微生物测定发展简介

微生物生长测定的发展

微生物生长情况可以通过测定单位时间里微生物数量或生物量(biomass)的变化来评价。通过微生物生长的测定可以客观地评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响，或评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果，或客观地反映微生物生长的规律。因此微生物生长的测量在理论上和实践上有着重要的意义。微生物生长的测定有计数、重量和生理指标等方法。

1、计数法

此法通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。计数法又分为直接计数和间接计数两类。

直接计数

这类方法是利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积l mm2和高0.1mm的计数室，在1mm2的面积里又被刻划成25个(或16个)中格，每个中格进—步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成。

将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计算4-5个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品所含的细菌数。

每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×l000×稀释倍数

间接计数法

又称活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.2ml 故人无菌平皿，再倒人适量的已熔化并冷至45℃左右的培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放人适宜温度的培养箱或温室培养，长出菌落后，计数，按下面公式计算出原菌液的含菌数：

每毫升原菌液活菌数＝同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×稀释倍数×5

此法可因操作不熟练造成污染，或因培养基温度过高损伤细胞等原因造成结果不稳定。尽管如此，由于该方法能测出样品中微量的菌数，仍是教学、科研和生产上常用的一种测定细菌数的有效方法。土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含细菌、酵母、芽孢与孢子等的数量均可用此法测定。但不适于测定样品中丝状体微生物，例如放线菌或丝状真菌或丝状蓝细菌等的营养体等。

除上述两种常用的计数方法外，还有膜过滤法、比浊法。膜过滤法是当样品中菌数很低时，可以将一定体积的潮水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数；比浊法原理是在一定范围内，菌的悬液中细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借助于分光光度计，在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(optical density，即O..D.)表示菌量。实验测量时一定要控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。微生物计数法，发展迅速，现有多种多样的快速、简易、自动化的仪器和装置等方法。

2、重量法

此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重，如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放人干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。

如果要测定固体培养基上生长的放线菌或丝状真菌，可先加热至50℃，使琼脂熔化，过滤得菌丝体，再用50℃的生理盐水洗涤菌丝，然后按上述方法求出菌丝体的湿重或干重。

除了干重、湿重反映细胞物质重量外，还可以通过测定细胞中蛋白质或DNA的含量反映细胞物质的量。蛋白质是细胞的主要成分，含量也比较稳定，其中氮是蛋白质的重要组成元素。从一定体积的样品中分离出细胞，洗涤后，按凯氏定氮法测出总氮量。蛋白质含氮量为16%，细菌中蛋白质含量占细菌因形物的50%一80%，一般以65%为代表，有些细菌则只占13%一14%，这种变化是由菌龄和培养条件不同所产生的。因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式计算：

蛋白质总量＝含氮量×6.25

细胞总量＝蛋白质总量÷(50%～80%(或65%))≈蛋白质总量×1.54

核酸DNA是微生物的重要遗传物质，每个细菌的DNA含量相当恒定，平均为8.4×10-5ng.因此从一定体积的细菌悬液中所含的细菌中提取DNA，求得DNA含量，再计算出这一定体积的细菌悬液所含的细菌总数。

3、生理指标法

对于一些非真溶液的样品，要测定微生物数量除了用活菌计数法外，还可以用生理指标测定法进行测定。生理指标包括微生物的呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等。这是根据微生物在生长过程中伴随出现的这些指标，样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。这类测定方法主要用于科学研究，分析微生物生理活性等。

BACTOMETER

全自动各类总菌数及快速细菌检测系统可以数小时内获得监测结果,样本颜色及光学特征都不影响读数,对酵母和霉菌检测同样高度敏感原理是利用电阻抗法(IMPEDANCE TECHNOLOGY)将待测样本与培养基置于反应试剂盒内,底部有一对不锈钢电极,测定因微生物生长而产生阻抗改变.如微生物生长时可将培养基中的大分子营养物经代谢转变为活跃小分子,电阻抗法可测试这种微弱变化,从而比传统平板法更快速监测微生物的存在及数量.测定项目包括总生菌数,酵母菌,大肠杆菌群,霉菌,乳酸菌,嗜热菌,革兰氏阴性菌,金黄色葡萄球菌等。

