宏基因组学时代的病毒分类学

宏基因组学时代的病毒分类学

Simmonds P, Adams MJ,...et al.(2017)Consensus statement:virus taxonomy in the age of metagenomics.Nat Rev Microbiol 15⑶:161-168.doi:10.1038/nrmicro.2016.177

何庆兰译

摘要宏基因组数据中鉴定的病毒序列数量和多样性，已远远超过实验鉴定的病毒分离株。最近举行的研讨会上，专家团队讨论了一项提议，对只有通过了宏数据才知道的病毒，经过适当的质量控制，是应该可以整合进国际病毒分类委员会（ICTV）官方分类方案的。尽管单独基于宏基因组序列数据的分类法明显背离了依赖表型特征的传统分类法，然而基于病毒序列分类的强劲框架的开发，对全球病毒组学全面特征的描述是必不可少的。我们在这篇共识声明文章中，论述了为什么宏基因组学数据应该和如何能整合到ICTV分类法中去的理论依据，并介绍了得到ICTV执行委员会（EC）批准的提案。

病毒是专性细胞内寄生物，它可能感染所有细胞形式的生命。虽然，病毒学家传统地专注于引发人类、家养动物和农作物疾病的病毒，然而近年来在宏基因组测序，特别是环境样本的高通量测序的进展，揭示了生物圈到处存在惊人的大量病毒组。全球的大多数环境中，任何时候均存在着至少1031病毒粒子，包括海洋和淡水的生活环境和多细胞的胃肠道中可检出的病毒粒子数要超过细胞数量的10-100倍[1-5]。为了帮助理解存在病毒绝对数量的概念，比喻地说，它们目前的生物量估计相当于7500万头蓝鲸的重量（约2万亿吨），如果将它们互相贴着地摆放起来，其长度可跨越65个银河系[6]。除了它们惊人的数量，病毒在其性质、遗传物质的组成、基因序列和编码的蛋白质、复制机制、与它细胞宿主的相互作用、无论它们之间是敌对的共生的还是互惠的等方面，具有令人惊叹的多样性[7]。水生环境尤其是包含多样化的病毒形态，包括单链(ss)和双链(ds)的DNA和RNA病毒，它们的基因组大小从不足2000个碱基至超过200万个碱基[4]。尽管到目前为止，对感染细菌的dsDNA病毒（噬菌体）研究得最为深入，但最近的研究表明约50%的海洋病毒却是ssDNA和RNA基因组[8]。

宏基因组数据正改变着我们关于病毒多样性的观念，并因此挑战我们认识和分类病毒的方法[9]。历史上，ICTV对新发现病毒的描述和分类，需要关于病毒粒子的宿主范围、复制周期、结构和性状等实质性的信息，然而，高通量测序和宏基因组方法已从根本上改变了病毒学，现已知仅从序列数据获得的病毒数量要比实验鉴定的多许多。例如，类双生病毒科(Ｇenomoviridae)目前只包括一单个分类的病毒，然而却已对不同环境中120多种可能的成员进行了测序。虽然，这些经序列测定的病毒，缺乏有关引导它们分类到科中的属和种的宿主和其他生物学特性[10]。事实上，来自基因组数据小[11-14]、中[15-18]和大[19-20]基因组的大量完整的或近乎完整基因组序列已被组装。完全由这种分析鉴定的新病毒群，着重地证明了宏基因组方法在发现病毒中的能力，所发现新病毒中的一些在调节生态系统、而其他一些可以与宿主共存却不引起明显的疾病或甚至是互惠中具有关键的功能[7]。然而，实际情况是，往往可能很少的病毒会是有引发人类疾病或影响全球经济的病原体那样水平的实验特性。

病毒是否可由宏基因组学鉴定和应将其纳入单独以序列为基础的ICTV官方分类方案，是急需解决的问题。针对这一问题，2016年6月举行了由病毒发现和环境监测领域的特邀专家以及ICTV执行委员会成员参加的研讨会，讨论了这种可能性，并开发了一个适宜的病毒分类法框架。我们在这篇共识文章中发布了这些提议，并同时对此研究成果的基本原理作出了

