蛋白质组学在肿瘤研究和临床应用中的意义
蛋白质组学在肿瘤研究和临床应用中的意义
李春海
中国抗癌协会、军事医学科学院
在人类基因组计划的实施和完成后，研究重点已转移到基因的功能上，从而进入基因组时代。而生物功能主要执行者是蛋白质，1994年澳大利亚Macquarie大学的wilkius 和williams首先提出蛋白质组学（Proteome）的概念，Proteome一词是蛋白质（protein）与基因组学（genome）两个词的组合，指的是一种基因组所表达的全部蛋白质，既包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质，而蛋白质组的研究是功能基因组学研究的核心，称为蛋白质组学。其主要内容包括结构蛋白质组和功能蛋白组学，它是从细胞整体水平进行蛋白质特性的研究，如表达水平、翻译后修饰及相互作用等，并由此获得对疾病过程、细胞生理、生化特征和调控网络的广泛完整的认识。所以，蛋白质组学及其技术正在逐步成为生物学、医学及药物学等的理论依据和研究手段。
一、 肿瘤标志筛查策略
1、肿瘤检查传统方法
大多数肿瘤早期无明显症状，因此对肿瘤高危人群进行筛查（Screening）尤为主要，肿瘤筛查是对一般健康的无症状的人群，用适当的指标对其进行检查，从而发现一些指标阳性的人群，并对这些人群或高危人群进一步进行临床检查和随访观察，从而达到早期发现、早期诊断、早期治疗的目的。以往，早期的肿瘤筛查多采用临床上常用检查方法：图像诊断（CT、MRT、PET）化学诊断，（血液学和免疫学）及病理学（细胞学、组织学）如细胞病理学检查；X线检查及各种内窥镜检查；和实验室生化检查，如甲胎蛋白用于肝癌的筛查，前列腺特异抗原用于前列腺癌的筛查，癌胚抗原用于大肠癌的筛查等。其中许多检查目前仍在应用，并取得了良好的效果。此外还有一些经典检查方法如瑞典的一项调查结果表明应用X线以及乳腺自查方法对乳腺癌进行筛查使乳腺癌病死率下降44%[2]。应用巴氏涂片对人群进行宫颈癌筛查使美国宫颈癌死亡率下降70%。
但上述方法应用于人群筛查仍存在很多缺点，主要是有一些属于损伤性检查。筛查方法操作过于复杂、对人体的侵害性较大，人群依从性差及成本高，而有一些肿瘤标志虽然可应用于人群的肿瘤筛查。如PSA用于前列腺癌筛查虽然特异性好，但敏感性差，导致部分患者被漏查；甲胎蛋白用于肝癌筛查由于特异性较差，阳性预测值较低，出现假阳性。因此，肿瘤筛查要选择适当的方法，提高其可操作性及人群依从性，选择高度特异性的标志物，或多种标志物联合检测来提高敏感性和特异性。
2、肿瘤发生发展过程与肿瘤标志的筛选
肿瘤发生过程是一种多基因多阶段多因子的部复杂过程,是癌基因激活和抑癌基因失活的结果.而从组织增生产生原位癌变的过程中，肿瘤发生、启动、增生、癌前病变到成癌过程中除了基因水平的变化外，而在分子水平还有不同的功能性蛋白的参与,这就为寻找与癌变过程有关的相对特异肿瘤标志物提供了线索。
肿瘤进展阶段是处于癌变与成癌之间的一个过渡阶段,早期发生突变并表达的基因在此阶段表达量进一步增强,为侵袭转移提供潜在的动力。转移也是多步骤复杂连续的过程，与转移有关的特殊基因受到激活，并有多种蛋白水解酶的参与。总之，肿瘤在发生发展和转移的过程中,每演进一步在分子水平就有不同的功能性蛋白参与,并且很可能在各个环节相互协调共同表达。因此从肿瘤发生、发展、演进过程的筛选与肿瘤相关的起关键性调控作用的标志,无论从理论上还是从实际的研究来说都是可能的。
最初在寻找分子标志的时候,仅仅局限与某些特定的突变型蛋白(如C-erB-2、p180、雌激素受体等)与表达增强的突变型的蛋白（P53, CycliD 1[3]等）,它们不但可以作为早期发现肿瘤的标志,而且可以作为肿瘤进展程度的标志.但是随肿瘤恶化程度的增加，多种基因发生突变,已很难从单个蛋白的变化对肿瘤进行诊断分型以及预后判断。因为单个蛋白仅仅是肿瘤恶性发展过程中单一因子的变化，并不能真正反映出癌变过程多种因子的复杂变化.蛋白质组学技术能对不同肿瘤的蛋白表达谱进行全面的分析，这样可筛选出多种肿瘤标志为肿瘤标志物的联合检测提供更多依据。
3、蛋白组学在肿瘤标志筛选中作用
目前仅靠原有传统免疫检测技术：如免疫荧光、免疫酶标、免疫印迹以及分子原位杂交等技术,检测癌组织和细胞中的微量表达的组织特异性抗原\细胞系抗原或糖链异常合成的糖蛋白以及肿瘤相关的癌基因、抑癌基因等，但是这不能满足目前临床需要。为了寻找和筛选新的肿瘤相关标志物，需应用先进分子生物学技术,尤其是近年来迅速发展的基因组学,蛋白质学技术及生物信息学。以PCR技术为基础的微卫星技术和单核苷酸多态性(SNP)的测定，使人们可以通过特定引物从患者的体液或肿瘤样品中直接扩增出微量表达的基因,它比传统的PCR技术测定数效率高、目的性强、定位精度高和易于进行自动化分析等优点.而基因芯片与微卫星技术和SNP结合,为高通量、自动化寻找肿瘤相关基因标志提供新的技术途径。
而PCR技术和基因芯片都是通过基因型寻找新的肿瘤基因标志,但不是从具有生物功能的蛋白质进行分析。虽然从mRNA水平能够快速研究相应转录子的表达谱，但在翻译的过程中要进行磷酸化、基化、乙酰化、糖基化等修饰，并不能了解肿瘤发生发展过程中蛋白表达质与量的变化,体内mRNA与相应蛋白的表达水平并没有直接的关系。而细胞信号转导途径中各信号蛋白之间的交流与细胞是否处于休眠静息、分裂增殖、分化，凋亡还是转移等生命活动状态密切有关,而肿瘤的生长依赖多种蛋白质分子，如各种生长因子和酶，而这些蛋白质分子与肿瘤的发生发展有密切关系，因而都可能成为潜在的肿瘤标志。
但是传统的检测方法往往一次只能检测一种肿瘤标志物，而利用单个肿瘤标志物诊断肿瘤，其特异性和敏感性都不够理想。蛋白质组学技术可以高通量快速的筛选肿瘤不同发生阶段基因表达的各种蛋白质，尤其是组织与体液中所含有的与肿瘤相关的低丰度蛋白，从而发现大量有诊断价值的蛋白标志分子，而这些蛋白能够为肿瘤治疗提供新的靶点,为早期诊断提供有效肿瘤标志。联合多种标志物进行肿瘤的筛查将有望提高筛查的特异性与敏感性。
二、 蛋白质组学研究方法
从蛋白质组学分析表明肿瘤是一种蛋白质缺陷病，在其发生过程中有许多蛋白质发生异常变化，而这种变化不仅有蛋白量表达的变化，还有蛋白翻译后加工上的改变，从而导致肿瘤组织表达的蛋白图谱（Protein profile）的变化，所以应用蛋白组学技术检测蛋白图谱的变化可以预测肿瘤发生的变化。目前应用于蛋白组学研究的主要技术有：双向凝胶电泳（Two-Dimensional gel Electrophoresis， 2-DE），质谱技术（Mass Spectrometry ，MS）。微阵列技术（Microarry）和生物信息技术（Bio-Informcnation，BI）。
1、双向凝胶电泳
1）原理
双向凝胶电泳技术主要用于分离肿瘤组织样品或体液中的蛋白质，其基本原理首先根据蛋白质等电点和分子量的差异中进行第二向分离。自Ｏ′Ｆａｒｅｌｌ等提出双向凝胶电泳以来，虽有二十多年的历史，直至目前在蛋白质组研究中仍具有不可替代的地位，因为其具有高分辨率和同时具备微量分析和制备样品的性能，仍应用于膀胱癌、肾癌、甲状腺癌症相关肿瘤标志的筛选和研究中。
