黄粉虫蛋白提取工艺的研究进展

第一种方法 蛋白匀浆缓冲液： 50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl 5 mM EDTA 1 % NP-40 1 mM PMSF 操作步骤 直接用这个进行组织匀浆 然后于10000 rpm 离心20分钟收集上清 作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内。 将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。70v浓缩，150v分离 第二种方法 裂解液配方： 尿素：8M CHAPS:4% DTT:65mM(现加）PMSF:1mM(现加）MiliQ 水操作步骤： 取300mg样品在液氮环境下研磨， 加入1ml裂解液混匀， 室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻）， 15000g离心1小时， 取上清测定蛋白质浓度。 在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以

除去。建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的,所以IEF前一定要加，裂解液中没有IPG buffer可以么？ （可以的，最后上胶条的时候可以再加） 不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下，把一些结缔组织给离心掉（150g既可）然后再加裂解液。裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋白的浓度。用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好） 第三种方法 建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热 做过的是用10ml蛋白裂解液来匀浆3克的组织，最终用考马斯亮兰染色法测得的蛋白浓度大概为30~50 ug/ul 测595 OD值时，设定一个只用水的空白，把所有测得的值都减去这个空白。再用减后的值做标准曲线。查得未知蛋白浓度时，也要用减后的值在标准曲线上查得。 培养细胞 细胞培养于100 mL/L FCS+RPMI1640培养基中，待生长至对数生长期密度约为80%时用细胞括括下细胞离心收集．按细胞/裂解液体积比1:10加入细胞裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫

经济昆虫黄粉虫初探 摘要：本文对我国黄粉虫Tenebrio m olitor (L. )的养殖历史，形态鉴定特征，生物学习性，饲养方法以及实用价值做了初步的归纳和总结，并在此基础上预测了该种资源昆虫的发展前景。 关键词：黄粉虫养殖实用价值发展前景 黄粉虫Tenebrio m olitor (L. )属鞘翅目、拟步甲科,别名面包虫、高蛋白虫等,世界性分布,原产于美洲, 20世纪50年代由前苏联传入我国。原为贮藏物害虫,国内于1963年开始研究与描述,为分类鉴定提供了依据。。黄粉虫的人工饲养已有100余年历史,国内外均有民间饲养的记载,是一种传统活体饵料。目前主要作为新型动物蛋白来源、科学研究材料,在饲料、食品和医药保健品以及抗菌蛋白等方面具有很高的综合利用价值。进入新世纪,黄粉虫的资源价值越来越被社会所发掘和重视, 2001～2003年国家农业部将“黄粉虫工厂化生产技术的示范推广”列入丰收计划项目,使黄粉虫的人工生产养殖技术向高效标准化规模养殖模式发展,并且涌现出许多专业化的公司和企业,带动了产业化发展,极大地推动了这一珍贵昆虫蛋白资源的利用[1]。 1.形态特征 黄粉虫属于全变态类昆虫，其整个生长发育过程分为成虫、卵、幼虫、蛹4个阶段。 1.1 成虫 体长约15～20毫米，虫体为长椭圆形，体色初羽化时为乳白色，后逐渐变为黄白色、黄褐色、黑褐色，最后呈黑赤褐色即为性成熟期，开始进行交配。体面多密集黑斑点，无毛，有光泽。黄粉虫成虫食性杂。不能飞行，爬行速度快。喜黑暗，怕光，夜间活动较多。在一定条件下，成虫有自相残杀习性，但比幼虫要轻得多。初羽化的成虫为乳白色，隔2天后逐渐变为坚硬的黄褐、红褐，4～5天后变为黑色，开始交配、产卵。成虫的寿命在50～160天，一般寿命为60～90天，平均寿命达50天以上。 1.2 卵 卵长1～1.5毫米，长圆形，乳白色，卵壳较脆软，易破裂。黄粉虫成虫在产卵的同时分泌大量黏液，包裹于卵壳外，粘附食物碎屑及粪便，可以起到保护卵的作用，同时可以保证幼虫孵化后及时直接食用饲料和卵壳。卵常产于饲料或粉状物中。 1.3 幼虫 幼虫初孵化时仅有2～3毫米，为乳白色；以后随着龄期的增加，体长增加；各龄幼虫在蜕皮时为乳白色，随着生长，体色加深，逐步变为黄白色、浅黄褐色；老熟幼虫一般体长28～35毫米，身体前后粗细基本一致，体径约为5～7毫米，体壁较硬，无大毛，有光泽；虫体为黄褐色。头壳较硬，为深褐色。幼虫生长期一般为80～130天，。幼虫蜕皮时常爬浮于群体及饲料的表面。，幼虫耐饥可达6个月以上。在饲料供给量不足或水分缺乏的情况下，幼虫自相残杀的习性表现更加充分。 1.4 蛹 长约15～19毫米，乳白色或黄褐色，无毛，有光泽。腹部末节腹面有一对不分节的乳状突，雌蛹乳突大而明显，端部扁平，向两边弯曲，雄蛹乳突较小，不