解释。我们的提案随即得到了ICTV执行委员会的认可。

病毒的多样性

环境病毒样本中潜在分类单元的数量，与现已由ICTV分类的数量之间的差异是惊人的大。作为塔拉海洋探险（Tara Oceans expedition）项目的一部分，最近对世界范围内43个洋面位点的dsDNA病毒序列的分析，鉴定区分出5476个dsDNA病毒群[21],但是至今由ICTV分类的相应病毒群则只有39个。这些病毒群中的大多数，既是数量丰沛却又地理分布广泛，但是，几乎所有这些病毒都未被纳入已经确立的病毒分类单元[图1]。早期的不同海洋生境病毒组研究，提示了病毒的巨大多样性[22,23],虽然那时的测序技术尚不能直接地进行全基因组鉴定，只是用数学模型预测了几十万个DNA病毒基因型。最近对不同的数千个样本进行的全面宏基因组分析，发现了大约125000个新的病毒基因组，已鉴定的病毒基因组数量增加了16倍[24]。同样地，随着研究技术的进展，海洋和其他生态系统中的ssDNA和RNA病毒越来越明显地比当前已鉴定的病毒具有远远更高的多样性；然而，尽管这些新病毒具有生态重要性，但仍然还是一类候补性的成员[11,25-31]。宏基因组数据中鉴定的ssDNA病毒编码一种进化保守的复制相关蛋白(Rep),然而其其他基因的数量、定向和进化起源，在这些循环的编码Rep ssDNA病毒(CRESS-DNA病毒)中是高度易变的[32]。系统发育提示，除了落在4个簇集外围的大量病毒以外，这些病毒中的一部分明显的地簇集在已经鉴定的4个科中[图2]。除海洋环境外，通过宏基因组在野生植物中发现的大多数病毒似乎是持续存在的，但这些病毒中只有很小的一部分由ICTV分类为种[33]。已在陆地环境样本中[24,36]鉴定的数个真核生物的和原核生物的病毒，和由类似报告报道的来自昆虫[34,35]的一些新病毒，是高度多样性的。

人类胃肠道中，尽管先前经过几十年的研究没有检测到病毒，现宏基因组研究已发现存在着惊人的大量新颖病毒。例如，一种名为crAss噬菌体的dsDNA噬菌体的～97kb基因组，它在来自污水或废水样本的公开可用的宏基因组数据集中，具有比其他已知全部噬菌体合起来数量的6倍还要多。宏基因组中，病毒样颗粒产生的全部阅读序列中多达90%是由crAss噬菌体提供的，并占到公共数据库中全部人粪便宏基因组阅读序列的1.7%[17]。

最近开发的VirSorter工具[37,38],从多达15000种细菌和古细菌的基因组[37]中鉴定出了12498种细菌和古细菌的基因组，这些鉴定的新病毒使已知原核生物病毒的数量增加达10倍，却所感染的原核生物达13个门[37,38]。这些进展是在病毒发现中发生根本变化的突出证据：现在的新病毒基因组的绝大多数来源于宏基因组数据，并一直未与生物学因子直接相关。病毒学家尤其是病毒分类学家，别无选择地只有在这种新现实中进行研究工作。

目前的病毒分类法

分类法提供的框架，增强了我们对病毒的理解。它有助于病毒学家之间以及病毒学家与其他利益相关方如农民、种植公司、监管部门和潜在资助者之间的交流。然而，病毒的分类在一些基本是不同于细胞生物分类的。尤其是病毒缺乏普遍都有的基因，如此，可利用这一特性构建一个所有病毒都可安置的一体化系统发育[39-42]。因此，病毒没有相等于细胞生物的生命树，细胞生物的细菌、古细菌及真核生物（尽管由于水平基因的传播引发并发症），通过核糖体RNA和近乎通用的蛋白质编码基因的比较构建了生命树[43-45]。

