蛋白质组学及其主要研究方法

蛋白质组学及其主要研究方法

摘要:蛋白质组学是对机体、组织或细胞的全部蛋白质的表达和功能模式进行研究。蛋白质组是动态的，随内外界刺激而变化，对蛋白质组的研究可以使我们更容易接近对生命过程的认识。本文就蛋白质组学研究所使用的主要技术如二维凝胶电泳、质谱、酵母双杂交系统、生物信息学等进行了相关综述。

关键词：蛋白质组学；双向凝胶电泳；质谱；酵母双杂交；生物信息学

Proteomics and its main research techniques

Abstract:Proteomics aims at the analysis and identification of entire proteins present in the cell tissue or the organism, and of the functions and the linkage of these proteins.the proteome of an organism is dynamic.It changes with the intro and outer stimulus.The study on proteomics can make us easily know how the vital progress goes. The article will introduce these tech-niques of proteomics such as two-dimensional gel electrophoresis、mass spectrometry、two-hybrid system and bioinformatics etc.

Key words: Proteomics;Two-dimensional gel electrophoresis;Mass spectrometry;Two-hybrid system; Bioinformatics

众所周知,始于20世纪90年代初的庞大的人类基因组计划业已取得了巨大的成就，人类基因组序列草图已经绘制完成[1]。但是,由于基因的主要功能是通过其表达产物——蛋白质来实现的,因此要揭示整个生命活动的规律,就必须对蛋白质进行研究。蛋白质在合成之后具有相对独立的修饰、转运和相互间作用能力,同时还具有对外界因素发生反应的能力。因此,只有从蛋白质组学的角度对生物体整体水平上的蛋白质进行研究，才能更好地帮助人们了解生命的本质，各器官的分子结构、功能及其行使该功能的机制等。

蛋白质组学的发展是伴随着蛋白质研究技术,尤其是双向凝胶电泳和新型质谱技术以及生物信息学的发展而发展的，本文将对蛋白质组学的主要研究技术作一概述。

1.蛋白质组学产生背景、概念及内容

1.1蛋白质组学研究的兴起

在后基因组时代，研究的重点已从揭示遗传信息转移到功能基因组学上来。但是，由于生物功能主要体现者是蛋白质，而蛋白质有其自身特有的活动规律。如蛋白质修饰加工、转运定位、结构变化、蛋白质与蛋白质间、蛋白质与其他生物大分子的相互作用等，均无法在基因组水平上获得。因为基因组学有这样的局限性，促使人们从整体水平上探讨细胞蛋白质的组成及其活动规律[2]。

1.2蛋白质组学概念的提出

蛋白质组被定义为细胞,器官或组织型的蛋白质成分的总称[3]；而蛋白质组学是研究这些成分在指定的时间或特定的环境条件下的表达，具体说它是对不同时间和空间上发挥功能性特定蛋白质群组进行研究，即在蛋白质水平上探索其作用模式、功能机理、调节调控，以及蛋白质群组内相互作用。其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。因为蛋白质是生理功能的执行者,是生命现象的直接体现者,对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。

1.3蛋白质组学的研究内容

蛋白质组学从其研究内容方面可分为表达蛋白质组学，结构蛋白质组学和功能蛋白质组学[4]。表达蛋白质组学主要研究细胞或组织在不同条件如药物或疾病状态下蛋白质的表达和功能，这将有助于识别疾病特异蛋白、药物作用靶点、药物功效和毒性标记等；结构蛋白质

组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。蛋白质之间的相互作用与控制细胞生长、复制等的代谢和信号通路有关，蛋白质之间相互作用的改变可能引起人类疾病；功能蛋白质组学是位于对个别蛋白质的传统蛋白质研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组研究之间的层次。从理论的角度讲,因此,对“全部蛋白质”的研究是非常困难的,而功能蛋白质组学则注重于从局部入手,把目标定位在蛋白质群体上。这样的群体可大可小,取决于要研究的功能特点和所用的研究手段。功能蛋白质组学研究可只注重那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体。

