超氧化物歧化酶SOD的研究和应用进展.

化学世界

超氧化物歧化酶(SoD的研究和应用进展

林庆斌,廖升荣,熊亚红,乐学义’

(华南农业大学理学院,广东广州510640

2006年

摘要:超氧化物歧化酶(s0D是一类广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶,是化学生物界研究的热点之一。作为生物体内自由基的清洁剂,SOD对生物体(包括人体具有重要的功能作用。

关键词:超氧化物歧化酶;超氧阴离子自由基;生物活性

中图分类号:Q554文献标识码:A

文章编号:0367.6358(200606—378.04

Pmgress in t11e Study and Application of Superoxide Dismutases

UN Qing.bin,UAO Sheng—rong,XIONG Ya-hong,LE Xue—yi’

(cDf妇e旷Scfe,lce,s0眦^饥i舱Ag—c“zf“mf踟挑措访,G嬲,lg幽,lg‰,29=幻

u5∞静2,c越M

Abst豫ct:Superoxide dismutases are a kind of metal—chelated enzymes Whi曲exist widely one of in animals,plants,and micmorganisms.They are the cleanser of the reactive oxygen speeies in

the bodies.The enzymes are the research hotspots in chemistry and biochemistry.The study and application of superoxide dismutases are reViewed in this p印er.

Key、_rords:SOD(supe mxide disHmtase;0f‘f南e radical;biological actiVity

超氧化物歧化酶(supemxide dismutase,简称sOD,是一类广泛存在于生物体内的金属酶,能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应,平衡机体内的氧自由基,己成为化学及生物化学研究领域中热门的研究课题。作为生物体内超氧阴离子自由基的清洁剂,sOD在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能,在医学、食品、化妆品等领域得到越来越多的应用。目前,世界各地学者对sOD的研究方兴未艾,深入研究sOD不仅有着重大的理论意义,也有着重大的实际应用价值。

1SOD的分布、分类及理化性质

到现在为止,人们已从细菌、原生动物、藻类、霉菌、植物、昆虫、鸟、鱼类和哺乳动物等生物体内分离得到s0D。根据活性中心结合的金属离子不同, sOD主要分为:①Cu/zn.SOD,主要存在于真核细胞的细胞质中;②Fe—s0D,主要存在于原核细胞和真核

细胞的基质t},:、1¨.sOD,主要存在原核细胞及少数植物细胞。}I二类主要SOD 的理化特性如表l 所示。

表1三类主要soD的理化特性

2SOD的结构和活性影响因素

2.1sOD的结构

cu/Zn.SOD每个分子由两个亚基通过疏水作用和氢键力缔合成二聚体,肽链内部由半胱氨酸c,,和

收稿日期:2005.05一19;修回日期:2006—04—20?

基金项目:广东省自然科学基金重点项目(04105986。

作者简介:林庆斌(1982~,男,硕士生,主要从事生物无机化学研究。*通讯联系人,E.mail:1exy@https://www.360docs.net/doc/e74036460.html, 万方数据

第6期化学世界

C。骈的巯基构成的二硫桥对亚基缔合起重要作用…。Richardson用O.2nm X.射线衍射晶体结构分析得到Cu,Zn.SOD三维结构,指出sOD的活性部位是以Cu 为中心的一个“疏水口袋”(见图1㈨。

一N

●o

图1天然Cu,zn.SOD活性中心结构

Cu和zn处在疏水口袋底部,相距约0.63nm。cu(Ⅱ与四个组氨酸残基咪唑环上N原子配位形成变形的平面四方形结构,其轴向位置上还结合着一个水分子,Zn(Ⅱ则与三个组氨酸和一个天冬氨酸配位形成畸变的四面体结构,cu(Ⅱ与zn(Ⅱ之间通过共同连接一分子组氨酸而形成“咪唑桥”结构‘1|。

Mn—SOD由203个氨基酸残基构成。中心金属Mn(Ⅲ具有五配位的三角双锥结构,其中3个配位基位于赤道平面,两个轴向位置上分别为一个水分子和一个为His28的咪唑基。酶的活性部位在一个主要由疏水残基构成的环境里,两个亚基链组成一个通道,构成了底物或其它内界配体接近Mn(Ⅱ离子的必经之路【31。