ICTV只负责把病毒归类到分类单元，并给它们命名。目前，病毒的分类是把病毒归类到科、属和种的层级里，并给每个分类单元下了定义，确定了独特并受监管的名字。一些科还分出亚科，每个亚科再包含独立的属，少数科则被升级到更高的分类单元目。ICTV通过原种表（MSL）发布病毒分类信息。目前，该表包括7目、112科、610属和3704个种[46](见病毒分类：2015发布)，并定期出版包括附加描述资料的ICTV报告[47]。这种MSL,通常根据专门研究团队(见ICTV研究团队）对每年呈报给ICTV执行委员会（EC）的分类提案（见当前ICTV EC网页）的研究结果进行更新。然后，这些提案经ICTV EC根据《国际病毒分类和命名准则》（ICVCN；见国际病毒分类和命名准则网页）制定的一套最低限度规则和所提供的强有力支持证据，进行详细的审查，以备可供公众使用。然后，这种新的分类再由ICTV成员投票批准，并纳入每年一份的MSL。

最低的分类层级是种，在ICVCN中的种定义为“一个单源（系）的病毒群，其特性可由多个标准与其他病毒种相区别。”历史上，术语“多重标准”被解释为有关特性如在细胞中的复制性能、病毒粒子形态、血清学、核苷酸序列、宿主范围和流行病学或动物流行病学。然而，由各个研究团队详细研究和由ICTV批准时，这些标准在应用于不同科病毒的分类中，存在着相当大的差异。

ICVCN对更高分类层级的明确规定给予了较大的自由度，给属定义为“具有一些确定共有特征的一群种组成为属”，科的定义为“具有一些确定共有特征的一群属(这些属无论是否组成亚科)组成为科”和目的定义为“具有一些确定特征的一群科组成为目”。这些较宽松的标准包容了在更高层级分类中应用方式的实质性变化。作为一个对脊椎动物和植物的病毒近似指南的分类标准，一个科中的不同属成员典型地具有同源结构和复制相关基因的类似基因组组织，不过，也通常具有非同源的辅助基因，例如那些参与逃避宿主防卫机制和植物中病毒移动的辅助基因。相比之下，不同科之间的病毒，通常具有完全不同的基因组组织和可能缺乏任何可检测的基因关联性。这种同源性的存在，即使不是非常相似，RNA病毒中的RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）、RNA病毒中的蛋白酶和解旋酶、和小ssDNA病毒中的Rep编码基因，可能在任何情况下，均可使不同科之间的遥远进化关系得到鉴定；这种关系可能会形成创建一个目的基础。这种遥远关系鉴定的过程和对更高层级分类群分类适合性的评估，决不是小事，因此对目的创建需要特别仔细地考虑。例如，在差异巨大或真核生物的巨型dsRNA病毒中存在着一组实质性的共有基因，已促使形成了一个创建“巨病毒目”（参考文献48）的提案，迄今为止，在这个领域中还没有缺乏共识的提案被ICTV所接受过。类似地，对CRESS-DNA 病毒创建一个目的提案，正在被相关的ICTV团队仔细地考虑。

宏基因组学时代的病毒分类

过去ICTV批准一个病毒新种，通常取决于各个病毒所具有独特生物学特性的可用证据。此要求限制了已分类并归入MSL的病毒数量。由于现在大多数新病毒是由基因组学发现的，但缺乏直接相关的生物学因子，所以在此宏基因组学时代召开了一个开发病毒分类新框架的研讨会议（框1；补充信息S1(框)）。研讨会上的讨论，反映出由宏基因组数据所引起挑战的事实，并不是病毒所特有的(框2)。

源自环境样本组装的序列，通常包含新病毒完整而经过验证的基因组，但是没有直接提供它们的生物学特性。单独根据序列信息的病毒分类可能会导致是序列而不是病毒的分类，这种已觉察到的限制性，升高了人们对此问题的关注度[49]。然而，我们认为在采取适当预防措

施(见下文)的情况下，样本中病毒序列的检测是能提供充分证据以推断相关病毒的存在。事实上，病毒完全可被检测、鉴定和分类的概念，得到了在数量激增的病毒发现领域中它们序列分析的有力支撑。考虑到病毒的特性，大部分或全部是由基因组编码的，单独根据病毒序列信息分类之后，基本不会受到缺乏生物特性的限制，但是我们无能正确地阅读这种信息和坚定地推断酶功能、病毒粒子结构和其他的表型特征。