碱性蛋白酶提取花生水解蛋白 摘要： 利用碱性蛋白酶从冷榨花生饼中提取花生水解蛋白。研究了温度、pH 值、加酶量、液固比、水解时间对蛋白质提取率的影响,确定最佳工艺参数为温度55 ℃、pH9.0、加酶量是0.8%、水解时间3 h、液固比7∶1, 在此条件下蛋白质提取率为81.32%。 1、材料与方法 （1）实验材料 冷榨花生饼(蛋白质48.09%, 脂肪8.74%, 粗纤维 4.71%); 碱性蛋白酶(2.4 AU/g)； 主要仪器设备： SC- A型精密恒温水槽, 868 型酸度计, 78- 1 型磁力搅拌器, UV- 2100 紫外可见光分光光度计, 酶反应器。 （2）实验方法 花生水解蛋白的提取：一定质量花生饼(粉碎过80 目筛)与蒸馏水按一定比例加入酶反应器中, 恒温搅拌一定时间, 调节pH 值至适宜, 加入一定量酶进行水解, 并维持反应液pH恒定(变化范围±0.01)。反应结束后, 沸水浴中灭酶5 min, 3000 r/min 离心20min, 收集上清液, 残渣用2 倍体积水洗涤, 合并两次离心所得上清液, 计量体积, Folin- 酚法，测定其中蛋白含量。

蛋白质提取率的计算： 花生蛋白提取率(%)=(提取的上清液蛋白质质量/原料中蛋白质质量)×100% 2、结果与分析 （1）温度对蛋白质提取率的影响在加酶量0.4%,pH8.0, 液固比7∶1, 水解时间 3 h 时, 考察了温度对蛋白提取率的影响, 结果如图 1 所示。 由图1 可知, 随着温度升高, 蛋白质提取率逐渐提高, 当温度达到55 ℃, 蛋白质提取率最高。当温度>55 ℃时, 随温度升高蛋白质提取率反而降低, 其原因可能是超过酶最适温度, 酶分子空间结构发生改变, 导致酶活性减弱或丧失。（2）pH 值对蛋白质提取率的影响在温度55 ℃,加酶量0.4%, 液固比7∶1, 时间3 h 时, 考察了pH值对蛋白提

黄粉虫养殖（骗子）技术 注意：如果你想养殖黄粉虫和蜈蚣的建议你上网查一下“养殖蜈蚣的骗局”！本文档只作理想主义者的参考！（很多都是不可能做到的！） 一、黄粉虫简单介绍 黄粉虫属干节肢动物门，昆虫纲，鞘翅目，拟步甲虫科昆虫。原产北美洲，50年代从苏联引进我国饲养，黄粉虫干品含脂肪30%，含蛋白质高达50%以上，此外还含有磷、钾、铁、钠、铝等常量元素和多种微量元素。因干燥的黄粉虫幼虫合蛋白质40%左右、蛹含57%成虫含60%（据《中药科技报》报道)。被誉为“蛋白质饲料宝库”。有人声称试验后:它是养殖蜘蛛、蜈蚣、蝎子、蛇以及家禽家畜的最佳饲料，用黄粉虫作饲料基本能够让它们快速生长发育和繁殖。因其营养丰富又称面包虫、蛋白虫，其营养价值远远超出同类科目的其他昆虫，可作为高蛋白鲜活饲料，国内外著名动物园都用其作为繁殖名贵珍禽、水产的肉食饲料之一。