Fe.sOD的结构比较简单且与Mn—sOD类似,活性中心中Fe(Ⅱ离子与3个His、1个Asp和1个H20配位,形成畸变四方锥结构H1。

2.2sOD的活性影响因素

sOD的催化活性主要与s0D活性中心的氨基酸残基、金属离子及其配位环境、“咪唑桥”的变化有关。

sOD活性中心的精氨酸和组氨酸对soD的催化活性具有极其重要的意义。这两个氨基酸离中心金属离子非常近,而且均带有正电荷,能诱导底物Of?,进入活性

中心,并可在催化过程中提供H+以加快歧化反应速度。如这两个氨基酸残基被破坏或修饰,SOD将会失活。

sOD中心金属离子的作用也不相同。对于cu/ zn—sOD,zn(Ⅱ的作用一是调节咪唑基与cu的相互作用,二是稳定活性中心的结构。若除去酶分子中zn(Ⅱ而保留原有环境中时cu(Ⅱ,SOD仍有相当高的活性。cu(Ⅱ与酶催化作用有关,起着传递

电子的作用。若除去cu(Ⅱ,则sOD将会失活,重新加入cu(Ⅱ后s0D的酶活性恢复。另一方面,Cu (Ⅱ所处的环境对活性有重要影响。若以其它金属离子代替cu(Ⅱ,同时用cu(Ⅱ代替zn(Ⅱ,则酶失去全部活性。另外,只有结合态的cu(Ⅱ才直接与活性有关,但在一定浓度范围内,增加游离的Cu (Ⅱ的浓度可显著提高sOD活性"1。

对“咪唑桥”配合物进行催化的研究表明,在催化过程中,“咪唑桥”在与铜相连的一侧的N原子迅速地发生了质子化和去质子化的变化№o,对酶的催化活性有重要影响。

2.3SOD活性测定

s0D的活性测定方法一般分直接测定法和间接测定法。直接测定法的原理是直接测定sOD催化反应的底物反应速度或产物生成速度。常见的直接测定方法有EPR法、脉冲辐解法、超氧化钾法等。直接法需专用的仪器,故此类方法一般实验室较难应用。间接测定法是通过某种能产生0f?的系统,使Of?进行另一个便于检测的反应,测定特征波长下的光吸收变化速率,计算sOD对这个反应的抑制程度从而间接定量SOD活性。常见的间接测定方法有黄嘌呤氧化酶.细胞色素c法、邻苯三酚自氧化法、微量邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶一NBT法、NBT光还原法等。

3SOD的研究动态

国内外有关SOD的研究方兴未艾,比较活跃的领域主要有以下几个方面。

3.1结构性能改造

由于受到①半衰期短;②相对分子质量大,不易透过细胞膜;③口服时易受胃蛋白酶分解;④体内特异性等因素的限制,sOD很难作为药用酶广泛应用于临床中。对sOD进行化学修饰,既能保留天然酶的活性,又能提高其稳定性。sOD化学修饰的方法主要有:①对s0D的氨基酸残基进行化学修饰,主要是对非活性部位进行修饰,目的是提高其稳定性同时保留较高的生物活性;②用水溶性大分子(如聚乙二醇、聚蔗糖、右旋糖酐和聚烯属烃基氧化物等对sOD进行共价修饰以提高酶学特性;③对sOD进行酶切改造,降低相对分子质量、减小抗原性n]。研究表明旧、9。:经过化学修饰后的SOD基本上保持了天然酶的活性,在耐热、耐酸碱和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高。

3.2s0D模拟研究

3.2.1活性中心模拟

由于天然sOD自身存在的缺点,因此寻找和合

万方数据

化学世界

成一类既能避免天然sOD不足,又具有sOD催化活

性的物质——SOD模拟物的研究非常活跃。sOD模

拟物具有相对分子质量小、稳定性高、在体内半衰期

长及脂溶性好的优点。最令人感兴趣的是Cu/Zn.