2）应用
Ｃｅｌｉｓ［５］等采用双向电泳在膀胱癌病人的尿液中发现了４种蛋白质、银屑素、银屑病相关脂肪酸结合蛋白５、凝胶溶素片段和前列腺素Ｄ２合成酶．银屑素是一种高钙结合蛋白质，主要由鳞状上皮细胞表达，在银屑病角质细胞中表达增高，仅发现于膀胱鳞状细胞癌病人（squamous cell carcinomas，SCC）的组织及尿液中，而在纯移形细胞癌（transitional cell carcinomas，TCC）中难以检测其表达，因此可将银屑素作为膀胱鳞状细胞癌病人的预后标志。而在肾细胞癌的研究中发现血浆谷胱苷肽过氧化物酶、锰弱氧化物歧化酶两种单体出现在正常的组织中，而锰弱氧化物歧化酶只出现在肿瘤组织中，所以可将两种蛋白作为肾细胞癌的肿瘤标志物[6]。LIN[7]等双电泳分析了SW579、CGTH W-1、CGTH W-3、RO82 W-1四株甲状腺癌细胞系，发现CGTH W-1、CGTH W-3、RO82 W-1细胞系中有特异的蛋白质，而这些点可以作为甲状腺的肿瘤标志物。
3）局限性
应用在2-DE技术对病变组织所得分析时，必须慎重，因为一般并不清楚肿瘤进展过程中蛋白质表达的变化是偶然发生的，还是由于来自不同患者的样品之间差异造成的。此外，由于双向凝胶技术本身的问题：如手工操作、难以掌握：很难分离到高级性的蛋白质；由于第二向SDS PAGE的限制，对于低分子量和高分子量的蛋白及样品
内低拷贝数的蛋白很难分离；膜蛋白等疏水性的蛋白在制样的过程中丢失太多等等。若不尽快发展蛋白质分离技术，2-DE将不能满足标志物研究的要求。除此之外染色技术也是制约双向凝胶电泳发展的一个重要因素，现在的染色技术已从传统的考马斯亮蓝染色，发展为胶体考马斯亮蓝染色、胶体银染、锌染和荧光染色技术等。
2、激光捕获显微切割技术（laser capture microdissection，LCM）
1）LCM的原理与特点
利用双向凝胶电泳分析肿瘤组织的时候，往往采用的是复合组织，尤其肿瘤组织的异质性在肿瘤组织中既有分化程度不同肿瘤细胞恶性程度不同而且含有正常细胞。所以，由于它混合有不同的细胞类型，所得电泳结果不能作为正常、癌前病变、低侵袭性和高侵袭性癌细胞的蛋白表达特征。要分析复合组织中疾病发展过程中的关键蛋白的表达模式、功能及变化，必须获取肿瘤癌前病变或癌旁组织中相对纯化细胞甚至单个细胞。最近发展起来的激光捕获显微切割技术[8、9]其突出特点是能高效地从复合组织中，特异性挑选出某一特定的同类细胞，乃至单个细胞，因而特别适用于肿瘤学方面的研究。操作者只要在显微镜下观察选择所需组织或细胞，然后激活显微镜上的一束激光，激光束立即被靶细胞上方转运膜的一个精确点吸收，细胞或组织载体热塑性膜局部温度迅速升高90度左右，后融化并流到靶组织间隙，在激光脉冲结束200m/s内立即冷却，并与靶细胞结合，其结合力比靶细胞与载玻片间结合力更强；此时通过移动与显微镜相连的转运，将靶细胞从组织切片中分离出来。
2) LCM的应用
LCM能避免肿瘤组织的异质性对蛋白分析的影响，可直接将正常组织、癌前病变、低浸润性和高转移的组织细胞分离，再应用双向凝胶电泳与蛋白质芯片技术分析相关蛋白的表达图谱。Emmert Buck[10]等应用LCM技术分析了前列腺癌与乳腺癌及其正常组织，通过改变激光束直径与脉宽，可获得直径在0.3mm~1.0mm的乳腺癌与前列腺癌癌前病变组织，而没有受邻近肿瘤细胞的干扰。
Jones MB[11]等采用LCM等筛选出三个具有侵润特征和两个具有低恶性（low malignant potential，LMP）非侵润表型的卵巢样品，经双向凝胶电泳后，发现有13个蛋白点在具有侵润特征的细胞中表达，而在LMP样品中不表达或仅有弱的表达。经质谱分析后发现52 kDa FK506结合蛋白、RhoGD1（Rho G-protein dissciation inhibitor）、乙二醛酶三种蛋白在侵润性肿瘤中表达，这些特异表达的标志物有可能作为早期发现和治疗的靶点。LCM还可直接对肿瘤样品中特征性标志物进行定量分析。Simon等[12]采用直径为３０mｍ的激光从不均一的前列腺组织切片中显微切割特异性细胞，通过计算每例标本每个所捕获细胞的ＰＳＡ分子含量得出在前列腺正常上皮，上皮肉瘤及浸润性癌中PSA含量依次增高。
2）LCM的局限性
现在双向凝胶电泳联合ＬＣＭ在研究肿瘤相关蛋白表达谱变化仍被普遍采用的，但是在测试过程中需要样品量大，处理时间长，往往需要几天的时间，因此不适用于临床的快速诊断，限制了临床医师应用２－Ｄ ＰＡＧＥ进行临床诊断及预后效果的评价。
３、蛋白质芯片技术与激光解析离子化飞行时间质谱(Surface Enhanced Laser Desorption/ionization Time-of-Flight Mass spectometry，SELDI-TOF)
采用传统的蛋白质分离和检测技术来分离检测微量的样品（血清、尿样、精液或唾液）中与肿瘤密切相关，而表达很低的蛋白质，其灵敏度和特异性均很低。如能建立肿瘤的相关蛋白表达的指纹图谱，并将此图谱作为肿瘤的诊断和判断预后的依据，蛋白质芯片与激光解析离子化飞行时间质谱共同组成SELDI Protein Chip TM （tumor marker）系统[13]将蛋白的捕获、分离、检测等一系列的过程都集中在一张生物芯片上，采用SELDI-TOF 直接对芯片进行图象分析，而这一系列工作可连续在一个平台上完成，既减少了微量蛋白在操作过程中的丢失，同时得到的蛋白表达谱还可进一步的分析。现在SELDI proteinChipTM系统已用于前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、直肠癌、膀胱癌等新型潜在肿瘤标志物的筛选和检测。
Li JN[14]等用采用Ciphergen公司的ProteinChip（R）Arrays筛查169例血清样品中肿瘤标志物，包括103位前列腺癌患者（0期4；1期38，2期37，3期24），41位正常妇女，25位具有良性乳腺疾病患者，所得数据经ProPeak软件包分析，从0-1期病人的样品中筛选出三种表达变化明显的标志物，经检验阳性率可达到93%。
Rosty C[15]等用蛋白质芯片技术和SELDI-MS对来自胰腺癌患者和非胰腺癌患者的胰液进行分析，发现15例胰腺癌患者中10例胰液样品中有分子量为16.570 D的蛋白表达，而 7例非胰腺癌患者中只有1例出现此种蛋
白的表达，阳性率仅为17 %。经ProteiChip免疫测定，这种蛋白HIP/PAP-I （hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancreatitis-associated--protein I）是有胰葡萄状腺分泌的，ELISA量化表明HIP/PAP-I在胰腺癌病人胰液和血清种的表达量远远高于对照组，胰液中的HIP/PAP-I可作为胰腺癌的标志物。Vlahou A[16]及其同事从患有纯移形细胞癌（ TCC）、病变泌尿系统组织及正常组织种取样，经ProteinChip联合SELDI分析，发现TCC病人的体内有多种蛋白表达的变化，其中包括5种潜在的肿瘤标志物（其中一种蛋白经测定分子量为3.4kd的抗菌肽（defensin）和分子量在3.3到133kd的七个蛋白决定簇。将分析的蛋白用于临床检测，单个标志物的诊断阳性率从43%升高到70%，特异性从70%升高到86%。几种标志物的联合使用对低分化瘤的诊断敏感性也有大幅度提高。这表明ProteinChip联合SELDI可筛选到高敏感性和高特异性的标志物，提高临床诊断效率：尤其对处于肿瘤早期病人的发现阳性率。