由于黄粉虫体内含有较高的蛋白质、脂肪、糖类等营养物质，汁多体软、生活力强，极易饲养。故被国家的动物园以及各地养殖场选作上好饲料。老熟幼虫最大体长可达到7公分，单条虫重1.3g---1.5g黄粉虫具有食性杂、适应能力强、生长快，生命力强，繁殖率高等特点，其主要食物为麦麸、玉米面、农作物秸秆、蔬菜等。人工饲养方法简单，具有经济效益高饲料来源广，设施简单，易饲养、易管理，无疫病，适应农村、城镇居民饲养的特点 二、黄粉虫的用途 1、作原形食品与面包; 2、替代鱼骨粉、肉骨粉作蛋白饲料; 3、作调味品，制作各种方便面调料; 4、用干特种养殖，如饲喂林蛙、蜈蚣、蝎子、蛤蚧、鳖、鳝鱼、蜗牛、壁虎和蛇及各类观赏鱼等 5、制作小食品如月饼、锅巴、饼干等; 6、制作成汉虾酱 7、制作各种菜肴; 8、大麦虫油脂可制备降低血液胆固醇的药物、人造奶油、表面活性剂中间体等，同时也可用于制皂、大古油及增塑 9、制作复合氨基酸口服液; 10、制作营养保健酒; 11.虫蜕、成虫壳可提取甲壳素、生产壳聚糖;作为饲料添加剂可替代激素和抗生素 12、虫粪可作高效生物有机肥、用作诱食剂、饲料添加剂、高效花肥等。 据有关专家研究表明，黄粉生活性蛋白不仅含有大量对人体有着特殊作用的几丁质、抗菌肤防御素和外源性凝集素;还富含人体必需的多种氨基酸种蛋白质、游离氨基酸、维生素、矿物元素、不饱和脂肪酸等多种营养成分且与人的正常比例一致，很容易被吸收和利用。用大麦虫做的食品味道鲜，营养高;国外著名生物制品企业都用大麦虫制作营养保健品，可提高人体免疫为，抗疲劳，延缓衰老降低血脂抗癌等功效。 三、黄粉虫生活习性 黄粉虫生性好动，昼夜都有活动现象一般发生3一4代，世代重叠，无越冬现象，冬季仍能正常发育。黄粉虫对气温的要求以26-30摄氏度最合适。但在养殖过程中，由于群体密度很高，几乎是堆积式养殖，因此群体内温度往往比气温高出8—10摄氏度，当室内气温达到26摄氏度时，黄粉虫便己感觉不适，当室内气温高于32摄氏度时，黄粉虫的幼虫有可能受热而死，此时应紧急降温或紧急疏散群体。黄粉虫相对较耐低温，幼虫在8摄氏度时即开始生长，老龄幼虫在零下4摄氏度时也不会冻死，但低龄幼虫在0摄氏度时便有可能冻死。 黄粉虫卵期7-8天，幼虫期122天，蛹期8天，从卵发育至成虫约需133天;在28-30℃下卵期3-6天，幼虫期100天，蛹期6天，卵发育至成虫只需110天。幼虫对饲料最佳湿度要求为15%，低干10%时，黄粉虫仍能在饲料中生存，只是生长慢些，空气的最佳相对湿度要求为70%。当饲料湿度高于18%，空气湿度高于85%时，黄粉虫生长速度减慢，且容易患病，成虫尤其如此。湿度对其繁殖影响也很大，相对湿度以60-70%为适宜，过高湿度达90%时，幼虫生长到2-3龄即大部分死亡，低于50%时，产卵量大量减少。成虫羽化率达90%以上，性别比1: 1，喜群居性喜暗光，黄昏后洗动较盛。羽化后的经3天交尾产卵，夜间产卵在饲料上面，每条雌虫可产卵约200余粒，常数十粒粘在一起，表面粘有食料碎屑物，卵壳薄而软，雌虫寿命1-3个月不等，产卵一半月后，产卵量下降，可以淘汰。黄粉虫属杂食性昆虫，各种粮食、油料作物的籽实类，糠数类，渣饼类，各种叶菜类，某些树叶，豆科作物的茎叶及一些昆虫尸体等皆可成为其食物，饲养黄粉虫时，通常以数皮、米糠加上菜叶为主要饲料。 （四）黄粉虫养殖技术 1,养殖技术 〔一)成虫期蛹羽化成虫的过程大约3--7天，头、胸、足、翅先羽出，腹、尾后羽出。因为是同步挑蛹羽化，所以几天内可全部完成羽化，刚羽化的成虫很稚嫩，不大活动约5天后体色变深，鞘翅变硬。雄雌成虫群集交尾时一般都在暗处，交尾时间较长，产卵时雌虫尾部插在筛孔中产出，这个时期最好不要随意搅动。发现筛盘底部附着一层卵粒时，就可以换盘。这时将成虫筛卵后放在盛有饲料的另一盘中，拨出死虫。5---7天换一次卵盘。成虫存活期在50天左右，产卵期的成虫需要大量的营养和水分，所以必须及时添加麦数子和菜，也可增加点鱼粉。若营养不足，成虫间会互相咬杀，造成损失。

