆杉枝叶研磨成细粉，于燥保存。称取100g红豆杉细粉，45℃烘干，石油醚预处理，5L甲醇冷浸，辅以搅拌，超声40min，反复2次。浸渍液过滤，减压浓缩至100mL。加入75 mL正己烷萃取分液，重复操作2～3次。弃去正己烷层，萃余液旋干溶剂，制成浸膏。加入氯仿与水的混合液1：1反复提取。氯仿层减压浓缩至10～15mL上柱，用硅胶正相色谱柱分离。分段收集洗脱液，紫外监测，收集有效段合并浓缩，在甲醇／水中重结晶。 3 分析测试方法 采用反相高效液相色谱RP―HPLC方法检测。分析柱为Kromasil C18柱250mm×4.6 mm，5μm，流动相为乙腈-水30：70，流速为2.0 mLmin，每次进样体积为10μl，进样间隙用纯乙腈对柱子进行梯度冲洗。紫杉醇最大吸收波长为227nm，检测器测定波长为232nm，温度30℃，相关数据计算均采用峰面积归一化法。 结果 1 预处理 由于红豆杉枝叶中含有大量蜡质、植物色素诸如叶绿素等低极性杂质，故在提取前应首先加入低极性溶剂如正己烷、石油醚浸泡脱脂，以除去大量存在的此类非极性杂质，简化后续操作。该法可除去红豆杉枝叶中多达72％的极性比10-DABⅢ小且可溶于正己烷的杂质。 2 有机溶剂粗提 目前用于紫杉烷类物质提取的最普通的初级萃取剂是乙醇甲醇和水，Xu等采用的是体积比95：5的甲醇和二氯甲烷的混合物，萃取时间为35~60min；而Hoke等和Powell等都选择的是纯甲醇，所需萃取时间为16～48h。将南方红豆杉枝叶的细粉在45℃烘干，甲醇浸渍，搅拌过夜。在搅拌的不同时间内其提取出的10-DABⅢ的含量。可以看出，有机溶剂粗提时的浸渍搅拌时间应以12h左右为佳。
紫杉醇的提取工艺设计研究方案
紫杉醇提取纯化方法的研究进展 紫杉醇是最早从红豆杉属植物中分离出来的三环二菇类化合物，是继阿霉素和顺铂之后最热点的抗癌新药。紫杉醇具有复杂的化学结构，分子由3个主环构成二菇核，分子中有11个手性中心和多个取代基团，母环部分是一个复杂的四 环体系，有许多功能基团和立体化学特征。分子式C 47H 51 NO 14 ，分子量853.92。 同位素示踪表明, 紫杉醇只结合到聚合的微管上, 不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能,特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。 紫杉醇属于有丝分裂抑制剂,它的独特机制在于可以诱导和促进微管蛋白 聚合,促进微管装配及阻止微管的生理解聚,由此抑制癌细胞纺锤体的形成,阻止 有丝分裂的完成,使其停留在G2期和M期直至死亡,从而起到抗癌的作用。迄今为止紫杉醇是唯一促进微管聚合的新型抗癌药。这一新的发现引起了各国医药界的极大兴趣。现在已有包括我国在内的十多个国家批准了紫杉醇类药物的正式生产。目前有关紫杉醇研究的几个主要问题是:紫杉醇的提取;紫杉醇的人工合成;紫杉醇的临床应用(水不溶性问题的解决);紫杉醇的构效关系;紫杉醇的抗癌机理。紫杉醇的抗癌机理 1971年,Wani等报道了紫杉醇在一些实验体系中具有抗癌活性。1978 年,Schiff等发现紫杉醇在极低的浓度下(0.25μM)可以完全抑制Hela细胞的分裂,而且在对细胞4小时的培养过程中,对DNA、RNA和蛋白质的合成没有明显影响。
紫杉醇的合成
苏州大学研究生考试答卷封面 考试科目：有机合成考试得分：________________院别：材料与化学化工学部专业：分析化学 学生姓名：饶海英学号： 033 授课教师： 考试日期： 2012 年 1 月 8 日
天然抗癌药物紫杉醇的合成进展 摘要：本文对多烯紫杉醇的合成的各种合成方法进行了综述。 关键词：多烯紫杉醇合成抗癌 多烯紫杉醇(daxotere) 商品名为多西他赛(Docetaxel) , 化学名为 [ 2aR-( 2aα, 4β, 4aβ, 6β,9α, ( aR3, βS3) , 11α, 12α, 12aα, 12bα) ] -β- [ [ (1, 1 2二甲基乙氧基)羰基]氨基] -α-羟基苯丙酸[ 12b-乙酰氧-12 -苯甲酰氧-2a, 3, 4, 4a, 5, 6, 9,10, 11, 12, 12a, 12b -十二氢-4, 6, 11-三羟基-4a, 8,13, 13 -四甲基-5-氧代-7, 11-亚甲基-1H-环癸五烯并-[ 3, 4 ]苯并[ 1, 2-b ]氧杂丁环-9-基]酯,是法国罗纳普朗克·乐安公司开发的半合成紫杉醇的衍生物,它对晚期乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、头颈部癌、胃癌等均有效。其作用机制是通过与肿瘤细胞微管蛋白结合, 加强微管蛋白的聚合、抑制微管解聚,最终形成稳定的非功能性微管束, 从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂和增殖[1-3] 。 商业化生产的紫杉醇类抗癌药物大多采用半合成方法,这是现阶段最具经济性和可操作性的合成方法。