前列腺癌是西方国家在男性中发病率较高的恶性肿瘤之一，其发病机理还不太清楚。为研究前列腺癌癌变过程种肿瘤相关标志物表达的变化，CloudＰ［９］等采用LCM将1500名前列腺癌病人的上皮、癌前病变、浸润组织以及正常的上皮细胞分离，经SELDI-TOF MS分析后，发现分子量在20KD到30KD的两种蛋白随前列腺癌病变的进展时表达量发生变化，并且从癌前病变的组织分析得到蛋白表达图谱，同时显示了正常蛋白和肿瘤相关蛋白的表达模式。
现有的蛋白质组学技术如：LCM、SELDI ProteinChip TM、surfacere sonance screening等联合使用，将会进一步促进肿瘤标志物筛选，为临床诊断提供多参数、高效的分析手段。SELDI、ProteinChip TM系统和激光捕获显微切割技术（LCM）联合使用，可提高识别正常细胞和肿瘤细胞的精确度，有利于筛选到在不同类型的细胞种表达的蛋白，和双向电泳相比，样品的需要量大大减少。Wellmann，Axel等采用激光微切割技术（LCM）将前列腺癌三类基质、上皮、癌细胞纯化后，分别取 500-1000个新鲜的纯化细胞，经ProteinChip（R）TM system 分析后，发现4.3KD的蛋白在肿瘤细胞种表达量明显增加，而且具有高的可重复性，实际上ProteinChip（R）TM system已经为我们提供了新的检测手段，既将多种未知标志物集中于一种芯片上，不用详细检测找芯片上的每一种结合蛋白，只要明确相关的特异蛋白表达谱，就能直接用于联合检测，可大幅度提高检测效果，减少测定时间，单一的标志物也不会影响检测的敏感度和特异性。临床研究表明采用传统的尿样检测阳性率为30%。而SELDI对早期膀胱癌的阳性率提高到75%。经LCM处理样品从检测到获得图谱结果只需10分钟[18] 。
三、 蛋白质组学在肿瘤标志筛选和测定应用
蛋白质组学分析技术可以从整体水平上探讨多基因、多蛋白参与的疾病，它具有时空动态性和可调节性的特点。肿瘤的发生和发展正是由多种因子调控的复杂过程，以往的研究多数集中于单个或少数几个基因和蛋白。应用蛋白质学研究技术能够动态、整体、定量地观察肿瘤发生过程各种蛋白质种类和数量的变化，通过比较肿瘤细胞和正常细胞的蛋白质表达情况，可以筛选出肿瘤特异性标记蛋白（marker）或特异性抗原，以及药物治疗靶点，为诊断和治疗提供线索。
1、腺癌
乳腺癌是女性发病率很高的种类，其生物学差别较大。临床常以腋窝淋巴结转移、雌/孕激素受体、核DNA 增生活性等指标判断病情。A-Alaiya等通过分析不同组织类型乳腺癌组织，发现24种蛋白在纤维肿瘤和浸润性肿瘤中表达不同，如浸润性肿瘤高表达增殖细胞核抗原（PCNA）和一些应激性蛋白，如热休克蛋白90（HSP90），低表达细胞角蛋白家族（CK7，8，15和18）19。同一肿瘤不同部位、原发和转移肿瘤的蛋白表达非常相似，但不同分化程度的肿瘤则差异很大，表明乳腺癌个体之间有显著异质性。
2、肝细胞癌
肝细胞癌（HCC）是非洲、中国及东南亚的高发肿瘤。Wirth等[20]对HEPG2等肝癌细胞株和人正常肝细胞作过比较。Seow等[21]通过电泳技术分析HCC-M细胞株和正常肝细胞株，筛选出约400个肝癌特异蛋白，如乙醇脱氢酶、a-烯醇化酶、天冬酰胺合成酶、异柠檬酸脱氢酶，此外，还有一些肿瘤相关蛋白，膜联蛋白、抗增殖蛋白还原酶。我国上海生物化学研究所对人REL-7404肝癌细胞系和L-02正常肝细胞系表达的蛋白质组双向凝胶电泳和图象分析，发现7个仅在肝癌细胞中表达的蛋白[22]。
3、结直肠癌和息肉
结直肠肿瘤发生复杂，从胃肠道肿瘤患者的粪便中发现异二聚体蛋白、肌钙网蛋白，包括钙粒蛋白A和钙粒蛋白B，认为它和肿瘤的发生有关[23]。Jungblut等报道[24]，钙粒蛋白B特异表达于结直肠肿瘤组织，早期局限性腺癌、非典型性增生结直肠息肉、结直肠肿瘤患者的低分化的息肉、长年溃疡性结肠炎病人息肉中表达增高，正常组织、非典型性增生的息肉则几乎不表达。这无疑是个有意义的标志。但钙粒蛋白B与细胞恶性转化的关系仍有待探讨。Melles[25]等用2-DE分析了正常结肠和多发性结肠息肉上皮细胞蛋白质丰度变化，在息肉细胞中，核仁间质素（B23）、HSP70表达强度增加；相反，脂肪酸结合蛋白（L-FABP）、CK20、细胞色素c氧化酶多肽、RhoGDP-解离抑制因子（RhoGDI）等降低。
4、肺癌
肺癌是容易于发生转移的肿瘤，鉴别肺部肿瘤性质（原发或继发）十分重要。有报道应用表面活性蛋白鉴别原发肺腺癌和转移腺癌，但临床意义不大。Okuzawa等[26]通过2-DE发现一对肺腺癌特异性的多肽标志物TA01/TA02，原发性肺腺癌中其表达率可达90%。质谱分析表明，TA01/TA02来源于napsin A，napsin A 是天冬氨酸蛋白酶家族成员，存在于正常人的肺和肾脏。原位杂交证实，TA01/TA02特异表达于正常肺组织的2型肺泡细胞、高中分化的原发性肺腺癌，对鉴别肺部原发性肿瘤和转移肿瘤非常有意义。
5、卵巢癌
卵巢癌生物学行为差异很大。通过蛋白质组学分析，恶性卵巢肿瘤中癌蛋白18（Op18）、PCNA、钙网硬蛋白、HSP90等表达增高，而原肌球蛋白-1和原肌球蛋白-2表达量下降[27]。在卵巢癌，我们可以发现不同部分肿瘤组织有相似的基因表达情况，可能由于占优势克隆的大量生长而使不同部位的肿瘤表达相似。
6、前列腺癌
Alaiye等分析了人类前列腺癌组织。PCNA、钙硬网蛋白、HSP90、和Op18、谷胱甘肽-S转移酶、超氧物歧化酶（SOD）和磷酸丙糖异构酶在恶性肿瘤中有明显累积；此外，恶性肿瘤中的原肌球蛋白-1和原肌球蛋白-2及细胞角蛋白18则比良性前列腺增生表达明显减少。这与乳腺癌和卵巢癌表达情况相似，认为不同组织类型的上皮肿瘤之间蛋白表达有很大的相似性。
7、儿童急性白血病
Op18磷酸化程度明显的和细胞周期中S期细胞比例相关，同样发现该组病人的淋巴细胞中nm23-H1蛋白表达增高。与Op18相似，nm23-H1蛋白在正常细胞中可以由于有丝分裂而增加，这表明nm23-H1蛋白和细胞增殖状况相关。其它研究也表明，与良性病变相比，肿瘤组织中的 nm23-H1蛋白水平增高[28、29]。
8、肾癌
Sarto报道[30]，四种蛋白只表达于正常肾脏组织，而在肾细胞癌（RCC）不表达，其中包括辅酶Q细胞色素还原酶（UQCR）和线粒体泛醌氧化复合体I.这表明,在RCC的形成和发展过程线粒体调节通路也许其着重要作用,而RCC中UQCR和线粒体泛醌氧化还原酶复合体的缺失也可能和某些未知基因的缺失、肿瘤抑制基因表达或翻译后修饰有关[30、31].