一、系统概况

BACTOMETER 是一全自动微生物监测系统，主要部分由BPU电子分析器/培养箱、电脑、彩色终端机及打印机组成。

样本在BPU电子分析器/培养箱中恒温培养，仪器及每六分钟对每个样本进行检测，监测其微生物生长情况。电脑部分分析资料的储存，系统的操作及分析程式的运作。彩色终端机以不同色彩显示试验结果及曲线图表。

Bactometer是唯一能利用电阻抗(Conductance)、电容抗(Capacitance)或总抗阻(Total Impedance)三种参数的监测系统、Bactometer可处理64至512个样本(视型号而定)。

二、应用原理

电阻抗法(Impedance technology)操作时将一个接种过的生长培养基置于一个装有一对不锈钢电极的容器内，测定因微生物生长而产生的阻抗(及其组分)改变。例如微生物生长时可将培养基一些大分子营养物质(蛋白质、碳水化合物等)，经代谢转变为较小但更为活跃的分子(氨基酸、乳酸等)。利用电阻抗法可测试微弱的变化，从而比传统平板方法快速监测微生物的存在及计算数量。

生物电阻抗测量（Electrical Bioimpedance Measurement），或简称阻抗技术，是一种利用生物组织与器官的电特性及其变化规律提取与人体生理、病理状况相关的生物医学信息的检测技术。它通常是借助置于体表的电极系统向检测对象送入一微小的交流测量电流或电压，检测相应的电阻抗及其变化，然后根据不同的应用目的，获取相关的生理和病理信息。它具有无创、无害，廉价、操作简单和功能信息丰富等特点，医生和病人易于接受。国外的生物电阻抗测量技术在基础研究方面水平较高，以电阻抗断层成像技术（E I T）为发展方向的新一代生物阻抗技术正吸引着各国越来越多的研究者。国内的生物阻抗技术以应用研究为主，以各种阻抗、导纳血流图为代表的生物阻抗技术已广泛用于临床，并不断取得进展，临床应用水平较高。

电阻抗断层成像（EIT：Electrical Impedance Tomography），或简称阻抗成像，是继形态、结构成像之后，于近20年才发展，出现的新一代医学成像技术，具有功能成像，无损伤和医学图像监护3大突出优势。是一种理想的、具有诱人应用前景的生物信息检测与成像手段。

EIT作为一种廉价的无损伤检测技术，无毒无害，可以多次测量，重复使用，可以成为对病人进行长时间、连续监护而不会给病人造成损伤或带来不适的临床监护设备，填补了临床医学图像监护的空白。在灾难、事故急救中用于跟踪颅脑、胸、腹部等体内组织和器官渗血或血、水、气肿的发生与发展过程、及时报警，获得宝贵的抢救与治疗时间，以及在心、脑、肺血管系统功能动态连续图象监测等方面将发挥重要的作用，这是目前的CT、超声等成像技术无法与之相比的。

EIT的发展虽然只有约20年的历史，却以其无损伤、低成本和功能性图像的独特优势吸引了全世界越来越多的研究者。国外的EIT研究一直很活跃。每年都有新的研究进展和成果发表。3年一次的国际生物电阻抗会议（ICEBI）上，有关EIT的研究论文占第一位。分布在世界各国的EIT研究小组已超过20 个。英、美、法、德、荷、西班牙、俄罗斯、澳大利亚、以色列、日本、韩国等都有相关的研究工作，其中的一些小组已由实验室研究向临床应用研究过渡。

参考文献：

任超世. 生物电阻抗测量技术. 中国医疗器械信息2004（01）

微生物生长测定的几种方法. 中国食品科技网. 2013.7.22

刘华. 微生物生长的测定方法. 神州. 2013(6)

胡宝龙, 林勇. 微生物生长量测定系统, 实验技术与管理, 1995(4)

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