序列数据提供的丰富信息，可用于分类的目的，例如进化关系、整个基因组组织(基因含量和排序、编码蛋白的预测和特征性重复序列的存在)、基因组表达的特征、基因组复制策略、各种独特基序(例如例如聚合蛋白裂解位点、内部的核糖体进入位点、末端序列、结构皱褶和宿主范围决定因子[50])的存在或缺乏，总体和局部基因组成分的特征（GC含量、双核苷酸频率[51]和编码使用）。因此，序列分析可提供分类到种所需要的多重标准。实际上，病毒分类中序列信息的成功应用已预示了前宏基因组学时代。例如，克隆序列的生物信息学特征促成了丙型肝炎病毒的发现，预测了该病毒的特性和复制策略、黄病毒科类似成员的特征，以及开发出有效的诊断和筛查试验[52,53]；这些进展要依靠于病毒粒子的可视化、体内病毒蛋白的检测和细胞培养中病毒生长的成功达许多年。

然而，重要的是要认识到应用宏基因组数据集中，序列组装的病毒基因组对病毒的分类需要解决的几个技术问题。这种序列通常源自混合的病毒群体，因此存在着装配成人工嵌合基因组的风险。此外，目前的方法不适合组装分节的或多部分基因组病毒的完整基因组。另一个出现的实际问题，病毒衍生序列被整合进了宿主基因组(例如内源性病毒样元件和前噬菌体)，其中的许多被转录而存在于RNA库。为了使宏基因组序列用于分类，这些问题需要通过强有力的计算和实验方法来解决。然而，这些告诫并不代表病毒分类的根本性障碍，随着用于创建宏基因组序列的技术不断地改进，其中的许多问题尤其是那些与重新组装相关的问题将会得到解决。这些改进，包括生成更长的阅读序列和应用模板循环化，以降低错误率等方法[54]。

方案

研讨会就完全在宏基因组序列数据基础上进行病毒分类达成了共识，由此制定了一套方案（框1；补充信息S1(框)）。这些方案概要地介绍于图3。

分类的基础。完全根据宏基因组数据的鉴定，依靠对数据完整性的检查和执行标准的分类程序，来进行病毒的分类，将是病毒分类学的进步。预期，这将涉及到全部由宏基因组序列数据鉴定病毒组成的更高层级分类单元的创建。

创定新种。当前ICTV的种定义，可满足完全根据序列信息的病毒分类要求。病毒特征可从序列数据推断获得，包括基因组组织、复制策略、同源基因的存在和潜在的宿主范围或载体类型，可作为附加的生物学特性。缺乏表型数据的情况下，通常可依赖现有种定义来用以描述那些种。这样的信息是由基因组序列的最优推断而来的，包含了各个病毒的完整编码潜能，以及应是单独基于序列分类的最低需求。

为现有科中病毒分类新的种和属。病毒群之间的界定程序差别很大，通常是根据包括系统

发育的序列和不同的生物学特性等参数来进行界定。尽管识别直接的生物学信息可能构成现有分类单元定义的一部分，不过如果它们的序列关系可与那些该科中现存分类单元中的病毒进行比较时，就可由宏基因组鉴定把病毒分类到增加的分类单元（种和属）。

描述新的科和目。有基因组序列但其与现有分类单元中的病毒没有紧密关系的病毒，因为没有源于表型衍生的标准可以用于分类，所以就产生了一个特殊的问题。在这种情况下，可能在基于与该科中已识别病毒相比较，只有有限的或缺乏基因的同源性，而其在基因组组织或推断的复制策略中则存在着重大差异，则可以将此病毒分类到一新科中去。具有更紧密相关的宏基因组序列中存在变异簇集和模式的病毒群，可以将其分类到病毒谱系中较低的层级。然而，一个新科的创建和把属和种归纳到其中，将需要相当大数量序列信息和一个能容纳它的可靠分类框架的开发。定型的簇集和网络分析方法，用来创建基于同源基因检测和它们基因多样性的相似性度量标准[55-57]，并应严格地评估它们在强有力分类方法开发中的有效性。这种框架，可能必须按病毒群量身定制。例如，噬菌体分类通常基于病毒粒子的序列和结构[58]，但这些特征可能不适于动植物RNA病毒的分类，其中更深层次的关系在RNA聚合酶和其他保守的复制相关蛋白序列中往往最明显[59]。