9、神经母细胞癌
有人分析53例神经母细胞瘤，结果发现，局限性、分化好的肿瘤高Hsp27。与原发性肿瘤相比，转移期肿瘤高表达而nm23-HI蛋白，nm23-HI蛋白表达水平和癌抗原N-myc表达、肿瘤团块大小、转移成正相关[32]。 10、膀胱癌
丹麦的一个研究组利用蛋白质组研究技术结合组织冰冻切片技术分析了150例膀胱癌病人组织，发现银屑素（psoriasin）仅表达于膀胱鳞状细胞癌（SCC）病人的组织及尿液中，而移行细胞癌（TCC）中难以检测到，因此认为银屑素可以作为SCC病人的随访标志[33]。Morten等的实验表明，角蛋白、半乳凝素、层蛋白等的表达水平与膀胱肿瘤分化程度关系密切[24]。
此外，国内外很多研究室试图从肿瘤组织正常组织，或肿瘤患者血清及正常人血清比较中发现肿瘤患者所具有的特异性蛋白，然后，运用单克隆抗体技术建立免疫学检测方法。但是，至今未获得理想结果展蛋白质组研究的应用前景及存在的问题：
近年来，蛋白质组学发展迅速。在1995年已经测定10种蛋白质组双向电泳图的基础上[34]，又经过5年多努力，现已发展建立了正常组织与病理组织数据库并进入互联网[35]。以毛细管电泳一质谱连用（CE-MS/MS）和 高
效液相色谱-质谱连用（HPLC-MS/MS）技术取代传统2DE，可以实现上样、分离、分析的完全自动化。蛋白芯片技术使简单、经济及规模化检测成为可能。尽管蛋白质组研究具有广阔的应用前景，但是，作为新方法还有局限性，以及存在一些急待解决的问题，首先，现有仪器、设备、试剂和消耗品昂贵。其次分析痕量蛋白的技术有待提高，比如，对于在凝胶内蛋白质进行酶解与抽提时，小肽片断易丢失，大肽片断或疏水性的肽段与胶结合紧密，不同蛋白质的酶解反应敏感性不同，所获得的肽段产率不同。酶解位点少的获得肽段片大，酶解位点多的获得肽段小。再有，处于动态之中的蛋白质分析，实验重复性差，此外，蛋白质理化性质和结构的异源性，难以建立可以完整反应蛋白质所有数据的精确数据库。多种蛋白质组学技术联合应用于肿瘤标志物筛选及研究，高通量、自动化筛查肿瘤相关蛋白的表达图谱，对探明肿瘤发生发展的分子机理，提高临床早期肿瘤的发现有重要意义。蛋白质组学技术的应用，不但是生物标志物研究技术的革新，也是生命科学研究方法的革命，这种系统、全面、综合的研究方法必将对肿瘤标志物研究产生深远的影响。
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紫癜性肾炎患儿血清的蛋白质组学研究
李凡 宋红梅 吴晓燕 许洋 魏珉
中国医学科学院北京协和医院
【摘要】 目的 应用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术分析紫癜性肾炎及无肾损害过敏性紫癜患儿血清蛋白表达谱的改变,对于建立紫癜性肾炎血清标志物诊断模型进行初步探讨。方法 收集例紫癜性肾炎及例无肾损害过敏性紫癜患儿血清，获得WCX2 蛋白芯片表达图谱。用Biomarker PatternsTM软件分析差异蛋白。结果 在分子量0～50 000范围内共检测到个蛋白峰，其中17个有显著差异（P＜0.05）。经过信号噪音比，强度，分辨率，一致性等因素的分析比较，认为其中5个蛋白或肽段具有明显的差异，对紫癜性
肾炎及无肾损害过敏性紫癜患儿的鉴别诊断具有一定的参考价值。结论 利用SELDI-TOF-MS技术平台和生物信息学技术对紫癜性肾炎和过敏性紫癜患儿血清差异蛋白表达谱进行对比分析，并探讨其对于HSPN早期诊断的价值。
【关键词】表面增强激光解吸离子化-飞行时间质谱; 蛋白质组学; 紫癜性肾炎
【Key words】 SELDI-TOF-MS; Proteome; HSPN
过敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura，HSP）为儿童时期最常见的毛细血管变态反应性疾病，以广泛的小血管炎为病理基础，皮肤紫癜、消化道粘膜出血、关节肿胀和肾炎为主要临床表现，而紫癜性肾炎（Henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN）是其最严重并发症。为探讨HSPN的早期诊断方法，我们采用比较蛋白质组技术表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（surface-enhanced laser desorption and ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS），对例HSPN患儿与例HSP患儿血清差异蛋白表达谱进行了对比分析，并探讨其对于HSPN早期诊断的价值，现报告如下。
对象和方法
1．对象：来自北京协和医院儿科的15例患儿（HSP 8 例，HSPN 7 例），年龄3～17 岁,男性12例，女性3例。其中8例HSP患儿经长期监测未发现肾脏受累现象，而7例HSPN患儿经肾活检检查均有不同程度肾损害。
2．仪器和试剂：（1）美国赛弗吉公司（Ciphergen Biosystems，Inc）生产的蛋白质指纹图谱仪PBSⅡC及配套的蛋白质芯片WCX2（弱阳离子交换）芯片及SAX2（强阴离子交换）芯片。（2）主要试剂：乙腈，三氟乙酸，SPA，CHAPS，Tris-HCL，Urea，NaAC，Triton X-100，NaCl，PBS，DTT，HPLC H2O等购自Sigma公司。
3．样品收集与预处理：患儿外周血采集后立即放入4℃冰箱静置2h，3 000 rpm 室温离心5分钟。将血清分装后置－80℃保存。使用前取出，置冰上融解后，4℃ 20 000 rpm离心5分钟。 依次加入20 μl U9缓冲液 (9 mol/L Urea，2％CHAPS，50 mmol/L Tris-HCL，pH 9.0, 0.1％ DTT) 和10 μl血清样品, 混匀后冰浴振荡30分钟后，将30ul上述变性后样品加入360ul相应的结合缓冲液（不同芯片类型采用相应的结合缓冲液, WCX-2 buffer：50mM NaAC, pH4.0；SAX buffer：0.05%Triton X-100 in 50mM Tris-HCl, pH9.0），使得血清的总稀释倍数达到约39倍。混匀，避免气泡产生，将处理好的血清样品上样到芯片上。
4．芯片预处理、上样和洗脱：将蛋白质芯片（WCX2，SAX2）安装于Bioprocessor （Ciphergen Biosystems，Inc）内，每孔中加入200 μl相对应的缓冲液（不同芯片类型采用相应的缓冲液, WCX-2 buffer：50mM NaAC, pH4.0；SAX buffer：0.05%Triton X-100 in 50mM Tris-HCl, pH9.0），振荡5 min。弃去缓冲液，重复上述操作一次。然后加入100 μl处理好的样品， 4℃ 600 rpm 震荡1小时。弃去未结合样品，每孔加入200 μl相对应的缓冲液，振荡5 min。弃去缓冲液，重复上述操作一次。每孔加入200 μL HPLC水，立即弃去。拆开芯片处理器，待芯片表面自然凉干后，每个加样孔加SPA 0.5 μl（5 mg SPA加入100 μl乙腈，100 μl 1% TFA，充分振荡5 min 确保SPA充分溶解，再离心1 min）共2次。
5．芯片检测、数据采集和参数设置：表面加强激光解析电离飞行时间质谱仪（SELDI-TOF-MS PBS IIc S/N: 3D520TC）参数设置如下：检测器电压设定为2900V，激光强度设定为175，检测灵敏度8，最高分子量50 000,优化范围2 000～10 000,分子滤过范围为1 000Da, 芯片上每个点采集120次。用Ciphergen ProteinChip3.2软件收集分析数据。
6．质控措施：为保证实验的重复性与可靠性，采用了内参与外参联合质控的措施。内参法采用两种措施。其一，在实验中的每一条芯片随机取一点做同一个标准血清实验（此标准血清由10个20-30岁的O型血正常人组成；其中5个男性与5个女性），用以调整激光条件，保证实验图谱的一致性，标准血清图谱其CV为8%。其二，根据所有图谱都出现的较一致的蛋白峰5 633Da及6 632Da的峰高来控制激光打击强度与灵敏度。外参法即All-in-one分子量校正法，用加有All-in-one标准蛋白质芯片（Arg-vasopressin 1084.2,Somatostatin 1637.90,Dynorphin 2147.50,ACTH(1-24) 2933.50,Insulin beta-chain 3495.94 Insulin 5807.65,Hirtdin BHVK 7033.61）校正仪器以保证所有分子量误差<0.1%。
7. 数据处理和分析：用ProteinChip Software3.2提供的魔法工具Biomarker Wizard对蛋白质图谱进行分析，可以得到图谱中每一个相对应的蛋白质峰谱的质荷比，强度，面积，分辨率，信号噪音比等具体的信息，我们通过该软件对相同分子量的一簇蛋白质峰谱的强度和面积的平均值进行比对，得到样品间差异度的P值，通过对P值的分析找到我们所感兴趣的差异蛋白。
结 果
1. P值分析结果:8份HSP血清和7份HSPN血清的原始蛋白指纹图谱（弱阳离子交换芯片捕捉到的蛋白）标准化后，在分子量0～50 000范围内共检测到248个蛋白峰,其中3个在HSP与HSPN的差异有显著意义（P＜0.05）（表1），经过信号噪音比，强度，分辨率，一致性等因素的分析比较，认为其中2个蛋白或肽段具有明显的差异6338.2、7727.8。
8份HSP血清和7份HSPN血清的原始蛋白指纹图谱（强阴离子交换芯片捕捉到的蛋白）标准化后，在分子量0～50 000范围内共检测到466个蛋白峰,其中14个在HSP与HSPN的差异有显著意义（P＜0.05）（表1）。经过信号噪音比，强度，分辨率，一致性等因素的分析比较，认为其中3个蛋白或肽段具有明显的差异3693.8、5068.1、3290.2。
2. 差异蛋白的甲基化修饰现象: 我们发现，在369
3.8、5068.1两个蛋白存在甲基化修饰现象。
讨 论
过敏性紫癜是一种全身性小血管炎性疾病，好发于2～10岁儿童。组织学上表现为白细胞破碎性血管炎。临床表现包括：紫癜性的皮肤病变、胃肠道症状和关节症状，以及肾脏病变。紫癜性肾炎为过敏性紫癜最严重并发症，其发生率在20%～80%不等。最常见的肾脏受损的临床表现包括无症状血尿(肉眼或镜下)，蛋白尿，甚至发生肾病综合征。可出现一过性的肾功能不全，轻者可逐渐恢复，重者则在较短时间内进展到终末期肾衰。因此对临床而言，早期诊断过敏性紫癜肾损害，对早期干预性治疗、改善预后有重要意义。
目前的研究认为紫癜性肾炎系一免疫复合物性疾病，在患者血清中可测得以IgA为主的循环免疫复合物，免疫球蛋白IgA、IgA-FN[1]、IgG、IgM及补体成分可在肾小球内沉积。另外还可观察到IL-2、IL-8下降，IL-6升高[2]，这导致Ｂ细胞分化和增殖增强，并促进中性粒细胞的趋化和激活，最终导致毛细血管破坏。Kawana[3]发现73.3%的紫癜性肾炎患者肾组织毛细血管壁Ｃ5、Ｃ6、Ｃ7、Ｃ8、Ｃ9及Ｃ5ｂ-9为阳性，认为补体活性增高，使得Ｃ5ｂ-9膜攻击复合物对毛细血管壁造成直接损伤。Darin[4]则对免疫球蛋白IgE在紫癜性肾炎发病中所起的作用作了初步探讨，77%紫癜性肾炎血清IgE水平升高，较IgAN44%有统计学差别。同时在4/6皮肤郎罕氏细胞及乳细胞中发现了IgE沉积物，故而推测，在CIC存在情况下，由特异抗原调节IgE敏感乳细胞，释放活性物质，增强毛细血管通透性，造成肾脏、皮肤、胃肠、肺部出现症状。但其确切机理尚待进一步研究。
