人中性粒细胞弹性蛋白酶与其抑制剂研究

人中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂研究

人中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophi l elastase，HNE)在机体各种炎症反应、组织损伤重构（如肺炎）、成人呼吸窘迫综合征、肺纤维化、急（慢）性肺损伤、肺水肿、动脉粥样硬化、硬皮病等病理过程中起重要作用，并且具有促进病毒、细菌的侵人及癌细胞转移的功能。炎症机制研究显示，体内该酶及其内源性抑制剂的平衡失调可导致组织基质降解和炎症的恶化。目前，国外用HNE抑制剂来治疗这一类炎症疾病的研究非常广泛，并已成功开发出第一个以抑制HNE为治疗途径的上市药物西维来司钠（sivelestat sodium hydrate），从而促进了HNE抑制剂的研究与开发。

1 BM的生理、病理作用及结构特征

HNE，又称人白细胞弹性蛋白酶（human leukocyte elastase，IRE），属于基质金属蛋白酶类（matrix metalloproteinases,MMPs），即MMP-12,是一种金属离子依赖性基质降解酶，需要微量Zn2+和Ca2+离子的存在才具有酶活性，其底物类型非常广泛，几乎可降解细胞外基质中的所有蛋白。白细胞、巨嗜细胞、肥大细胞内都存在着这种酶，中性粒细胞中其含量很高，大约每106个细胞中含有HNE的总量为 3μg。生理条件下，HNE可以协助清除异源性物质，促进吞噬细胞消除有害病菌，并帮助消化受损组织，有助于伤口的愈合与组织再生。而HNE过量表达则会对机体组织、基质造成危害，表现为破坏血管壁组分，使中性粒细胞更容易渗出血管并向炎症部位趋化集中及释放IL-8、TNF-α等炎症因子；它还能降解细胞基质，催化caspase 3诱导的细胞凋亡。据报道，HNE还能增强病毒、细菌及癌细胞对正常细胞的黏附能力，促进微生物的入侵及癌细胞的增殖和转移。

HNE存在于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中，是由 218个氨基酸组成的单一肽链，分子质量大约25.9 kD，含4个二硫键，是丝氨酸蛋白酶家族一员，因此与其他丝氨酸家族蛋白酶具有30%～40％的同源性，最适pH值接近中性。HNE的基因位于19号染色体的短臂末端，是50kb的DNA片段，成熟的中性粒细胞中并无HNE的mRNA表达，说明此种酶只在未成熟的

骨髓细胞中合成。酶的催化中心由 His 41、Asp 88和Ser 173三个氨基酸残基构成，空间位置相互靠近，均由发夹结构延伸到蛋白表面，其中 Ser残基侧链上羟基具有很高的亲核性，容易结合不带电的小分子氨基酸，如Val、Ala、Leu、Met等。

2 BM抑制剂

HNE对机体会产生各种病理作用，故关于其抑制剂的研究也受到广泛关注，其中包括内源性抑制剂、合成的外源性抑制剂（蛋白类、拟肽和杂环化合物）以及天然提取物等。

2.1 内源性抑制剂

人体内存在许多种针对HNE的快速反应抑制蛋白，每一种蛋白存在于不同的生理部位而发挥不同的作用。选择性HNE抑制剂Elafin存在于皮肤及上皮组织中，分子质量为7 kD，是酸稳定性多肤；α1- 抗蛋白酶（α1-antiprotease）在血浆中具高浓度，并由此进入组织发挥作用。上述内源性抑制剂包括α2- 巨球蛋白均为分泌性弹性蛋白酶抑制剂，其中α1-抗蛋白酶被认为是在体内各种脏器中起主导作用的内源性HNE抑制剂。

2.1.1 α1-抗蛋白酶它在许多生理、病理过程中（如血液凝结、纤维蛋白溶解、炎症等）起调节蛋白分解的作用，并且对防止蛋白水解性组织损伤起重要作用。据报道先天性α1-抗蛋白酶缺损极易引发肺气肿和自发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosi s）。

α1-抗蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员，存在于血浆中，平均分子质量约50 kD，含有3 个β片层结构和若干α螺旋结构，其中Met 358决定了它对HNE的抑制特异性，HNE与之结合后形成稳定酯结构，致使酶的活性中心构象发生改变，不能去酞基化，这种抑制机制被称为自杀性底物抑制。对α1-抗蛋白酶的结构研究显示，它和其他HNE拮抗剂一样，在酶结合位点或附近的Met上的硫醚键对化学氧化非常敏感，一旦Met被亚砜化后，α1-抗蛋白酶即失活。

在体内氧化自由基的增多是造成这种内源性抑制剂失活的主要原因，中性粒细胞分泌出的髓过氧化物酶通过过氧化酶-过氧化氢-卤化物系统使α1_ 抗蛋白酶氧化失活，从而达到HNE活性增高，促进细胞渗透转移的目的。在体外试验中，中性粒细胞中的过氧化物系统可使α1-抗蛋白酶在10秒之内失活50%，20秒之内完全失活。