提蛋白及WB的步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作：前一天准备：借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、 当天准备：洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记离心管及离心管、细胞刮板、 开低温高速离心机 细胞裂解液配制： 1ml cell lysis 10ul NP-40（离心机后） 25ul 焦磷酸钠 40ul NaF 1ul β-甘油磷酸 2 ul Na3VO4 1ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱） 10ul PMSF（最后加，随加随用，有毒） 细胞裂解和收集 1.观察细胞状态，并准备提蛋白：吸走培养基、用PBS洗细胞两次（倾斜贴壁加PBS，左 右轻轻摇），倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐：一般106加），冰上静置1-2min。 3.刮细胞：细胞刮板每次用之前拿水涮一涮，甩干，然后从中间到外面打圈刮，再从下往 上，从上往下全面刮，（刮的时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管。 细胞破碎 4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块，三个小夹子。（超声波破碎仪的铁棒不 要碰到离心管的壁和底部） 超声波设置： 工作功率5% 工作时间3min 开机时间15s，关机时间30s 温度0度， 报警温度1度 5.4℃、13000r/min，离心15min。（离心机用后一直保持打开的状态，） 蛋白保存 6.蛋白保存及分装：吸上清液至离心管，涡旋、吸一半至另一个管中，涡旋。-80℃保存。注意事项：PMSF一定要现用现加，PMSF在水溶液中不稳定，30min内就会降解一半。样品处理超过1h，补加一次。

BCA测定蛋白浓度 1、测空白板，选差异较小的孔。 BCA测定法波长570，Bracford：595 2、标准蛋白的稀释（5mg/ul）：分装1ml PBS来使用，稀释标准蛋白至ul。 取5ul标准蛋白+45ul PBS 3、加样： 浓度0 BSA（ul）0481216 PBS（ul）20161284 4、样品蛋白稀释20倍：2ul蛋白+18ul PBS 5、配BCA：每个孔200ul，一个样品2个重复，A:B=50:1,根据样品数来计算BCA的用量， 一般防止损耗，多算一个样。 6、加BCA：悬空加、37℃孵育30 min。（手不能碰板的底部，影响测定结果） 7、计时30min 8、配分离胶，灌胶，加水封。 9、计时20min。 10、测蛋白：先振板、再设置参数。 11、计算上样体积: 12、配浓缩胶，灌胶，加梳子，等1-2min，出现缩胶的地方补上。 13、打开干式加热器 10、蛋白质上样：根据计算结果乘以稀释倍数，算出蛋白浓度，以体积最大的为准，其他用 水补足。(最大上样量为20ul，除去buffer的体积，蛋白质最大上样体积为16ul) 标记离心管 加样顺序：水、buffer(1/4)、蛋白、离心-涡旋-离心。100℃变性10min（迅速，确保变性程度一致） 11、计时10min ，变性10min。 12、安装电泳槽: 电泳液（1X）：配制：90ml（10X）+810ml水（只能用一次） 液面刚覆盖胶，不能有气泡。 13、上样：maker 上样量为3ul。依次上样（吸样品时最好一次吸完）枪头不能撬板，笔直打进去 14、电泳 分离胶100V，20min左右、条带都跑开即可。 浓缩胶145V 1h 有等紫色部分跑到底结束。 转膜 准备工作：转移缓冲液(只能用2次)、三层滤纸、海绵、PVDF膜 PVDF膜用之前用甲醇浸泡数秒。 用海绵和滤纸之前先浸湿。 转膜：负极（黑板）海绵-三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-正极（白板）。 三层滤纸和膜都需要赶气泡。