sOD活性中心的模拟,可视为以咪唑桥联的cu

(Ⅱ、zn(Ⅱ异双核配合物¨0|。现今对Mn.sOD模

拟物的研究逐渐增多,而Fe—sOD模拟物合成难度较

大且sOD活性较低,故其模拟研究较少¨“。近年来国内外学者对氨基酸配合物和大环类配合物进行了广泛探讨。谢英等人合成了以二肽为配体的铜.(Ⅳ. 正十二碳酰双甘肽配合物,这是一个带功能基的长链铜(Ⅱ氨基酸配合物,同时用脉冲辐解法测定了

其sOD活性,较好地模拟了sODu2i。毛宗万等人研究了具有cu/zn.sOD酶活性中心类似结构的模型化合物,深入地讨论了不同的咪唑桥联方式和不同配位构型对模型化合物催化of?活性的影响。结果表明,咪唑桥N原子沿四方锥配位底面位置与cu (Ⅱ配位的模拟物活性大大高于眯唑桥N原子沿

四方锥轴向与cu(Ⅱ配位的模拟物,活性差异的原

因很可能与生成cu(I中间体的稳定性有关¨3I。

在多核配合物方面,廖展如等根据天然soD活

性部位结构合成了多种含苯并咪唑的cu(Ⅱ、Fe (Ⅱ、Mn(Ⅱ、co(Ⅱ、Ni(Ⅱ、zn(Ⅱ的配合物,指

出配合物活性与其模拟天然sOD结构微环境程度的大小有关,并将其应用于植物抗冷胁迫实验。在进行低温胁迫后,经过SOD模拟物处理对水稻幼苗

成活率明显的高于未处理的幼苗¨4“…,这些研究成果为研究开发新型农药开辟了新的途径。Patel等合成了一系列以水杨醛丙氨酸席夫碱为配体的cu (Ⅱ.cu(Ⅱ,cu(Ⅱ一Ni(Ⅱ,cu(Ⅱ一zn(Ⅱ咪唑

桥联的双核配合物和相关的单核配合物并测定其sOD活性。结果表明,双核配合物比单核配合物具有更高的s0D活性,这可能与双核配合物的结构更加类似于天然SOD的活性中心有关旧0;。

3.2.2胶束模拟

由于soD在生物体内发挥其效用时所处的环

境大多是非均相的,一些学者采用表面活性剂在水中形成的胶束体系来模拟上述非均相反应环境。金虬等人的研究表明由cTAB(阳离子型表面活性剂和SDs(阴离子型表面活性剂形成的胶束体系可使多种Cu(Ⅱ.氨基酸配合物的sOD活性得到提