目前临床上主要是利用ELISA法测定过敏性紫癜及临床诊断紫癜性肾炎患儿尿视黄醇结合蛋白(RBP)、尿-Ｎ-乙型-β-Ｄ-氨基-葡萄糖苷酶(NAG) 及尿微量清蛋白等方法。但在疾病早期这些方法大多不够灵敏或特异，过敏性紫癜患儿尽管尿常规正常，其近端肾小管已有不同程度损害，而临床确诊的紫癜性肾炎患者其肾小管损害程度更明显，因此对早期正确诊断紫癜性肾炎提出了更高要求。
而蛋白质谱技术在对临床疾病进行检测时，可以抓住绝大多数疾病的特异的生物标志物的本质，进行疾病监测和识别。即可对生物标志物做直接鉴定，故优于酶联免疫吸附实验、免疫荧光实验等间接测定生物标志物的方法。同时，还有一套灵敏的监测系统来检测和识别这些微量生物标志物；因而决定了它在检测诊断中的敏感性和准确性。从理论上推论，任何有生物标志物表达的疾病都应能被检出，并作出及时诊断。相对于其它蛋白质组学技术，如二维凝胶电泳，蛋白质谱技术具有快速、简便、用量少、可重复性好、高通量数据分析等优势。
本研究主要是利用蛋白质谱技术中的表面增强激光解析离子化技术，即CIPHERGEN公司的蛋白质芯片-飞行质谱技术，对过敏性紫癜及紫癜性肾炎患儿的血清进行分析，并从中发现具有诊断意义的肾损害相关蛋白，达到早期诊断、早期治疗、改善预后的目的。另外还可以使患者免于肾活检检查，减少了发生各种严重并发症的机会，具有较大的临床意义。
此次实验只利用了血清中蛋白的等电点进行了离子交换吸附后进行飞行质谱检测分析，不排除有血清中其它蛋白未被这种方法检测到，我们将继续利用CIPHERGEN公司的其它蛋白质芯片，例如疏水芯片，亲水芯片，
金属鳌和不同金属的芯片来对血清标本做进一步更全面的检测分析。这次通过对15例患儿血清的研究，所发现的5个有显著差异性的蛋白在检测分析中其一致性、相对含量、分辨率及信号噪声比等因素一直保持稳定，因此有可能对临床辅助诊断具有较大意义。所以我们将对以下两方面做进一步的工作：（1）继续收集患儿血清标本，扩大样品量，观察这5个差异蛋白在标本中的稳定性，建立诊断模型并验证；（2）从血清中纯化这5个差异蛋白，并做出序列鉴定，希望能从这些蛋白的鉴定结果中找到更准确的的蛋白质组学依据。另外由于在3693.8、5068.1两个差异蛋白上存在甲基化修饰现象，对此我们也会进行进一步的研究。
芯片类型 差异蛋白M/Z P 值 HSP 平均相对含量
6338.193 0.0092367 8.314660622 3.162217311
7727.7766 0.0126064 10.80759196 4.408438974
2858.1346 0.0170219 8.135014433 2.993267632
2943.2349 0.0023892 9.018844482 3.328184467
5766.1815 0.0066953 6.065567133 1.979021632
3693.8196 0.0092367 35.16035373 15.12528276
6632.0898 0.0092367 67.86132013 53.28941906
5068.0874 0.0126064 27.43234601 12.00524428
5195.0986 0.0126064 8.525673172 3.207143869
3960.0895 0.0170219 22.72682598 12.01683362
6433.9497 0.0170219 45.84121488 35.50713779
1241.2568 0.0227403 29.18387897 14.31277081
3290.2049 0.0300596 11.00627921 4.490001079
3679.3371 0.0300596 11.23873555 5.091517267
4856.9913 0.0300596 13.05824079 8.077007526
2019.2273 0.0393184 29.32650696 19.52626868
4260.2481 0.0393184 18.40093607 8.985999002
WCX2 WCX2 WCX2 SAX2 SAX2 SAX2 SAX2 SAX2 SAX2 SAX2 SAX2 SAX2 SAX2 SAX2 SAX2 SAX2 SAX2
蛋白质组学生物信息学分析介绍
生物信息学分析FAQ CHAPTER ONE ABOUT GENE ONTOLOGY ANNOTATION (3) 什么是GO？ (3) GO和KEGG注释之前，为什么要先进行序列比对（BLAST）？ (3) GO注释的意义？ (3) GO和GOslim的区别 (4) 为什么有些蛋白没有GO注释信息？ (4) 为什么GO Level 2的统计饼图里蛋白数目和差异蛋白总数不一致？ (4) 什么是差异蛋白的功能富集分析&WHY？ (4) GO注释结果文件解析 (5) Sheet TopBlastHits (5) Sheet protein2GO/protein2GOslim (5) Sheet BP/MF/CC (6) Sheet Level2_BP/Level2_MF/Level2_CC (6) CHAPTER TWO ABOUT KEGG PATHWAY ANNOTATION (7) WHY KEGG pathway annotation? (7) KEGG通路注释的方法&流程？ (7) KEGG通路注释的意义？ (7) 为什么有些蛋白没有KEGG通路注释信息？ (8) 什么是差异蛋白的通路富集分析&WHY？ (8) KEGG注释结果文件解析 (8) Sheet query2map (8) Sheet map2query (9) Sheet TopMapStat (9) CHAPTER THREE ABOUT FEATURE SELECTION & CLUSTERING (10) WHY Feature Selection? (10)
聚类分析（Clustering） (10) 聚类结果文件解析 (10) CHAPTER FOUR ABOUT PROTEIN-PROTEIN INTERACTION NETWORK (12) 蛋白质相互作用网络分析的意义 (12) 蛋白质相互作用 VS生物学通路？ (12) 蛋白质相互作用网络分析结果文件解析 (12)
蛋白质组学研究方法选择及比较
蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。
蛋白质组学及其在疾病研究中的应用
综述摘要 创新中药及其在我国的发展 邓文龙(四川省中药研究所,成都610041)本文就创新中药的定义、标准及创新中药在我国的发展进行了讨论。作者认为一流的临床疗效或独特的作用机理是创新中药的首要条件,按药物有效成分的有效剂量进行质量控制是创新中药的基础。 蛋白质组学及其在疾病研究中的应用 段春燕综述,何涛审校 (泸州医学院生物化学教研室,四川泸州646000) 目前人类基因组计划已进入后基因组时代,1994年Mac Wilkins与Keith Williams首先提出了蛋白质组学(prot eomics)的概念。依赖于二向电泳、质谱技术及生物信息学等多种手段的蛋白质组学分析在肿瘤、心血管系统、内分泌系统、神经系统及感染性疾病等的研究中得到了充分的应用,从整体的蛋白质水平上,在一个更深入、更贴切生命本质的层次上来探讨和发现生命活动的规律和重要生理、病理现象的本质。 蜂毒的现代药理研究及临床应用概况 夏隆江 (成都中医药大学药理教研室2004级博士生,成都610075)蜂毒是蜜蜂科昆虫中华蜜蜂Apis cerana F abricus等之工蜂尾部蛰刺毒腺和副腺分泌出的具有芳香气味的淡黄色透明毒液,是具有多种药理学和生物学活性的复杂混合物,主要由多种肽和酶类活性物质组成。它具有较广泛的药理作用:1、对心血管的作用:蜂毒有明显的降血压作用,其作用类似于组胺,是通过扩血管实现的;同时,蜂毒对心肌具有正性频率和负性肌力作用。2、对神经系统的作用:蜂毒有明显的镇痛作用和调节神经系统紧张度的作用。3、对血液的作用:蜂毒具有溶血、抗凝血和降低血栓素的作用。4、对呼吸系统的作用:蜂毒可使呼吸加快,大量的蜂毒可导致呼吸肌麻痹。5、对消化系统的作用:蜂毒有抗肝纤维化和吸收肝纤维化作用。6、对内分泌系统的作用:蜂毒对垂体、肾上腺皮质系统有明显的兴奋作用。7、对免疫系统的作用:蜂毒具有免疫抑制作用。8、抗炎镇痛作用:蜂毒肽对前列腺素合成酶的抑制作用是吲哚美辛的70倍,具有极强的抗炎镇痛效果。另外,蜂毒还具有抗肿瘤、抗辐射、抗菌等作用。在临床运用方面,临床上蜂毒被广泛地用于治疗风湿性、类风湿性疾病、多发性硬化病、艾滋病、高血压、哮喘、白塞病、寻常型银屑病等,具有较大的研究前景和临床运用价值。 瘦素的研究现状 龙中奇(四川省达州中医学校,达州635000)本文对瘦素的生物学性质及生理生化功能作一综述。 帕金森病的研究进展 唐宗琼(四川省达州中医学校,达州635000)多种因素导致帕金森病(PD)发病,归纳起来有以下几种学说:1遗传因素学说;环境因素学说;氧化应激学说;免疫学说;细胞凋亡学说;o对PD治疗的探索:细胞替代疗法(CRT)治疗PD是目前研究PD的热点,CRT治疗PD的目的是重建纹状体受损的多巴胺(D A)能神经支配,重建脑功能。根据供体的不同,PD的CRT治疗可分为:自体肾上腺髓质移植、同种异体胎脑移植、异种胎脑移植和干细胞移植。其中,自体肾上腺髓质移植经临床研究证实嗜铬细胞植入脑内后存活率极低,无肯定的治疗作用而已被淘汰。 胃肠肽类激素对摄食活动的调节 孙玉锦(雅安职业技术学院,雅安625000)摄食是复杂的行为,是一种精神活动,它包括觅食、食物的摄取、消化、吸收和利用,摄食是人类以及所有动物维持生命活动的最基本最重要的功能之一,摄入的食物经过消化和吸收过程为机体提供必须的能量和营养物质。虽然摄食作用作为一种本能生来即有,但实际上摄食活动是受体内复杂的神经和体液因素调节的,涉及到神经中枢、传入传出神经以及许多神经递质和激素。本文仅讨论胃肠肽类激素对摄食活动的调节。 将饱食大鼠的血液注入饿鼠血管内,可抑制饿鼠的摄食活动,这个事实提示血液中含有控制摄食的信息。这种信息是什么?推想饥饿使人或动物在短时间内大量进食,在食物未完全消化吸收之前,就因产生饱感而停止继续进食,究其原因很可能是食物与胃肠粘膜接触后,引起胃肠肽类激素释放,胃肠肽类激素通过血液循环,作用于下丘脑,兴奋饱中枢)下丘脑腹内侧核(VMH),抑制摄食中枢)下丘脑的外侧区(LHA),从而停止摄食。影响摄食活动的胃肠肽类激素较多,但其中只有少数胃肠肽类激素对摄食调节有生理意义,大多数胃肠肽类激素需要给予药理剂量才对摄食活动发生影响。本文介绍了体内多种胃肠肽类激素:胆囊收缩素、阿片肽、铃蟾肽、胰高糖素、胰岛素、酪神经肽、胃动素、甘丙素、生长抑素、雨蛙肽等对摄食有促进或抑制作用,目前对它们作用的许多环节还不完全清楚,但随着研究的不断深入,其与摄食有关的许多问题将会逐渐得到阐明。 实验研究摘要 松龄血脉康胶囊对自发性高血压 大鼠的降压作用及机制初探(摘要) 万莉红,熊文碧,朱玲,刘蓉,谢芬,刘嘉琴,周黎明*,李崇前1,张顺华1 (四川大学华西基础与法医学院药理教研室,四川成都610041;1成都康弘集团#博士后工作站,四川成都610036)目的:探讨中药松龄血脉康胶囊胶囊对自发性高血压大鼠是否具有降压作用,并初步探讨起作用的机制。方法:雄性自发性高血压大鼠(SHR)60只,随机分为高血压模型组、卡托普利组、Vc 组、松龄血脉康胶囊组四组,并设立正常血压大鼠(WKY)15只作为对照组,用BP26动物无创血压测试仪试验前测定各组动物的基础血压。(1)各组分别给予生理盐水、卡托普利12.5mg#kg-1、Vc50mg#kg-1、松龄血脉康胶囊胶囊750mg#kg-1灌胃,每日一 133 四川生理科学杂志2005;27(3)