1.单层贴壁细胞总蛋白的提取： （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4 ）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5 ）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6 ）于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷） （7 ）将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于－20℃保存。 2. 组织中总蛋白的提取： （1 ）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 （2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。 （3 ）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 （4）裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。 3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： （1 ）将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。 （2 ）弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 （3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 （4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。 含量测定

黄粉虫深加工 四川农业大学食品质量与安全 09级01班刘春满学号：20095349 一、简介： 黄粉虫俗称面包虫，黄粉虫为多汁软体昆虫，脂肪含量30%，蛋白质含量高达50％以上，此外还含有磷、钾、铁、钠、铝等常量元素和多种微量元素及动物生长所必需的16种氨基酸，每100克干品含氨基酸高达847.91毫克，其各种营养成份居各类饲料之首。 二、用途： 1、养殖奇珍动物的生物饲料 2、提取高级甲壳质，用于医疗保健，化妆品。 3、环保型生物肥料，黄粉虫粪是高级生物肥料 4、直接走上餐桌，供人类食用，富含多种氨基酸，提供人类不能合成的动物氨基酸。成虫和蛹虫都可以直接作成多种菜肴，还可作成食品罐头，汉虾粉等 三、目前开发出的产品主要有： 1、油炸黄粉虫黄粉虫的幼虫、蛹经过排杂处理、烫漂、沥干水分，再经过爆炒或油炸，加入调味料即可食用。营养丰富，风味独特。 2、速冻黄粉虫将黄粉虫洗净，经过排杂处理后整形、挑选，然后装入食品级塑料袋中封口，送到速冻车间速冻，产品可在-18℃贮藏。 3、黄粉虫罐头的加工选择体态完整的黄粉虫幼虫或蛹，经过清蒸、红烧、油炸、五香腌制等不同的调味工艺，制成风味各异的罐头，使其具有耐贮藏、营养丰富、口味独特、食用方便的特点。工艺流程为： 虫体清理除杂→清洗→固化→调味→装罐→排气→密封→杀菌→保温检验→冷却→成品 4、“汉虾粉”系列产品的制作黄粉虫经排杂处理，再经消毒、固化、烘干后磨成粉，称为“汉虾粉”。

具体工艺流程如下： 虫体清理去杂→清洗→固化→脱色→烘烤→研磨→筛分→成品 5、黄粉虫虫浆的加工选用鲜黄粉虫经过去杂处理，清除消化道内分泌物，然后清洗干净，磨浆，同时配以食用油、豆粉、芝麻、辣椒等辅料，配制成酥糖馅、月饼馅等各种点心馅来制作加工点心。其工艺流程如下： 鲜黄粉虫→清理去杂→清洗→磨浆→调配→成品 6、黄粉虫酱油的加工选用体态完整、气味正常、无腐烂的新鲜黄粉虫，经严格清理除杂，加水磨浆，然后调pH值，加入酶水解蛋白质，再经过滤、杀菌、调味调色等工序制成。黄粉虫酱油营养丰富，味道鲜美，香味浓郁，无不良后味。经检测，氨基酸含量较高，富含钠、钾、铁、钙等多种微量元素，维生素和一些功能性成分，兑5倍水后的味道可与普通酱油相媲美，因此该产品是一种营养价值高、很有发展前途的调味品。具体工艺流程如下： 鲜黄粉虫→清洗→拣选→加3倍水磨浆→调pH值→加酶水解→水浴加热→灭酶→粗虑→调pH值→杀菌→调味调色→搅拌→过滤→分装→封口→检验→成品7、黄粉虫保健酒的加工选用老熟的黄粉虫，经清理去杂、固化、烘干脱水后，配以红枣、枸杞放入白酒中浸泡1-2个月即成。这种补酒颜色红润、口味甘醇，具有安神、养心、健脾、通络活血等功效。此外，还可以通过向白酒里面添加黄粉虫粉末的方法，使里面的有效成分浸提完全，以提高虫酒的保健功能。 8、黄粉虫干幼虫按标准工艺烘干而成。 9、昆虫蛋白粉黄粉虫经严格工艺深加工提炼而成。 10、虫油黄粉虫经严格工艺深加工提炼而成。黄粉虫油脂可制备降低血液胆固醇的药物、人造奶油、表面活性剂中间体等，也可用于制皂、太古油及增塑剂。 11、制作小食品月饼、锅巴、饼干等。 12、作调味粉制作各种方便面调料，可制作成汉虾酱，辣椒油。 13、制作复合氨基酸口服液 四、黄粉虫蛋白质的利用 黄粉虫幼虫蛋白质含量高，目前随着黄粉虫饲养业的不断发展，其资源日益丰富，研究开发黄粉虫蛋白质资源，对于开辟新的蛋白质资源，促进黄粉虫饲养