高[21【。但该体系结构比较复杂,较难弄清其催化Of?歧化的机理,这方面的研究有待进一步拓展和深化。

3.3SOD与植物抗逆性2006年

植物在生长发育过程中可能受到诸如病原菌、

水份、大气污染、辐射、温度、光照盐碱度和重金属等因素的胁迫。这些胁迫均能使植物产生过量的活性

氧和自由基,引起细胞结构和功能的破坏。SOD是

清除活性氧过程中第一个发挥作用的抗氧化酶,在

植物体内起重要作用。近年来,国内外学者对SOD

与植物抗逆性之间的关系做了大量研究。任安芝等

人对干旱胁迫下内生真菌感染的黑麦草叶中的sOD

及其同工酶进行了系统的研究。研究表明:随着干

旱程度的提高,黑麦草叶片中sOD及其同工酶活性

显著提高,内生真菌的感染使宿主植物sOD活性对

于旱胁迫的反应更为敏锐m]。这些研究为在沙漠

等干旱地区提高植被成活率提供了理论依据和方

法。

4开发应用

近年来,sOD在基础研究和应用研究上均取得

实质性进步,主要表现在医疗临床、食品工业和化妆

品中的广泛应用。

4.1sOD在医疗临床中的应用

由于本身就是生物体内存在的酶,sOD在医疗

临床中应用具有先天优势,可以克服某些合成药物

带来的副作用。sOD在医疗临床中的应用范围主要有:①延缓衰老,清除自由基,阻止自由基连锁反应

的作用怛3|;②治疗炎症性疾病,如最近的研究表明cu/zn.s0D是布鲁士流产菌的抗体免疫原m3;③治

疗缺血.再灌性综合症,sOD可明显减轻对组织器官的损坏程度瞄]【26I;④防治肿瘤和癌症,抑制或加强sOD作用均可以作为治疗和预防肿瘤研究的思路和方法‘2引。

4.2SOD在食品工业中的应用

sOD进行化学修饰和微胶囊化后,稳定性大大

提高,且本身活力也保持较高水平。因此极大地促

进了s0D在食品工业中的应用,主要有:①作为保

健食品的有效成分,如作为添加剂加入保健品口服液、酸奶、啤酒等;②作为抗氧化剂,抑制过氧化酶的作用,如用于果蔬采后保鲜。

4.3sOD在化妆品中的应用

作为化妆品的添加剂,sOD的作用主要是心8|:

①有明显的防晒效果,sOD可有效防止皮肤受电离

辐射的损伤;②有效防治皮肤衰老、祛斑、抗皱,起抗

氧酶的作用;③有明显的抗炎作用,对防治皮肤病有

一定疗效;④有一定的防治瘢痕形成的作用。研究

证实外源性sOD能够渗入皮肤进入体内作用,且无

不良反应和过敏现象。

5展望

万方数据

第6期化学世界

自1968年首次发现SOD以来,相关的研究一直是化学生物界热门的研究课题。然而,仍有许多工作有待于进一步研究。

在SOD理论研究方面,不少问题还未研究或者有待深人,如对SOD进行化学修饰后,修饰酶的代谢过程及具体的毒副作用等方面都要深入研究。

在sOD的应用研究方面,也有一些问题急待解决。如:①在临床应用方面,要进一步阐明sOD在体内的抗氧化过程,要延长sOD在体内的半衰期,减少其对机体的毒副作用等;②在食品工业方面,要确保口服sOD有效性,使之不被胃蛋白酶分解等;

③在化妆品应用方面,要准确地测定SOD的活性大小,同时要明确化妆品基质对sOD活性和稳定性的影响。

如果以上问题能够得到很好的解决,相信sOD 的研究与应用必将有个美好的前景,造福人类。

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农药乳油的碳化钙法

除酸脱水工艺研究

郑仕远

(渝西学院化学与环境科学系,重庆永川402168

众所周知,酸、水含量是农药乳油的两项质量指标,如果酸、水超标,则会引起乳油浑浊、分散性、稳定性显著降低。因此,除酸脱水技术在酸、水含量超标的农药乳油的后期处理中占有极其重要的位置,故除酸脱水工艺的研究已成为乳油生产技术研究中的重要课题之一。

目前,农药乳油的脱水有两种方法:减压蒸馏法【11和分子筛法陋。9]。减压蒸馏法是以有机溶剂作带水剂的共沸脱水法,工业应用己获成功…,虽然该法能实现农药乳油的脱水,但蒸馏单元的增加,造成了设备投资的增加和成本的提高;而分子筛法则是利用3A分子筛的高选择吸附性能脱水,该法虽然工艺简单、成本低,但分子筛的活化处理麻烦,给规模化的工业生产带来了一定的困难,技术的应用尚们

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超氧化物歧化酶(SOD的研究和应用进展

作者:林庆斌, 廖升荣, 熊亚红, 乐学义, LIN Qing-bin, LIAO Sheng-rong, XIONG Ya-hong, LE Xue-yi

作者单位:华南农业大学理学院,广东,广州,510640

刊名:

化学世界

英文刊名:CHEMICAL WORLD

年,卷(期:2006,47(6

被引用次数:16次

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氧阴离子自由基(O-·2与超氧化物歧化酶(SOD活性的研究 -高等学校化学学报1999,20(3 合成了4种硫代碳酰腙类化合物双水杨醛硫代碳酰腙(BSTZ、双对羟基苯甲醛硫代碳酰腙(BHBTZ 、双香兰素硫代碳酰腙(BMHBTZ和双邻香兰素硫代碳酰腙(BMSTZ,其中苯环醛基对位具有羟基的BHBTZ和BMHBTZ能与超氧阴离子自由基(O-.2、H2O2发生显色反应,而且BMHBTZ与O-.2的反应灵敏度为最高 ,由此建立了流动注射-光度法测定超氧阴离子自由基(O-.2的方法.此方法的线性范围为4.5×10-7～1.5×10-6 mol/L,线性方程为A698=1.8×104c(O.2+0.004 5,相关系数

r=0.998 4,检出限为1.0×10-7 mol/L.相对标准偏差为5.23%.大多数生物样品中共存物质无干扰. 2.学位论文冉良骥新型超氧化物歧化酶生物传感器的研制及清除超氧阴离子自由基药物的筛选方法 2003 为了考察和比较药物对超氧阴离子的清除能力,该文设计了一种新型的超氧化物歧化酶传感器,以邻苯三酚的自氧化作为超氧阴离子的发生源,同时以光纤氧传感器监测自氧化速度,传感器中预置的固定化铜锌超氧化物歧化酶的响应作为内标,通过对比加入药物前后自氧化速度的变化情况,可获得药物清除超氧阴离子自由基能力的相关信息.整个课题包括以下几个部分.第一部分、光纤氧传感器的研制,该文以TEOS、MTEOS共水解,通过溶胶凝胶法制膜固定自制的荧光试剂RuBPPP,制备了新型的光纤氧传感器,并对制膜方法进行优化.结合Stern-Volmer曲线的绘制及样品的测定,对方法进行了全面评价.第二部分,铜锌超氧化合物歧化酶(CuZnSOD的固定,通过比较由不同方法固定铜锌超氧化物歧化酶的酶活力,该文最终选择以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂对铜锌超氧化物歧化酶进行了固定,并对固定化条件进行了初步的优化,研究了pH、戊二醛浓度对固定化超氧化

物歧化酶活力的影响.第三部分,超氧化物歧化酶传感器的组装,该课题将基础光纤氧传感器和固定化CuZnSOD以特定装置组装,构建了超氧化物歧化酶传感器.测定条件的优化结果如下:邻苯三酚的浓度为1mmo1/L、溶液pH为8.6、测定温度为25℃、固定化酶的加入量为50mg、搅拌速度为低速.第四部分,清除氧自由基药物筛选方法的建立和初步应用,该课题以已知有氧自由基清除作用的确良Vit C为阳性对照,用自制的超氧化物歧化酶传感器为检测手段,建立了清除氧自由基药物的体外筛选方法,结果发现 ,在Vit C不同浓度下测定的结果均有较好的重现性,方法可用于其它药物的筛选.该课题首次采用壳聚糖-戊二醛交联的方法对超氧化物歧化酶进行了固定 ,并建立了清除氧自由基药物的体外筛选新方法. 3.会议论文唐波.杜鸣.杜建云酶催化偶联反应光度法测定超氧阴离子自由基与超氧化物歧化酶活性的研究1998 在ＨＲＰ催化下，Ｏ〈，２〉〈’－〉氧化Ｎ，Ｎ－二甲基苯胺（ＤＭＡ）与４－氨基安替比林（４－ＡＡＰ）发生偶联反应，由于水中溶解氧不能氧化ＤＭＡ与４－ＡＡＰ偶联，而Ｈ〈，２〉Ｏ〈，２〉则可以，故可用Ｈ〈，２〉Ｏ〈，２〉浓度与Ａ的线性关系间接表达Ｏ〈，２〉〈’－〉量与Ａ的关系。方法测定Ｏ〈，２〉〈’－〉在０－６．１×１０〈’－５〉ｍｏｌ／Ｌ范围内与Ａ〈，５５４〉有良好的线性关系，方法检出限１．２×１０〈’－７〉ｍｏｌ／Ｌ，相对标准偏差２．８℅。利用此反应测定了超氧阴离子自由基（Ｏ〈，２〉〈’－〉）以及超氧化物歧 4.学位论文马淑慧羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究 2009 生命活动的代谢过程中不断产生各种活性氧自由基(ROS，羟基自由基(·OH，超氧自由基(O2·-是其中具有代表性的两种自由基，它们与生物体的衰老及许多疾病的发生都有重要关系。 ·OH是一种氧化能力很强的自由基，能很容易地氧化各种有机物和无机物，氧化效率高，反应速率快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的活性氧，与机体的衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关。O2·-不仅自身具有毒性，而且可以经过一系列反应生成其它活性氧自由基，进一步对生物体产生损伤作用，且停留时间较长。人体内总自由基中约95％以上属于活性氧自由基，因此活性氧自由基的研究对人体有着特殊的意义。通过对活性氧自由基的检测研究，可以帮助我们更好的解释疾病产生的原因，加强有效的预防措施，减少机体的伤害程度。另外在衡量保健食品的抗氧化能力和中草药抗