仅自序列数据鉴定的分类群的命名。目前由ICTV应用的分类单元命名系统，可容易地扩展应用于是由宏基因组序列数据创建所增加的种、属和科。此外，分类群可能包含了由不同方法鉴定的病毒。因此，最初所包含的那些病毒种，仅从可能评估的序列数据鉴定而来，甚至所包括的病毒种是由分离鉴定和直接地由其生物学特性所定义。于是，宏基因组状态属于并可自一特定病毒和及已分类的不完整分类单元的记录序列中重新获得。虽然，一些病毒学家采用了“相关”一词作为那些在宏基因组数据集中鉴定病毒命名的一个部分(例如人粪便相关环形病毒（GQ404856(REF.60)；其他例子见REF.12、13、26、61)，而没有必要把这种或其他等效的细菌术语“暂定种”整合到病毒分类单元名称中去。

病毒分类程序的改进。现在向ICTV报关病毒分类提案的程序中，原则上，仅提供将定分类病毒的已知序列就足够了。不过，这一程序仍可通过对数据的准确性和完整性适当的质量检查的电子提交方法的开发，而得到实质性的改进和使得效率更高。尤其是可以改进提案的格式，使众多的病毒种(可能多达数百或数千)能在同一提案中呈报，而无不必要的重复信息。此外，还可以开发缩短处理提案和更新MSL所需时间的程序

ICTV的认可。作为采用基于宏基因组的病毒分类法的第一步，ICTV EC于2016年8月22-24日举行的研讨会期间，对呈报的提案进行了讨论，并开发了基于宏基因组的病毒分类法。呈交的提案得到了执行委员会全体成员的支持(其中一位无法出席会议的成员此后即表示支持），ICTV并将该提案的实际执行视作为一项高度优先的事。这个规程将包括积极地邀请病毒学界提交基于宏基因组序列的分类提案、提供关于数据标准的指南(包括序列的质量和完整性)和为大序列数据集开发更有效的数据呈递工具。ICTV EC计划在一篇独立的文章中解释和发展这些步骤。

结论

我们认为现在是通过仅从宏基因组数据鉴定并承认其是真正的病毒，而这取决于对数据完整性的适当检查及遵循分类方法的标准程序。我们期望这个流程将导致更高层级分类单元的创建，这种分类单元由宏基因组学鉴定的完整病毒所组成。

我们认为本文概述提案的实施，将使极大扩展的合规病毒分类法会对未来病毒多样性的研究作出重大的贡献。只有接受宏基因组学方法所获得的序列，才真正地代表了把它们包括在分

类方案中的现存病毒，我们期望能更好地了解它对全球病毒组学的生态、历史和影响。

图1.海洋病毒的广泛性、丰度和从属关系。全球海洋病毒组(GOV)数据集鉴定了15222个病毒群[69]，本图显示了它们的流行情况(x轴，采样站数中检测到的病毒群体）、平均丰度(y 轴，标度log10，覆盖所有样本中检测到的病毒群的标准化平均值)，按病毒群宿主归属分类标以不同颜色（从属关系是基于最佳基本局部比对搜索工具（BLAST）找准预测的基因；一个病毒种群与一个分离的病毒相关联，而宿主中的病毒有≥50%预测基因与其相关时，该病毒就归属于此宿主；15222个病毒群可归属于512个宿主）。此图由美国俄亥俄州立大学的S.Roux和M.B.S.提供。

图2.CRESS-DNA病毒的遗传多样性。695个CRESS-DNA病毒的复制相关蛋白序列与来自双生病毒科（Geminiviridae）、矮缩病毒科（Nanoviridae）、圆环病毒科（Circoviridae）、类双生病毒科(Genomoviridae)、和一组与双生病毒或矮缩病毒相关的阿尔法卫星(alpha satellites)的10个代表性Rep序列进行了比较。氨基酸序列用快速傅立叶转换进行多重比对(MAFFT；G-INS-i选项)[70],并应用Fasttree[71]构建了一株最大似然系统发育树。SH(Shimodaira-Hasegawa)-类支持少于50%的分枝就断落。

框1.一个促进病毒分类的研讨会

维康（Wellcome）信托基金资助了促进宏基因组时代病毒分类框架的研讨会。研讨会由P.S.组织和主持并由本地的M.L.N.管理，于2016年6月9-11日在美国马萨诸塞州波士顿召开。参会人员在病毒基因组学、宏基因组环境研究和病毒分类（26名参会人员中的13名是ICTV EC的成员）等方面具有广泛范围的专长，他们在展示资料的基础上，进行了广泛范围的讨论，与会人员着手制定了一系列的专家建议，供ICTV EC进一步地审议。