细胞总蛋白提取方法 一、溶液配制 1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml 称取NaF 41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。 2.100 mM PMSF 3.RIPA溶液100ml 成分分子量终浓度 Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4) NaCl 58.44 0.87 g 150 mM EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM NP-40 1 ml 1% SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100 ml。 ※使用前加入 成分储存浓度加入量终浓度 PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl Leupetin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl 二、方法 1.细胞收取 1)细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞 2)弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。 3)加入0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。 4)待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml ependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃ 5)弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×

6)重复PBS清洗一次 7)弃上清，-80℃冻存待裂解 2.蛋白提取 1)向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS 1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin) 后冰上放置40mins 2)10,000rpm×15min，4℃ 将上清转移至一个新的ependorf 管中（约250μl）

蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。 拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。 蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽然有了不改进，但其主要原理仍不外乎两个方面： 一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等； 二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。 制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态分为差速离心、超滤、分子筛及透析等方法；按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法；按电荷差异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等；按生物功能专一性有亲合层析法等。 由于不同生物大分子结构及理化性质不同，分离方法也不一样。即同一类生物大分子由于选用材料不同，使用方法差别也很大。因此很难有一个统一标准的方法对任何蛋白质均可循用。因此实验前应进行充分调查研究，查阅有关文献资料，对欲分离提纯物质的物理、化学及生物学性质先有一定了解，然后

黄粉虫的利用价值及开发前景 2012级动特2班吴贵辉（20120732） 摘要：黄粉虫，也叫面包虫，是鸟、龟、蝎、蛇、鱼、林蛙等的饲料，也是 具有高蛋白、低脂肪和奇香特点的绿色昆虫食品，目前主要以出口为主，在国际市场供不应求。昆虫活性蛋白被誉为21世纪人类的全营养食品！据有关专家研究表明，昆虫活性蛋白不仅含有大量对人体有着特殊作用的几丁质、抗菌肽防御素和外源性凝集素；还富含人体必需的九种氨基酸和蛋白质、游离氨基酸、维生素、矿物质元素、不饱和脂肪酸等多种营养成分，且与人体的正常比例一致，很容易被吸收和利用，被昆虫专家称为是继家蚕和蜜蜂之后的第三大昆虫产业，发展前景极为光明。 关键词：黄粉虫；价值；前景 前言：黄粉虫在昆虫分类学上隶属于鞘翅目，拟步行科，粉虫甲属。为多汁软 体昆虫，脂肪含量30%，蛋白质含量高达50％以上，鞘翅目的几种幼虫粗蛋白质含量在23%-66%之间[12] ，此外还含有磷、钾、铁、钠、铝等常量元素和多种微量元素及动物生长所必需的16种氨基酸，每100克干品含氨基酸高达847.91毫克，其各种营养成份居各类饲料之首。而且其具有食性杂、适应能力强、生长快、生命力强、繁殖率高等特点，其主要食物为麦麸、玉米面、农作物秸秆、蔬菜等。是一类非常值得开发的食品资源【1】。 人类食用价值 黄粉虫富含蛋白质、维生素、矿物质等营养成分，蛋白质的含量大大高于鸡蛋、牛肉、羊肉等常规动物性食品，且有易于消化吸收，是优良的蛋白食品。黄粉虫也是口感好、风味独特、易于被消费者接受的一种食品昆虫。可以烘烤、煎炸、加工成具有果仁味的蛋白饮品、精制蛋白粉、酒精饮品、氨基酸口服液等多种形式的食品。 黄粉虫不仅蛋白质含量丰富，且所含氨基酸的种类齐全，可以作为人体必需氨基酸的来源；此外，黄粉虫还含有丰富的不饱和脂肪酸，其中亚油酸的含量高达24.1%；黄粉虫的矿质元素含量也很丰富，除钾、钙、镁、磷的含量明显高于一般的动物食品外，铁、锌、铜、硒等微量元素也远远高于一般动物食品，特别是通过黄粉虫的生物富积作用使锌、硒等元素的含量大大增加，从而使黄粉虫具有更高的保健价值。 现在黄粉虫还被做成了各种菜肴端上了人类的餐桌，而且别具风味，例如： 1、麻辣虫蛹 将黄粉虫蛹或幼虫洗净，油炸至微黄，然后拌入麻辣酱即可食用，特点是鲜香可口，风味独特。 2、糖醋虫蛹 可按糖醋鱼方法制作。将黄粉虫蛹或幼虫洗净，油炸至微黄，然后拌入糖醋