氧化物质的筛选中具有重要的指导意义和理论价值。活性氧自由基反应性强，存在时间短，不易进行直接测定。目前国内外已有较多间接测定·OH和O2·-的方法。本研究在全面了解这些方法的基础上，研究了利用荧光分析技术测定活性氧自由基的方法，因为此技术具有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点。本文合成了两种新型荧光探针，同时对这两种探针进行了检测选择性的研究，探讨了部分抗氧化剂对活性氧自由基的清除作用。具体研究内容分为以下三点： (1通过鸟苷与过氧化氢光解反应，形成荧光物质8-羟基鸟苷，分析8-羟基鸟苷在不同条件下存在的形式及不同存在形式与荧光强度的关系。探讨羟基自由基产生及其与鸟苷反应的条件，根据荧光强度与羟基自由基的量效关系，研究羟基自由基与鸟苷作用的分子机理，探讨茶叶提取液和大蒜提取液通过清除羟基自由基对鸟苷的保护作用。 (2设计合成一种新的荧光探针试剂-2-(2'-吡啶亚胺甲基苯酚，建立检测O2·-和SOD活性的荧光方法，研究测定方法的最佳条件，并用于大蒜、菠菜、木瓜中SOD活性的测定，并与邻苯三酚自氧化法测定出的SOD活性进行了比较。 (3建立了一种以2-(2'-噻吩基苯并噻唑啉为新型荧光探针测定O2·-和SOD活性的荧光分析方法，探讨了其它物质对体系的干扰影响及荧光探针的检测单一性，研究测定方法的灵敏度，精密度，本法成功应用于大蒜、洋葱等生物样品中SOD活性的测定。本论文首次对羟基自由基与鸟苷作用分子机理的荧光分析做了相关研究，并合成了新型荧光探针，用于O2·-和SOD活性的测定，且2-(2'-噻吩基苯并噻唑啉对O2·-的检测具有专一性，得到较为满意的结果，但是也存在一些不足之处，如鸟苷与过氧化氢光解反应体系中测定·OH的含量时灵敏度还不够高，还需进一步探讨。活性氧自由基的测定方法还未能很好的应用于动物体的检测，有待进一步完善。 5.期刊论文罗立新.孙铁珩.靳月华.Luo Lixin.Sun Tieheng.Jin Yuehua 镉胁迫下小麦叶中超氧阴离子自由基的积累 -环境科学学报1998,18(5 在镉胁迫下,小麦叶中超氧阴离子自由基(的积累显著增加,伴随MDA含量升高,显示发生膜脂过氧化.镉胁迫使活性氧清除酶系统功能紊乱,其中SOD酶活性下降,POD酶活性升高,而CAT 酶活性无显著变化.SH基的含量下降与电解质泄漏加剧呈负相关,表明细胞质膜的结构和功能都受到损伤.推测小麦受镉伤害过程中,活性氧代谢失衡造成的膜脂过氧化起着重要作用. 6.学位论文李福祥内源性超氧阴离子自由基对Eca-109食管癌细胞