蛋白质组学研究的完整解决方案
蛋白质组学研究的完整解决方案 人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，随着破译生命密码的人类基因组计划进入尾声，一个以蛋白质和药物基因学为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕，蛋白质将是今后的重点研究方向之一。然而，蛋白质的分离和鉴定非常费时，目前测定蛋白质的技术远远落后于破译基因组的工具，最好的实验室每天只能分离和识别出100种蛋白质。据估计，人体内可能有几十万种蛋白质，这大概需要10年时间进行识别。 为了加快蛋白质组学研究进程，以专业生产蛋白质组学研究设备而著称的美国Genomic Solution Inc.公司开发了完整的蛋白质组学解决方案，由一系列机械手臂与软件，并结合了二维电泳实验设备与质谱仪，可以进行高效、自动化且具重复性的试验分析。在Genomic solution值得信赖的技术平台上，你的研究工作将更富成效，重复性更好。在这一整套Investigator平台上，各仪器之间配合无隙，由于它的整合性及标准性，使得研究进程大大加快，原来需要9—12个月才能获得数据结果发表的时间减少到9—12周。这套完整的系统具备蛋白质组研究所需的众多功能：2-D电泳、图像获取、2-D胶分析、蛋白样品切割、蛋白消化、MALDI样品准备、消化及点样、数据分析整合，再加上制备好的胶、试剂及附件，使研究工作可以立即展开。此套设备为进行蛋白质组学研究的利器,大大加速了蛋白质分离和鉴定的速度。该系统主要由以下几部分组成： 一、2-D电泳系统（Investigator? 2-D Electophoresis System） 该系统主要进行2D PAGE第一向等电聚焦凝胶电泳和第二向SDS-PAGE电泳，设备包括2-D电泳系统所需的各种设备，如pHaser?（IPG胶条电泳）、管状制胶设备、二维电泳装置、电源设备、半导体冷却器及各种相关的蛋白纯化试剂盒。 产品特征： * 提供2D PAGE电泳所需的各种设备，使电泳更加简便，大大节约研究时间 * 高分辨率：有效的第一向等电聚焦凝胶电泳和23cm X 23cm第二向SDS-PAGE大面积板胶提供清晰的电泳图像，有效提高单体、磷酸化和糖基化蛋白的分离 * 大容量：可同时容纳15块1mm一维管状胶，或8块2-3mm管状胶；10块IPG胶条和10块二维电泳板胶 * 灵活性：该系统用于管状胶、IPG 胶条、预制胶、自制胶和SDS PAGE胶使用 * 恒温：高效的半导体制冷装置保证电泳体系温度恒定，温度变化< 0.5℃ * 专门为高分辨率2D PAGE而设计的电源系统 * 提供超纯的相关化学试剂和药品
蛋白质组学及其应用研究
现代商贸工业 ２０１９年第１６期 ７９ 一间不了解,往往会错过报名时间而与心仪的证书擦肩 而过.２．４一学生缺乏清晰的职业规划 据调查,大多数的学生对自己的所学专业并不是很了解.并认为自己在大学期间对本专业的学习比较浅显,缺乏实践.对自身未来就业感到十分迷茫,对自己专业的就业前景知之甚少.这种没有结合自身实际的职业规划,就会对学生考取证书的选择有较大的影响.２．５一学生的考证成本较大 大学生目前的考证方式主要有两种:自学和报班.报班的话,费用和时间成本会较高.且社会上的考证机构参差不齐,学生较难判断.自学的话,难度较大.时间成本会更高.学生考取证书所付出的精力会更多.这可能会影响学校的正常学习.可能会出现本末倒置的情况.且社会上考取证书的参考资料品质不一.学生难以判断选择最适合的考证资料. ３一考证问题相应的对策 ３．１一学生角度对策 (１)理性考证,切忌盲目跟风,证书并不是越多越好,分析自己所在的专业,了解与自己专业相关的证书,合理的安排考证和学校课程的时间,千万不要忽略学校授予的专业知识.证书或许能为你找工作提供一定的帮助,但真正让你立足于社会的是自身的能力,保持理智,不可本末倒置. (２ )做好自己的职业生涯规划,让自己对未来有一个明确的目标,然后根据这个目标,去选择能帮助到自己的证书,同时观察市场行情和国家形势,选择恰当的目标和时机去考取证书. (３)在考取证书的时候,一定要去了解该证书的详细信息,如考证费用二难易程度等,考取好的二知名度高的证书往往代表着你要投入大量的时间二金钱和精力,结合自身的实际情况来选择证书,适合自己的才是最好的.在选择培训机构的适合,一定要选择权威的二正式的机构,切勿贪小便宜而因小失大.３．２一学校角度对策 (１ )应帮助同学们建立起正确的三观二就业观,如东南大学成贤学院就应设立相应的讲座和课堂,为同学们讲解关于以后踏入社会的相关知识,培养大家独立二理性解决问题的能力. (２ )在校内设立与考证相关的导师机构,为同学们考证排忧解难,给出建议,避免学生盲目跟风,为考证不顾学业.同时要适当的疏导同学,避免对学习和就业产生过多的压力. (３ )学校需要做好一个合理引导的角色,应当不断完善学生的就业指导与服务体系,帮助学生树立正确的就业观念与明确的职业规划,端正考证动机,摒弃不良的考证心态,妥善处理好在校学习与考证学习的关系,让学生明白只有扎实提高自身能力与素质才会使自己终生获益.３．３一社会角度对策 (１ )用人单位应该完善用人的标准和要求,不以证书的数量来衡量学生的能力,用人标准和要求应多注重大学生的综合素质和实践能力. (２ )国家对于各种证书的认证要严格,对于各种培训机构要进行认真清理,不合法的要坚决取缔,考证不能成为不良居心的人利用应试考试赚取钱财的手段.同时加强考场管理,坚决反对作弊等现象的发生,为考证提供一个可信的平台,树立证书的权威性. (３)政府要做好用人单位和学校之间的沟通与交流,建立合作平台,保证人尽其用.优秀的大学生是社会紧缺的人力资源,为了避免这一人力资源的浪费,搭建企业与学校直接对接的桥梁是必不可少的,可以在为企业寻找需求的人才的同时,给予大学生实践和学习的机会. 参考文献 [１ ]关化少．我国本科应用型创新人才培养之特点二价值与理论期待[J ]．北京教育,２０１５,(０５)．[２]舒程． 考证热 背景下大学生创业与就业能力培养分析[J ]． 赤峰学院学报,２０１７,(０２)． [３]费芳．大学生 考证热 亟需正确引导[J ]．湘声报,２０１５,(０１)． [４]李晓娜．大学生 考证热 现象的经济学分析[J ]． 经济研究导刊,２０１４,(２４)． 蛋白质组学及其应用研究 魏东阳 (宝鸡中学,陕西宝鸡７２１０００ )摘一要:蛋白质组学的概念最早是由澳大利亚学者W i l k i n s 和W i l l i a m s 于１９９４年提出, 细胞二组织或者机体的基因组所表达的全部蛋白就称为蛋白质组学.蛋白质组学是一个研究蛋白质组及大范围蛋白质的分离二分析二应用的学科.它不同于传统的利用生物化学的方法研究单个蛋白质或某一类蛋白,而是在大规模水平上研究体系内全部蛋白质及其动态变化规律.随着学科的发展,蛋白质组学的研究范围也在不断完善和补充,通过查阅大量文献,总结蛋白质组学技术,并研究蛋白组学在生物医学二转基因技术二生物制药技术等领域的. 关键词:蛋白质组;蛋白质组学;蛋白质组学应用 中图分类号:F ２４一一一一一文献标识码:A一一一一一一d o i :１０．１９３１１/j ．c n k i ．１６７２Ｇ３１９８．２０１９．１６．０３４一一蛋白质组(P r o t e o m e )是由蛋白质(P r o t e i n )和基因组(g e n o m i c )两个词的组合而来,是指生命体(包括细胞二组织等)的一个基因组所表达的所有蛋白质.其主 要研究内容就是能在大规模水平上研究蛋白质的表 达二翻译后的修饰以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用,从而来了解蛋白质参与细胞二人体代谢及其他生命
比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术
进展评述 比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术 刘新1,2 应万涛1,2 钱小红1,23 (1军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京 100850;2北京蛋白质组研究中心 北京 102206) 摘 要 比较蛋白质组学是指在蛋白质组学水平上研究正常和病理情况下细胞或组织中蛋白质表达变化,以期发现具有重要功能的生物标识物,为疾病的早期诊断提供依据。近年来它正成为蛋白质组学研究的热点和发展趋势。比较蛋白质组学的研究方法和策略有多种,本文就最近几年来稳定同位素标记技术(体内代谢标记技术和体外化学标记技术)在比较蛋白质组学研究中的进展进行综述。 关键词 比较蛋白质组学 稳定同位素标记 体内代谢标记 体外化学标记 Application of Stable Isotope Labeling in Comparative Proteomics Liu X in1,2,Y ing Wantao1,2,Qian X iaohong1,23 (1Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing100850; 2Beijing Proteome Research Center,Beijing102206) Abstract C omparative proteomics is the research of protein expression changing between normal and pathological cell or tissue on the proteome level.P otential biomarkers w ould be discovered from the research by comparative proteomics, which will be helpful to the diagnosis and therapy of diseases.In the recent years,it has been becoming the hot spot of the proteomics research and many strategies used in comparative proteomics have been developed.During those approaches,the strategies based on stable is otopic labeling coupled with mass spectrometry have been extensively used and lots of success ful applications have been reported.In contrast to the traditional radioactive is otope labeling method,stable is otope labeling technique was not radioactive and the operation is simple.Metabolic labeling in viv o and chemical labeling in vitro are tw o parts of stable is otope labeling technique,which both have various advantages and disadvantages.This paper reviewed the progress of stable is otope labeling technique in comparative proteomics. K ey w ords C omparative proteomics,S table is otope labeling,Metabolic labeling in viv o,Chemical labeling in vitro 随着人类基因组精确图谱的公布,基因组功能的阐明已经成为生命科学研究中一项极重要的任务[1]。