2.1.2 Elafin 它是一种被研究得比较深入的内源性抑制剂，又称为弹力素，属于Trappin-2基因家族。它在多种上皮组织中表达，如毛囊、食管、阴道和口腔中等。在人皮肤正常组织中没有表达，但在皮肤受外伤和牛皮癣等炎症反应时则会强烈地表达。翻译后的elafin蛋白质前体是由117个氨基酸组成的多肤链（12.3 kD），包括由22个氨基酸组成的信号肤，其活性部位在C端，以4个二硫键为中心。在切除了信号肽后，该蛋白质变成分子质量为9.9 kD的成熟蛋白，即elafin。研究表明，在HNE诱导的急性肺损伤仓鼠模型中，于诱导前1小时经气管给予 elafin，其抑制HNE的IC50为8.1μg/kg。

目前对elafin的研究着眼于其在动脉粥样硬化、心脏移植后冠状动脉疾病、心肌坏死以及呼吸道炎症等方面的治疗效果。异体心脏移植后冠状动脉疾病及其后遗症是器官接受者患有的主要并发症，发病原理与冠状动脉血管壁增厚有关，而由HNE活性升高引起的弹性蛋白降解沉积、IL-1活性增高、纤维连接蛋白合成、平滑肌细胞转移等在冠状动脉血管壁增厚过程中起关键作用。在家兔心脏移植模型中，给予重组人elafin可以有效的降低HN E活性，形态学、免疫组化和生化分析表明，与对照组相比， elafin给药组家兔的血管壁增厚程度降低 70%。将elafin基因引入嫁接后的血管中，可以有效减少血管嫁接早期的炎症发生和减少细胞外弹性蛋白量；虽然elafin会导致血管内膜形成减缓，总体上仍具有防止血管粥样硬化恶化的效果。

2.2 外源性抑制剂

对合成类HNE抑制剂的研究已有约20年历史，其间涌现出大批很有前景的小分子合成物。然而到目前为止，仅有西维来司钠作为治疗全身性炎症反应综合征（systemic in

flammatory response syndrome，SIRS）的HNE特异性抑制剂上市。合成类 HNE抑制剂又包括蛋白类、三肽或四肽和氮杂环类化合物等，此外，有报道称β内酰胺类抗生素和苯基丁氮酮类上市老药对HNE也有抑制作用。

2.2.1 蛋白类抑制剂采用分子生物学的方法，通过对酶与多肽类抑制剂相互作用的分析研究，可以揭示两种分子的识别方式，从而为蛋白类抑制剂药物设计提供思路。在蛋白类抑制剂的研究中，采用构建的限制性结构组合肤库，筛选HNE的特异底物，这种方法筛选得到的抑制剂其优点在于分子质量低，且特异性高。有文献报道，从此多肽库中筛选得到的HNE抑制剂在序列上具有很高的同源性，并且对其重组蛋白的分析表明它们均具有HNE 抑制作用，抑制常数Ki可达65 nmol/L。

在对天然HNE抑制剂的研究过程中发现，每种抑制剂与HNE活性中心结合的作用位点（P1）几乎都在一个延伸出来的环上，而P1位点上的氨基酸残基主要决定抑制剂的抑制特异性。HNE容易与P1位点上有小烷基侧链的底物结合，尤其易与Val残基结合。构建的多肽按照天然底物的结构形式，形成环状结构，可将P1位点递呈到酶的活性中心。在此结构基础上，对P1和其他位点的氨基酸残基进行修饰，使之进一步成为对HNE具有高度选择性的化合物。据报道，限制性结构组合肽库同样可以用来筛选α-胰糜蛋白酶、猪胰弹性蛋白酶等丝氨酸蛋白酶的抑制剂，并且研究发现这几种酶的活性中心具有一定的同源性，因此筛选出的大部分抑制剂可以同时抑制这一类酶。

2.2.2 西维来司钠2002年11月，氮杂环类化合物西维来司钠（商品名Elaspo l）在日本上市，其化学名为N-[2-[4-(2，2-二甲基丙酸基）苯磺酰氨基丁氨基乙酸钠，分子质量为528.51 D，适应证是全身性炎症反应综合征和急性肺损伤，且正在进行用于呼吸窘迫综合征治疗的n期临床试验。它可改善肺损伤病人的呼吸功能，缩短使用呼吸器的时间，降低安装呼吸器引起的压力性损伤及呼吸道感染的并发率，减轻或缓解全身性炎症反应综合征及特发性肺纤维化等引发的急性肺损伤；另外，它还能使病人尽早脱离危险期。由于本品可治疗与非典型性肺炎临床表现密切相关的症状，我国已于2003年5月批准对其进行临床