2.蛋白质组学研究技术

典型的蛋白质组学分析是在蛋白提取后，先凝胶的或非凝胶的方法分离蛋白质,然后以不同的质谱分析方法进行蛋白分析、鉴定，接着以生物信息学辅助获取和深入分析全面的信息，并可以指导更深层的功能蛋白质学研究[5]。

2.1蛋白样品的制备

通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分分别进行蛋白质组研究。样品预分级的主要方法包括根据蛋白质溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、线粒体或高尔基体等细胞器的蛋白质成分。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测,还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。

2.2色谱技术

色谱技术的原理是溶于流动相中的各组分经过固定相时,与固定相发生相互作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等),由于作用的大小、强弱等不同,各组分在固定相中滞留的时间不同,由此从固定相中流出的先后也不同,最终使不同组成成分得到分离。色谱法根据分离原理分类,有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱、凝胶渗透色谱及亲和色谱等。按操作形式可分为纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法等[6]。根据流动相的物理状态不同可分为:气相色谱法和液相色谱法。

高效液相色谱法(HPLC)是以液体作为流动相,并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。它是在传统液相色谱的基础上,辅以高效固定相、高压泵和高灵敏度检测器及计算机技术的应用,从而实现了液相色谱分析的高效、高速、高灵敏和自动化操作,因此被称为HPLC。它对样品的适用性广,不受分析对象挥发性和热稳定性的限制,适于分离分析沸点高、热稳定性差、分子量大的许多有机物和一些无机物,但是HPLC的固定相的分离效率、检测器的检测范围以及灵敏度等。

2.3双向凝胶电泳

双向凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2DE)仍是蛋白质组学研究的核心技术。其基本原理:第一项基于蛋白质的等电点不同在pH梯度胶内等电聚焦;第二项则根据分子量的不同大小进行SDS-PAGE分离，把复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二维平面上分开。根据第一项等电聚焦条件和方式的不同,可将双相电泳分为三种系统[7]。第一种是在聚丙烯酰胺管中进行,载体两性电解质在外加电场作用下形成pH梯度，它的最大缺点是不稳定,易发生阴极漂移，重复性差。第二种系统主要是采用丙烯酰胺和不同的pH值的固定化电解质共聚所形成的具有pH梯度的胶，此种胶条的形成需要一些能与丙烯酰胺单体结合的分子，每个含有一种酸性或碱性缓冲基团。第三种系统是非平衡pH梯度电泳,常常被用来分离碱性蛋白质。由于双向电泳利用了蛋白质两个彼此不相关的重要性质分离,其分辨率非常高。

蛋白质被分离以后用考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色或放射性标记等方法显示。其中银染比考马斯亮蓝染色灵敏度高，蛋白质分辨率可以达ng级[8]。但是银染的线性效果并不是很好，并且对质谱分析干扰大；考马斯亮蓝染色线性、均一性较高，对质谱干扰较小，但

其敏感性较低；较理想的是荧光染色，但其成本较高。

2.4质谱技术

2.4.1质谱技术的原理

质谱(mass spectrometry)是带电原子、分子或分子碎片按质荷比(或质量)的大小顺序排列的图谱。现在多通过质谱仪对蛋白样品进行质谱分析。

质谱分析的基本原理是,用于分析的样品分子(或原子)在离子源中离子化成具有不同质量的单电荷分子离子和碎片离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能并形成一束离子,进入由电场和磁场组成的分析器,离子束中速度较慢的离子通过电场后编转大,速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转,即速度慢的离子依然偏转大,速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时,它们的轨道便相交于一点。与此同时,在磁场中还能发生质量的分离,这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上,不同质荷比的离子聚焦在不同的点上,其焦面接近于平面,在此处用检测系统进行检测即可得到不同质荷比的谱线,即质谱[9]。通过质谱分析,可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息。