蛋白质是基因的最终产物同时也是基因功能的最终执行体,因而人类基因的表达及其功能有待于在蛋白水平上揭示。蛋白质组学的研究目的是分离和鉴定组织或细胞中的所有蛋白质。生物体在生长发育过程中,基因组是相对稳定的,而蛋白表达是高度动态变化的,并且具有严格调控的时间和空间特异性[2]。为了研究生物体在不同状态下表达的所有蛋白质的动态变化,比较蛋白质组学应运而生,即在蛋白组学水平上,研究在正常生理和病理状态,或受到不同的外部环境刺激下,或在突变等因素影响下,蛋白质表达的变化情况,以期发现生物体内关键的调控分子及与疾病相关的蛋白质标志物,最终为疾病的防诊治、新型疫苗的研发等提供理论依据。 为了研究蛋白质表达的动态变化,基因表达检测技术,如微阵列法[3]、DNA(脱氧核糖核酸)芯片法[4]等曾被广泛使用。这些方法虽然能够实现对mRNA(信使核糖核酸)进行定性和定量分析,但 刘新 男,27岁,博士生,现从事比较蛋白质组学研究。 3联系人,E2mail:qianxh1@https://www.360docs.net/doc/eb12359744.html, 国家自然科学基金(20505019、20505018)、国家重点基础研究发展规划项目(2004C B518707)和北京市科技计划重大项目(H030230280190)资助项目 2006207220收稿,2006209221接受
蛋白质组学与分析技术课复习思1考
蛋白质组学与分析技术课复习思考 一、名词解释 1、蛋白质组学： 蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 2、二维（双向）电泳原理： 根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。 3、三步纯化策略： 第一步:粗提。纯化粗样快速浓缩(减少体积) 和稳定样品(去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第二步：中度纯化。去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第三步：精细纯化。达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析 4、高效纯化策略 在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。5、离子交换色谱： 离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 6、吸附色谱 吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。 7、PCR扩增 PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。PCR 的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA拆开；2）在较低的温度下使
蛋白质组学及其主要技术
蛋白质组学及其主要技术 朱红1 周海涛2 (综述) 何春涤1, (审校) (1.中国医科大学附属第一医院皮肤科,辽宁沈阳110001； 2.北京大学深圳医院核医学 科，广东深圳518036) 【摘要】蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新兴学科，近年来发展迅速，已成为后基因组时代的研究热点。目前，蛋白质组学研究技术主要包括：样品的制备和蛋白质的分离、蛋白质检测与图像分析、蛋白质鉴定及信息查询。本文就蛋白质组学概念及主要技术进行综述。 【关键词】蛋白质组，蛋白质组学 1蛋白质组学的概念 随着人类基因组测序计划的完成，人们对生命科学的研究重点由结构基因组转向功能基因组，1994年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组一词[1]，蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。从基因到蛋白质存在转录水平、翻译水平及翻译后水平的调控，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度不完全符合[2]。蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等也无法从DNA／mRNA水平来判断。因此，只有将功能基因组学与蛋白质组学相结合，才能精确阐明生命的生理及病理机制。 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，对组织、细胞的整体蛋白进行检测，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用,在蛋白质水平上了解细胞各项功能、各种生理、生化过程及疾病的病理过程等[3,4]。蛋白质组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，把生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，更符合蛋白质组学的本质。但是，由于剪切变异和翻译后修饰，蛋白质数量极其庞大，且表达随空间和时间不断变化，所以分析生物体内所有的蛋白质是一个耗时费力，难以实现的理想目标。另一种策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质组成的变化，主要目标是研究有差异蛋白质及其功能，如正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白质，寻找肿瘤等疾病标记物并为其诊断治疗提供依据。 2蛋白质组学的常用技术 2.1样品的制备和蛋白质的分离技术 2.1.1样品的制备样品制备包括细胞裂解与蛋白质溶解，以及去除核酸等非蛋白质成分。 激光捕获显微切割(Laser-captured microdissection, LCM)[5]技术可大量获得足够用于蛋白质组学研究的单一细胞成分，避免其他蛋白成分对电泳结果的干扰。尤其是肿瘤的蛋白质组学研究常用LCM技术来获取单一的肿瘤细胞。 2.1.2蛋白质的分离技术 ①双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)：双向电泳方法于 l975年由O'Farrell[6]首先提出，根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。 第一向为等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。较早出现的IEF是载体两性电解质pH梯度，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度；20世纪80年代初建立起来的固相pH梯度(Immobilized pH gradients，IPG)IEF，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度。IPG胶实验的重复
质谱技术在蛋白质组学研究中的应用
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) Journa l o fN anji n g Forestry Un i v ersity (Natural Sc ience Ed ition) V o.l 35,N o .1Jan .,2011 htt p ://www.n l dxb .com [do :i 10.3969/.j issn .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10KJ B220002) 作者简介:甄艳(1976)),副教授,博士。*施季森(通信作者),教授。E-m ai:l js h @i n jfu .edu .cn 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 * (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 Application of m ass spectro m etry i n proteo m ics studies Z HEN Yan ,SH I Jisen * (K ey Labo ra t o ry o f F orest G eneti cs and B i o techno l ogy M i n istry o f Educati on , N an ji ng Forestry U n i versity ,N an ji ng 210037,Chi na) Abstrac t :W ith the rap i d develop m ent o f pro teo m i cs ,m ass spec trom etry i s m aturi ng to be a po w erfu l too l and core tech -nology fo r proteo m ics st udies dur i ng the recen t years .The super i or ity o fm ass spectrom etry lies i n providi ng the through -pu t and the m olecu lar infor m ati on ,w hich no other techno logy can be m a tched i n proteom ics .In th i s rev ie w,w e m ade a g lance on the outli ne o fm ass spectrome try -based proteo m ics .A nd then w e addressed on t he advances o f data ana l y si s o f m ass spec trom etry -based proteom ics ,quantitati ve m ass spectro m etry -based pro teom i cs ,post -translati onal m odificati ons based m ass spectrom etry ,targeted proteo m ics and functiona l proteo m ics based -mass spectrome try .K ey word s :m ass spectrome try;proteo m ics ; quantitative pro teom i cs ; post -trans l ation m odifica ti on ; targ eted pro - teo m i cs ;f uncti ona l proteom ics 蛋白质组学(Pr o teo m ics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。 