多烯紫杉醇的半合成方法是利用从红豆杉属植物的针叶中提取的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ (10-DAB ) ,通过选择性保护部分羟基, 然后在10-DAB C 13 位的羟基上连接合成的手性侧链, 再去掉保护基团得到。其中以多 烯紫杉醇C 13 位侧链的合成以及该侧链与选择性保护的母核10-DAB进行酯化反应最为重要[4-5] 。 紫杉醇的构效关系已经被众多学者所研究和总结。具有游离羟基的C 13 位侧 链，C 2和C 4 位的酯基，C 4 、C 5 位四元含氧环及紫杉烷的刚性环结构对抗癌活性都起 着很重要的作用。 1988年，Potier等从欧洲紫杉(Taxus baccata)中分离得到10-去乙酰巴卡亭(Baccatin) Ⅲ( DAB)，DAB 已被成功地用来半合成紫杉醇，并已工业化生产[6]。半合成紫杉醇被认为是除人工种植外，扩大紫杉醇来源的最有效途径。随着对紫杉醇类似物构效关系的深入研究，第一个紫杉醇类似物的半合成药物多烯紫杉醇 被开发成功。多烯紫杉醇C 13侧链中C 3 N上叔丁氧羰基取代了紫杉醇的苯羰基，其 体外对微管解聚的抑制率是紫杉醇的2倍，抗癌谱也宽于紫杉醇，水溶性高出紫
紫杉醇提取工艺优化研究
紫杉醇提取工艺优化研究 赵万年 S1315004 立体依据 紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是Wani等[1]于1971年首次从短叶红豆杉(Taxus Bravifolia Nutt.)中分离得到的一种复杂的次生代谢产物，属二萜类化合物。其抗癌机理独特[2]，活性广谱高效，是目前所发现的惟一一种具有促进微管双聚体装配成微管, 使微管稳定, 从而阻碍细胞分裂, 将癌细胞停止在G2晚期或M期，最终导致癌细胞死亡[3]，抑制肿瘤生长的作用。由于紫杉醇的作用机理独特、疗效显著，因此已用于转移性卵巢癌、乳腺癌等的治疗，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。 虽然现在开发了多种紫杉醇的制备方法，利用半合成、全合成、生物合成、真菌发酵、植物组织细胞培养等技术手段获得紫杉醇的研究工作也取得了较大的进展［4-6］，但是要实现这些技术的工艺扩大和工业放大生产还存在一些问题，而从树皮中提取紫杉醇的工艺已经成熟且工业化，因此目前从植物中直接提取分离仍是紫杉醇的主要制备方法。但是，紫杉醇在植物中的含量非常低(含量最高的红豆杉树皮也只有万分之几)[7]，且类似物多，具有热敏性，产物在中间过程中易于分解、变性，不同产地、不同季节的植物资源成分相差甚远，因此分离提取工作难度很大。 目前紫杉醇的提取纯化工艺有溶剂萃取法、固相萃取法、制备色谱法、膜分离法、超临界萃取法、离子交换法、键合物解离法、药理作用靶点法和化学反应法[8-10]。这些工艺各有优缺点，其中溶剂萃取法和制备色谱法是最简单、最常用的方法，也已经成功应用于工业生产，但仍需改进。本课题以乙醇为提取溶剂，探求从南方红豆杉树叶中浸取紫杉醇的最佳提取条件，旨在为南方红豆杉这一药用植物资源的开发与利用提供试验依据。 研究目标 采用乙醇浸提方法，考查粉碎度、乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间
紫杉醇提取
紫杉醇最新提取工艺 摘要：紫杉醇为著名的抗肿瘤天然产物，来源有限，化学合成是制备紫杉醇的可能途径之一。本文主要综述了紫杉醇新的提炼方法主要是在天然提取分离、细胞培养、有机合成、紫杉醇的全合成基础上取得重要成就，从而改进得出的最新提取工艺路线。其最大的改进是少用了很多有机溶剂，为分离与纯化提供便捷。 关键词：紫杉醇；天然提取分离；细胞培养；合成 1 简介 1.1 发展史 从植物中寻找有效抗癌成分的历史至少可以追溯到公元前1500年关于纸莎草（papryrus）的研究，但真正对天然产物进行系统的科学研究却是从本世纪 50年代才开始的。50年代，Hartuell及其同事着重研究了抗癌制剂鬼臼毒素（PgdoPhyllotoxin）及其衍生物的应用。同时一系列寻找天然抗肿瘤成分的研究导致了象长春花碱（Vinblastlnc）、长春新碱（Vincristine）及秋水仙碱（Colchicine）等一系列具有代表性的抗癌药物的产生。1971年，Wanj及其同要从欧洲短叶红豆杉中分离得到一种具有细胞毒性的新化合物，命名为紫杉醇(Paclltaxel，现已商品化，其注册名为Taxol)，药理实验证明，它具有广谱抗癌作用，但由于其天然含量极低，故而在当时并未引起人们的注意，直到1977年，HorwitZ博士发现其抗癌机理在于能够与微管蛋白结合，促进微管蛋白聚合装配成微管二聚体，从而抑制细胞中微管的正常生理解聚，使细胞有丝分裂停止在G2期及M期，阻止了癌细胞的快速繁殖，这一机理与上述纺锤体毒性的抗癌药物（如长春新碱与秋水仙碱）的作用机制恰好相反，从而引起随后20多年关于该属植物的广泛研究。 1.2 自然资源