试验，它是我国发生非典型性肺炎后首个通过“绿色通道”加快批准进入临床试验的药物。

以琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-N-对硝基苯胺为底物的酶抑制实验表明，西维来司钠对HNE的IC50为 (0.044±0.003)μmol/L,抑制常数K i为(0.20±0.02) μmol/L。西维来司钠是HIVE的竞争性抑制剂，并且具有很高的专一性，即使在浓度为100μmol/L时，它对胰蛋白酶、凝血酶、纤溶酶、激肽释放酶、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶G等仍没有抑制作用，对猪胰弹性蛋白酶仅有很微弱的抑制作用，其IC50是对 HNE的IC50的130倍。而它对各种试验动物，如小鼠、仓鼠、大鼠、狗及家兔的中性粒细胞弹性蛋白酶都有抑制作用，且酶学反应测得的其IC50甚至比对 HIVE的IC50更小。

西维来司钠在各种肺部疾病如肺纤维化、急／慢性肺损伤、肺出血、肺炎、肺癌等的动物及体外模型中均表现出良好的药理作用。给伯莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型静脉注射本品，可以减少成纤维细胞的生成，降低中性粒细胞在炎症部位的聚集数量以及炎症因子如IL-1β、血小板源生长因子（PDGF）、巨嗜细胞炎症蛋白-2、胰岛素样生长因子A等的mRNA表达。从总体药效来看，与对照组模型相比，西维来司他钠可以明显改善肺纤维化程度，并主要作用于发病急性期。

目前西维来司钠的药效研究已进一步扩展到用于肺癌、肝癌细胞转移抑制及治疗肾炎、胰腺炎等，其应用前景广阔。

3 HNE的体外表达研究

体外筛选HNE抑制剂使用的酶绝大部分是从人白细胞中提取获得，由于提取成本昂贵，得率不高，且血液制品缺乏安全性，迫切需要寻找替代的酶生产方法。为了更快速、有效、大量的筛选HNE抑制剂，有人进行了HNE的体外表达纯化。

3.1 全酶表达

由于HNE对大肠杆菌细胞壁组分具有降解作用以及在T7启动子表达系统中难以获得有活性的 HNE，酶完整cDNA克隆表达研究采用了M13噬菌体系统。HNE的cDNA位于人白细胞株cDNA文库中，由编码8个氨基酸残基的IL-2前导肽DNA以及 238个氨基酸残基的H NE前体DNA组成，以可溶性蛋白的形式表达，并可以通过赖氨酞内肽酶切割获得有活性的H NE。表达纯化后所得HNE经一系列酶活性检测和与抑制剂反应的检测，表明其性质与天然H NE极其相似（见表1)。这种表达系统中，每毫升发酵液可以产生5μgHNE（3～4天），与天然 HNE提取方法相比并没有多大优势（每毫升全血中可得2.36μg HNE）。

表1 重组HNE和天然HNE与抑制剂的结合活性比较

（Tab 1.The comparation of combining activities of recombinant

HNE and native HNE with inhibitors）——————————————————————

抑制率(%)

抑制剂(0.1g/L)———————————————

重组HNE 天然HNE ——————————————————————

胰蛋白酶抑制剂 93 73

α1-抗蛋白酶 78 47

糜蛋白酶抑制剂 0 0 ——————————————————————

3.2 酶催化结构域表达

MMPs的催化结构域通常和其完整蛋白酶具有一样的催化效果，并且可被用来进行其抑制剂的筛选，这就使单独表达酶催化结构域多肽片段，以实现高通量筛选药物具有可行性。另外，采用催化结构域单独作用，还具有比全酶更高的稳定性，可能是因为缺失了C 端自我降解结构的缘故。

HNE催化结构域（Phe100-Gly263）片段DNA是缺失前导结构和血液结合素样结构的平头末端蛋白 DNA序列，以pGEMEX质粒为载体，在大肠杆菌中表达，经过复性、提取纯化后获得的每升菌液可产生蛋白量约为23 mg比天然蛋白酶提取法及全酶表达法的产率大大提高。蛋白几乎全部存在于包含体中，经上柱纯化，并在Ca2+、Zn2+存在下稀释复性成为目的蛋白。酶活性分析表明，该蛋白在pH 8.0时具有与全酶相同的底物水解能力及相同的底物选择性。经纯化的蛋白质片段对7036种化合物以及1524种混和物进行抑制活性筛选，结果得到27种活性良好的化合物，证实了这一研究方法的可行性。

4 结语

目前，对HNE与其底物及抑制剂之间相互作用的机制研究已相当成熟，因此基于结构作用理论开展高通量筛选酶抑制剂将会比传统的寻找方法更为高效、更有目的性。然而，酶表达纯化方面的技术还有待发展和完善。HNE的致病机制已经越来越引起人们的关注，其抑制剂的探索工作仍将继续，且前景看好。