课程设计说明书 课程名称：生物分离工程 设计题目：牛血清白蛋白的分离提纯工艺 院系：环境与化学工程学院 学生姓名：孙盼盼 学号：41004020111 专业班级：10级生物工程01班 指导教师：王晓军 2013年6月20日

目录 1.设计任务书 (1) 2.设计背景 (1) 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 (1) 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 (1) 3.设计原理 (2) 4.设计工艺流程及设计方案说明 (2) 4.1对原材料的粗分级分离 (3) 4.2对粗分离成分进行细分级分离 (3) 4.3 蛋白的结晶与重结晶 (3) 4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定 (3) 4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程 (3) 5.操作过程 (4) 5.1蛋白质分离的准备阶段 (4) 5.2细分级分离设备的设计 (4) 5.3蛋白质的纯度鉴定 (8) 6.参考文献 (8) 7.课程设计心得 (9)

1.设计任务书 现有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量：57000Da，pI 4.5）、β-乳球蛋白（分子量：35000Da，pI 5.1）、α-乳白蛋白（分子量：14000Da，pI 4.2）和牛血清白蛋白（分子量：66200Da，pI 4.7），设计一个分离纯化工艺纯化其中的牛血清白蛋白。 2.设计背景 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 蛋白质是（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。 蛋白质具有很多生物化学共性，运用相关性质进行蛋白质的分离制备多种不同的单一蛋白质，更好的为人们所有。蛋白质的分离提纯技术已经很成熟，相关的工艺流程包含各种不同的分离提纯设备，这些设备运用蛋白质的不同原理对其进行分离纯化，单一蛋白质的分离提纯在现实生活中具有重要意义！ 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫

蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

细胞的总蛋白质提取全 过程及经验 The manuscript was revised on the evening of 2021

细胞的总蛋白质提取全过程及经验 如果你要自己裂解细胞的时候，需要注意的事项：师兄给你的细胞要赶紧裂解，当然了，你还要看是带瓶子给你还是消化好给你的。一般我使用的时候，是将细胞统一从几个培养瓶中消化收集起来，然后赶紧4 度下离心，用预冷的PBS 或者生理盐水洗涤细胞。也有人喜欢在培养瓶中直接加裂解液，这个一般都是做 western 什么用的，需要的蛋白量不是很多，而且大部分时候都是要有活性的蛋白的。一般1000rpm 足够离心了，转速太快，细胞会破碎，然后会损失蛋白。PBS 洗涤的最后一遍，记得将细胞转移到超声管中，也许是由于普通的10mL 离心管有可能承受不了超声的能量吧，我们师兄师姐一般都用超声管来自装细胞，然后加入裂解液直接超声。3s 每次，间歇3s 60 次，400W，重复工作复位2 次，总共超声180 次就差不多了。裂解后的细胞要赶紧在2500g 下离心30-60min，超声管是没有盖子的，可以直接在上面加一层封口膜离心。在离心的时候，去配制沉淀液，丙酮：无水乙醇：冰乙酸=50:50:，体积比。一般我加的是裂解液体积的5 倍。沉淀液要预冷，我喜欢将沉淀液放在-20 度下。细胞离心后，上清液加入到沉淀液中，就会看到比较多的白色沉淀出现，-20 度沉淀>2h，然后就可以高速沉淀下蛋白了。这里我们用的体积比较大，一般的离心管不能用，要用 beckman 专用的那种50mL 离心管，25000g，15-30min。Beckman 离心管比较大，底部是平的，所以蛋白在底部并不是很牢固，在弃去上清液的时候，一定要注意用枪头缓慢的吸出！然后用5mL 做有的丙酮洗涤一遍，再用75%酒精将蛋白转移到4mL 的离心管中，当然，如果你的蛋白很少，的EP tube 也可以使用。之所以用4mL 是因为我每次提取的蛋白量大概>10mg，而冻干后的蛋白复溶后测定浓度，一般要求在5-6mg/mL 之间，所