从天然植物中提取紫杉醇原料的最新工艺
Patent No. U.S. 6,759,539 Assignee: Chaichem Pharmaceuticals International, Laval, Canada Title or Subject: Process for Isolation and Purification of Paclitaxel from Natural Sources This is the first of three patents covering paclitaxel 10a that is a naturally occurring compound found in the bark of yew trees and has been shown to be useful in treating various cancer tumours. The amount of 10a obtained from the bark is low, and hence, large amounts of biomass and solvents are needed to obtain reasonable quantities. Synthetic procedures are under investigation. This patent, covering 10a and its derivatives, describes an improved process to extract 10a from twigs and needles of coniferous trees of the genus T axus. An earlier process from the same company to extract 10a involves several chromatography stages and recrystallisations, and it is not particularly amenable to large-scale production. The new procedure involves an initial aqueous extraction step to remove soluble impurities from the biomass. This is then followed by extraction of 10a with methanol, followed by its isolation by chromatography and crystallisation. The various stages of the process are summarised below: A porous bag containing twigs and needles of the tree is immersed in distilled water for 3 h at room temperature, the water is drained from the bag of biomass, and MeOH is added to the biomass in the tank at room temperature, the extract is collected and the solution concentrated by distilling off the MeOH, the crude solid is precipitated by addition of aqueous NaCl solution, collected by filtration, and then dried, the solid is dissolved in Me2CO, leaving resins and pigments, hexane is added to the solution to produce an oil that is collected and purified by low-pressure column chromatography at least once, the purified oil is dissolved in acetone and cooled to give crystals of 10a, and these may be recrystallised to improve the purity. --------------------------------------------------------------------------------
紫杉醇 红杉醇的提取分离纯化工艺