研讨会的理解是，宏基因组学术语适用于任何缺乏生物学的或其他特性的病毒序列，尽管在

实践中“缺乏”的定义与在文献中的有所不同。现在的序列数据在病毒分类中是至关重要的，因为目前只有它们提供了分类必需尺度上表达进化关系的可靠资源；然而，研讨会也认识到由高通量测序从环境样本中获得的数据构成了重大的挑战，特别是因为越来越强力的方法产生了如此大量的数据，却它们很少或根本没有与生物学信息相关联。

研讨会参与人员得出结论，在病毒分类中缺乏病毒分离株或直接的生物学数据，如可视的病毒粒子或疾病的征兆或症状情况下，应用宏基因组的序列分类是完全可以的。本共识声明文章中讨论并开发了一系列提案（另见补充信息S1（框））。这些提案，随后得到了ICTV EC的认可。

框2.根据宏基因组数据进行细菌、古细菌和真菌的分类

用于病毒分类及分类群命名的程序，与用于细菌和古细菌的程序有很大的差异。《国际细菌命名法》，只规定了新提种的名称，而没有把这些细菌种正式分类到更高分类层级中去。共有2053种细菌和古细菌被批准列入1980年的《国际原核生物系统学委员会细菌名称表》。从那时起，另外的13434种有效的名称已在批准的刊物中作了描述[62]。然而，普遍地认为这个总数与通过环境筛查已发现的数百万种新细菌和古细菌的保守估计是不一致的[63,64]。给细菌和古细菌种命名，需要定义生物学特性例如形态学、代谢和生态学的信息来区分新种与先前分类的细菌的不同。另外的要求是这个有机体必须培养，并至少在2个国际资源库中储存1个分离株。为了克服这种限制，许多作者提倡应用序列数据推断的表型特征作为细菌种分类所需要的标准[63]。此外，相对较少数量（约350种）的非培养物，虽然没有获得分离株，但可清楚区分的细菌和古细菌，则用限定词“暂定种”命名这些种[65]。历史上，虽然大多数原核生物种成员现在有可用的16S核糖体RNA基因序列，但序列信息未曾用于细菌和古细菌的分类，这就导致确定了许多同义名（同一菌种具有不同的好几个名字）。尽管在病毒与细菌、古细菌之间的两种进化路线和分类方法上存在着重大差异，目前在这两个领域的分类中则具有相同的挑战：事实证明代表不同分类群的惊人数量的不同基因组，正在持续地从宏基因组学研究中积累起来。

关于其他微生物也有类似的评论。例如，真菌的分类相似于细菌和古细菌，《国际藻类、真菌和植物命名法》规定，对在四个国际资源库之一中储存典型样品，具有类似的要求。种的分类，仍然是主要基于生物学特性。事实上，同一真菌在有性和无性阶段具有不同的形态类型，因而往往分类为不同的种甚至属，不过近年来，为纠正这一问题已进行了认真的尝试[66]。同样地，以前没有进行类似性的比较，只到最近序列数据可用时，才鉴定和删除同义名。可以预期，宏基因组学能使真菌分类产生重大的变化，因为只有一小部分真菌被认为是可以培养的，却环境中不同真菌的数量可能达数百万之多[68]。基因组标志物的利用，例如内部转录间隔（ITS)区，被认为可用作真菌基因组分类的生物条形码[67]。

图3.所提分类方法的概要。所提分类方法(红色箭头)，可使宏基因组学序列数据和传统由

病毒衍生的序列用于病毒的分类。通过病毒序列的生物信息学分析，推断的生物学特性与序列相关性及基因含量信息、和可选的任何观察到的生物学特性（虚线）一起，都可用作ICTV 分类办法中的种和更高层级分类的定义标准。本程序(红色箭头)不同于当前（绿色箭头)和先前实行的(蓝色箭头)，其中生物学数据和/或宿主信息和序列数据(当前分类法)，单独的生物学数据(1970s-1990s)是分类所需要的。