目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(electro spray ion izati o n,ESI )和基质辅助激光解析离子化(m a -tri x assisted laser desorpti o n i o nization ,MALD I)的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(ion trap ,I T),飞行时间(ti m e of fli g h,t TOF),串联飞行时间(TOF -TOF),四级杆/飞行时间(quadr upo le /TOF hybrids),离子阱/轨道阱(I T /orbitrap hybri d )和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /Four i e r transfor m ioncyclotron resonance m ass spectro m eters hybr i d s ,I T /FT M S),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
蛋白质组学的研究进展及应用
《蛋白质工程》 （课程论文）题目名称：蛋白质组学技术的研究进展及应用 所在学院：生命科学与技术学院 专业（班级）：生技131班 学生姓名：梁健 授课教师：韩晓菲
蛋白质组学技术的研究进展及应用 生技131班梁健13772025 摘要：随着人类基因组计划全部测序的初步完成，研究重点转到对基因功能的研究上。蛋白质作为基因功能的主要体现者，对其表达模式和功能的研究成为热点，出现了蛋白质组学。研究蛋白质组学有助于了解蛋白的结构、细胞的功能、生命的本质及活动规律，为疾病的诊断、治疗、疫苗及新药开发提供科学依据。关键词：蛋白质组学；进展；应用 蛋白质组学(proteomics)是产生于20世纪90年代中期的一门新兴学科，以 细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象，是后基因组时代生命科学研究的核心内容。蛋白质组学的产生与发展经历了一个漫长的过程，在这个过程中，研究者不断修正蛋白质组学的发展方向和推进蛋白质组学相关支撑技术的快速 发展，进而拓展蛋白质组学在整个生命科学和生物医学研究中的应用，成为后基因组时代重要的研究新领域，并成功地应用到基础研究及医学研究等各个领域，推进其迅速发展。 1 蛋白质组学的概念及研究内容 1.1蛋白质组学的概念 蛋白质组(proteome)源于protein和genome两词的杂合，最早是由澳大利亚 的WILKINS等于1995年提出，其定义为“一种基因组所表达的全部蛋白质”。早期相对狭义的蛋白质组的概念是指在某一特定的时间和空间条件下，1个细胞的基因组所表达的蛋白质数目的总和。随着研究的深入，人们提出了广义的蛋白质组的概念，用来描述1个细胞、组织、器官或1个物种的生命个体，在其不同的生存及发育条件下所表达的各种蛋白数目的总和。所以蛋白质组所含的蛋白数目及其表达量是随着时间和空间的不同而不断发生变化的。蛋白质组学最有价值的优势是它可以观察在特定的时间下一个完整的蛋白质组或蛋白亚型在某种生理 或病理状态中，发生的相应的变化。 1.2 研究内容 根据研究内容的不同，蛋白质组学可分为差异蛋白质组学(或称表达蛋白质 组学)、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学，其中差异蛋白质组学在蛋白质组学 研究中十分常用且应用广泛。差异蛋白质组学主要是研究比较在2种或多种不同条件下蛋白质组表达的差异变化。结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析。蛋白质表达模式的研究是蛋白质组学研究的基础内容，主要研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题。功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质的功能和蛋白
质谱技术在蛋白质组学研究中的应用_甄艳
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) J o u r n a l o f N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) V o l .35,N o .1 J a n .,2011 h t t p ://w w w .n l d x b .c o m [d o i :10.3969/j .i s s n .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10K J B 220002) 作者简介:甄艳(1976—),副教授,博士。＊施季森(通信作者),教授。E -m a i l :j s h i @n j f u .e d u .c n 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J ].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 ＊ (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q 81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 A p p l i c a t i o n o f m a s s s p e c t r o m e t r y i n p r o t e o m i c s s t u d i e s Z H E NY a n ,S H I J i s e n ＊ (K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B i o t e c h n o l o g y M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,C h i n a ) A b s t r a c t :W i t ht h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f p r o t e o m i c s ,m a s s s p e c t r o m e t r y i s m a t u r i n g t o b e a p o w e r f u l t o o l a n dc o r e t e c h -n o l o g y f o r p r o t e o m i c s s t u d i e s d u r i n g t h e r e c e n t y e a r s .T h e s u p e r i o r i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y l i e s i n p r o v i d i n g t h e t h r o u g h -p u t a n d t h e m o l e c u l a r i n f o r m a t i o n ,w h i c hn o o t h e r t e c h n o l o g y c a n b e m a t c h e di np r o t e o m i c s .I nt h i s r e v i e w ,w e m a d e a g l a n c e o n t h e o u t l i n e o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e d p r o t e o m i c s .A n dt h e nw e a d d r e s s e d o n t h e a d v a n c e s o f d a t a a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,q u a n t i t a t i v em a s ss p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,p o s t -t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s b a s e d m a s s s p e c t r o m e t r y ,t a r g e t e d p r o t e o m i c s a n df u n c t i o n a l p r o t e o m i c s b a s e d -m a s s s p e c t r o m e t r y . K e yw o r d s :m a s ss p e c t r o m e t r y ;p r o t e o m i c s ;q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s ;p o s t -t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o n ;t a r g e t e d p r o -t e o m i c s ;f u n c t i o n a l p r o t e o m i c s 蛋白质组学(P r o t e o m i c s )是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ,E S I )和基质辅助激光解析离子化(m a -t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ,M A L D I )的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(i o n t r a p ,I T ),飞行时间(t i m e o f f l i g h t ,T O F ),串联飞行时间(T O F -T O F ),四级杆/飞行时间(q u a d r u p o l e /T O F h y b r i d s ),离子阱/轨道阱(I T /o r b i t r a ph y b r i d ) 和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s s s p e c t r o m e t e r s h y b r i d s ,I T /F T M S ),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化