紫杉醇红杉醇的提取分离纯化工艺 紫杉醇(Pac lit axe l，商品名Ta xo1)是红豆杉属植物中独有的一种抗肿瘤天然药物，由美国化学家Wa ni和W allt等人于1971年首次分离得到，并于1992年被美国FDA正式批准为抗卵巢癌新药。由于其独特的抗癌作用机制及显著的疗效而被认为是近15年来天然抗癌药物研究领域最重大的发现。随着人们对紫杉醇研究的不断深入和完善，化学合成、基因工程、细胞培养、真菌发酵等方法均可以成功获得紫杉醇，但这些方法应用于紫杉醇的生产依旧停留在实验室研究阶段。目前，国内外紫杉醇的商业化规模生产多以红豆杉植物为原料，通过一系列的分离纯化获得。由于紫杉醇在红豆杉树皮中含量极低(<0．06％)，提取精制困难等原因，导致紫杉醇纯品价格昂贵。因此完善紫杉醇的提取纯化工艺，降低生产成本，得到更加便宜的原料对保障人类健康都具有重要的意义。 红杉醇是一种高效、低毒、安全可靠的治疗糖尿病的新药。 济南博纳生物技术有限公司通过与科研院校以及紫杉醇生产厂 家合作，开发了用于紫杉醇分离纯化的SKS-30-3氧化铝 SKP-10-4300层析树脂，并率先在提取工程中使用了陶瓷滤和纳滤，使原有生产工艺多次萃取、三步层析变为两次萃取两步层析，使得产品的产品纯度提高到98.5%以上，收率提高20%以上。并针对该产品副产品红杉醇的性质，用SKP-20-8300层析树脂对该产品进行富集洗脱析晶可以得到纯度99%以上的产品。
1、20目以上红豆杉干品甲醇水浸提陶瓷滤纳滤浓缩液含紫杉醇纳滤透过液含红杉醇。 2、纳滤浓缩液萃取浓缩 SKS-30-3氧化铝转化层析分段收集所需组分浓缩回收溶剂甲醇水溶解 SKP-10-4300层析树脂收集所需组分洗脱液纳滤浓缩结晶得紫杉醇。 3、纳滤透过液浓缩盐水溶解 SKP-20-8300层析树脂收集所需组分，浓缩结晶得红杉醇。 SKS-30-3氧化铝 SKP-10-4300层析树脂 SKP-20-8300层析树脂是济南博纳生物技术有限公司针对紫杉醇红杉醇提取开发的新型层析填料，SKP-10-4300层析树脂和SKS-30-3氧化铝的连用可以完全替代高压制备液相C18分离纯化，使紫杉醇的最后精制不再受设备的限制，在低压条件下就能够完成产品的较好的分离，包括紫杉烷类10-D ABⅢ、含7-木糖基类等副产品。将作为废液的处理的红杉醇得到很好的分离。
抗癌药物紫杉醇
抗癌药物紫杉醇 简介 1963年美国化学家瓦尼（M.C. Wani ）和沃尔（Monre E. Wall ）首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew ）树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，Wani 和 Wall 发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成份。由于该活性成份在植物中含量极低，直到1971年，他们才同杜克（Duke ）大学的化学教授姆克法尔（Andre T. McPhail ）合作，通过x-射线分析确定了该活性成份的化学结构——一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（taxol ）。 紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物, 也是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。同位素示踪表明, 紫杉醇只结合到聚合的微管上, 不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能,特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。 通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。 主要性质 【英文名称】 Paclitaxel 【别 名】 泰素，紫素，特素 【化学名称】 5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[（2’R ，3’S ）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯] 【分 子 式】 145147NO H C 【分 子 量】 853.92 【CA S NO 】 33069-62-4 【产品来源】 为红豆杉科植物红豆杉的干燥根、枝叶以及树皮。 【规格含量】 99.5% 【物理性质】 白色结晶体粉末。无臭，无味。不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。
紫杉醇提取实验方案