黄粉虫吃什么饲料 黄粉虫是一种杂食性的昆虫，吃的东西没有多大的限制，五谷杂粮均可以作为它的食物，因此，黄粉虫饲养相对比较简单，加上其繁殖量大，繁殖迅速的特点，很多养殖户都愿意养殖黄粉虫。相对于黄粉虫成虫，黄粉虫的幼虫食性更广，除了麦麸果皮之外，鲜榆叶、桑叶、桐叶、豆科植物的叶片，以及各种昆虫的尸体都是幼虫的吃食范围。在饥饿的时候，黄粉虫甚至会出现自相残杀，以大吃小的现象。 所以黄粉虫的饲料来源非常广泛。而考虑到经济成本等方面，目前养殖黄粉虫的主要食物是：麦麸，搭配一些瓜果蔬菜，树叶野草等，饲料成本相对比较低。黄粉虫吃的饲料根据饲料原料分类，主要有以下六类。 1、精饲料：主要是以粮食、油料加工的副产品为主。如：麦麸、高粱、玉米、米糠等等。这些饲料可以生喂，可以熟喂。所谓的熟喂就是炒半熟，其饲料就带有清香，更加适口。特别的注意，掺有滑石粉的麦麸不能饲喂黄粉虫。 2、粗饲料：顾名思义，农副产品和干草类都是属于粗饲料。农副产品主要是：荚、壳、藤、蔓、桔、秧等等。树叶类和沼渣类都是粗饲料的范围。 3、青绿饲料：青绿饲料主要包括多种蔬菜，鲜嫩野草、牧草、树叶、农作物的茎叶。如各种青菜、莴苣叶、白菜、南瓜叶、甘薯叶、豆叶；幼虫吃榆叶、桑叶、桐叶、豆类植物叶片中和各种阔叶青草等。 4、多汁饲料：主要指含水分比较多的瓜类饲料。如，南瓜、西瓜、菜瓜、桃、李等，以及这些作物的花瓣。由于多汁饲料的含水量过多，最适宜在夏季的高温季节使用，不仅可以增加养殖环境的湿度，维持黄粉虫的水分，也可以有一定的降温效果。 5、蛋白质类饲料：包括植物蛋白饲料，如菜籽饼，豆饼，豆腐渣。动物蛋白饲料如鱼粉、蚕蛹粉、蛆粉，还有厨房的肉类下脚。蚯蚓也是黄粉虫的好饲料。 6、添加剂饲料：安全的饲料添加剂能够对黄粉虫的饲养起到相当大的效果。如骨粉、贝壳粉、维生素等等。 在这里，给广大的黄粉虫养殖爱好者提供一些黄粉虫比较常用的饲料配方。 幼虫常用配方（%）：麦麸70，玉米粉25，大豆粉4.5，饲用复合维生素0.5，将以上各成分拌匀，经过饲料颗粒机压成颗粒，或用16的开水扮成团，压成小饼状，晾晒后使用。 成虫常用配方（%）：麦麸75%，鱼粉4%，玉米粉15%，食糖4%，饲用复合维生素0.8%，混合盐1.2%，加工方法同幼虫配方。此配方可以提高黄粉虫的产卵量，延长成虫的寿命。

蛋白质提取方法-------列举10种方法 一、植物组织蛋白质提取方法（summer） 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8）45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法(summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、组织：肠黏膜（newinbio） 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE 提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清，加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE 用量）振荡，置室温20min 离心：7500g，5 min，4 度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次 沉淀中加入100％乙醇2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀，1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，

蛋白提取实验步骤： 1、细胞总蛋白提取 A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。 B、对于贴壁细胞: a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。 b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。 c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。 C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 2、组织蛋白提取： A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。 B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 注意事项 1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。 2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。 3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。

4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。 5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。