实验名称：紫杉醇的提取 实验探究条件： 1、原材料：红豆杉树枝、红豆杉树皮、红豆沙树叶、三者混合； 2、烘干时的温度：40℃、60℃、80℃； 3、粉碎状态：完全不粉碎、粉碎至40目、粉碎至60目、粉碎至80目、粉碎至100目； 4、有机溶剂选取：95%甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯：丙酮=1:1； 5、层析介质选取：硅胶、氧化铝、C18、苯基柱、树脂。 实验器材： 实验仪器： 实验原料： 实验过程 1、红豆杉枝叶、树皮、树枝：采集新鲜的红豆杉树枝、树皮、叶，用清水洗净； 2、干燥与粉碎：于60℃烘箱内干燥至恒重，用粉碎机粉碎至100目，分别准确称取过筛后的各种样品2g，置50mL磨口具塞三角瓶中； 3、有机溶剂提取：加入95%乙醇20mL，超声萃取30min，留上清液，沉淀复加20mL 95%乙醇，重复操作； 4、浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中； 5、萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯（按物料：醋酸乙酯=1：1），萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。 6、浸膏：合并上清液，过滤除渣，滤液于30℃减压蒸干，得浸膏；下层清液作为10-DAB 的原材料保存好，详细步骤见最后； 7、固液萃取：浸膏用20mL甲醇溶解，加入石油醚(60～90℃)(体积比1∶1)，振荡30min，脱脂； 8、液液萃取：萃取余液用三氯甲烷(体积比2∶1)振荡30min，褪色，若褪色不彻底应反复进行； 9、沉淀：由于紫杉醇有在正己烷中沉淀这一特性，所以向液液萃取后得到的紫杉醇乙酸乙酯溶液中加入体积比为10：1的正己烷溶剂，将紫杉醇沉淀下来。（较少时，紫杉醇不能
紫杉醇提取实验方案
紫杉醇提取实验方案 实验名称:紫杉醇的提取 实验探究条件: 1、原材料:红豆杉树枝、红豆杉树皮、红豆沙树叶、三者混合; 2、烘干时的温度:40?、60?、80?; 3、粉碎状态:完全不粉碎、粉碎至40目、粉碎至60目、粉碎至80目、粉碎 至100目; 4、有机溶剂选取:95%甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯:丙酮=1:1; 5、层析介质选取:硅胶、氧化铝、C18、苯基柱、树脂。 实验器材: 实验仪器: 实验原料: 实验过程 1、红豆杉枝叶、树皮、树枝:采集新鲜的红豆杉树枝、树皮、叶，用清水洗净; 2、干燥与粉碎:于60?烘箱内干燥至恒重，用粉碎机粉碎至100目，分别准确 称取过后的各种样品2g，置50mL磨口具塞三角瓶中; 筛 3、有机溶剂提取:加入95%乙醇20mL，超声萃取30min，留上清液，沉淀复加 20mL 95%乙醇，重复操作; 4、浓缩:浓缩温度控制在45?5?，真空度控制在-0.07?00.1Mpa，浸提液浓缩至 比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中; 5、萃取:将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯(按物料:醋酸乙酯 =1:1)，萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入 浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在45?5?，待浓缩液比重达到1.40?0.05时， 将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。
6、浸膏:合并上清液，过滤除渣，滤液于30?减压蒸干，得浸膏;下层清液作为10-DAB的原材料保存好，详细步骤见最后; 7、固液萃取:浸膏用20mL甲醇溶解，加入石油醚(60,90?)(体积比1?1)，振荡30min，脱脂; 8、液液萃取:萃取余液用三氯甲烷(体积比2?1)振荡30min，褪色，若褪色不彻底应反复进行; 9、沉淀:由于紫杉醇有在正己烷中沉淀这一特性，所以向液液萃取后得到的紫杉醇乙酸乙酯溶液中加入体积比为10:1的正己烷溶剂，将紫杉醇沉淀下来。(较少时，紫杉醇不能 完全沉淀;较多时，不但没有提高杂质去除量，还会造成正己烷使用量过大，溶剂浪费。); 10、层析:配制不同极性的淋洗液(乙酸乙酯:正已烷=3:7和3:2两种淋洗液)淋洗，根据检测结果分别收集不同组分，将含紫杉醇的收集液选出，浓缩。层析详细步骤见文档2; 11、脱色:加甲醇溶解后，按(物料:活性碳=3:1)称取一定量的活性碳脱色; 12、结晶:将层析后的组分减压浓缩后，按比例溶解在甲醇(8mL/g)中，水浴加热到50?，同时在搅拌的情况下缓缓滴入1/3甲醇体积的双蒸水，4?冷却放置48h 以上即可获得呈白色发黄的紫杉醇针状晶体; 13、HPLC检测:流动相为甲醇:水=65:35，进样量为10μL，流量为 1.0mL/m1n，检测波长为227nm检测。用甲醇配置浓度为0.1mg/mL的紫杉醇标准品溶液，分别以10、12、14、16、18、20μL的进样量进行HPLC分析并绘制标准曲线。详细步骤见文档3。 其他文献中提到需要注意的地方