2.4.2蛋白质组学研究中主要运用的质谱技术

蛋白质组学研究中应用的质谱技术有：①电喷雾质谱：是喷射过程中以连续离子化方式使多肽样品电离；②基质辅助激光解吸质谱：是利用基质吸收激光的能量使得固相的多肽样品离子化，它常与飞行时间质谱联用，称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。另外还有快原子轰击质谱和同位素质谱等。③表面加强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）：是一种新的蛋白质检测技术，操作简单、灵敏度高，检测所需样品量少。④串联质谱（MS/MS）：在这种情况下，经质谱分析的肽段进一步断裂并再次进行质谱分析，这样可得到肽序列的部分信息[10]。

应用于较普遍的是蛋白质芯片飞行时间质谱仪。原理是利用经过特殊处理的固相支持物或芯片基质表面，制成蛋白质芯片，根据蛋白质生化特性不同，选择性地从待测生物样品中捕获配体，将其结合在芯片的固相基质表面上，用激光脉冲辐射使芯片表面的分析物解析成带电离子，质荷比不同离子在电场中飞行时间不同，据此绘制出质谱图。检测结果经过软件处理后可直接显示样品中各种蛋白质的分子量、含量等信息，可检测分子量在500kD以下的化合物。测定过程迅速、敏捷大大提高了蛋白质鉴定能力，可用于生物标志物发现、鉴定与蛋白质谱分析。

2.4.3质谱技术的评价

质谱技术能清楚地鉴定蛋白质并能准确地测量肽和蛋白质的相对分子质量、氨基酸序列及翻译后的修饰。目前MS/MS是唯一能够迅速测序N-端封闭或共价修饰肽段的方法。质谱技术很灵活，能与多种蛋白分离、捕获技术联用，对普通的缓冲液成分相对耐受，能快速鉴定大量蛋白质点，而且很灵敏，但它只能分离气体状态的带电分子，而且一次只能分析带正电或带负电的分析物。质谱分析很难区分两种同源性极高的蛋白。由于质谱分析只是描述蛋白的少量多肽，因此可能把删节的蛋白当成是原来的蛋白。通常只用于象酵母等基因组序列已知的个体。

2.5酵母双杂交系统

酵母双杂交系统的建立得益于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式,即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中DNA结合域（简称为DB)和转录激活结构域(简称为AD)是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合,但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。DB和AD分别能与多肽X和Y结合,由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱

饵”和“猎物”或“靶蛋白”[11]。如果在X和Y之间存在相互作用,那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能形成有活性的转录激活因子,从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间相互作用的基因称之为报道基因。通过对报道基因表达产物的检测,反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。

酵母双杂交系统不仅可用于验证两个已知蛋白间的相互作用或找寻它们相互作用的结构域,还可以用来从cDNA文库中筛选与已知蛋白作用的蛋白基因。由酵母双杂交系统衍生的酵母单杂交系统、酵母三杂交系统和反向双杂交系统等使这一技术得到了更广泛的应用。大规模酵母双杂交系统如酵母双杂交系统芯片的建立为蛋白质组学研究提供了支持[12]。

酵母双杂交系统已经成为分析蛋白质相互作用的强有力的方法，但是它只能反映蛋白质间可能发生作用,还必须结合其它试验才能确认,尤其是要与生理功能研究相结合。因此该方法仍在不断的完善中,如今它不但可用来在体内检验蛋白质间、蛋白质与小分子肽、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA间的相互作用,而且还能用来发现新的功能蛋白质和研究蛋白质的功能,而且在对蛋白质组中特定的代谢途径中的蛋白质相互作用关系网络的认识上发挥着重要的作用[13]。

2.6生物信息学

生物信息学是把核酸、蛋白质等生物大分子数据库作为主要研究对象,用数学、统计、计算机科学等为主要研究手段,对大量生物学原始试验数据进行存储、整理、管理、注释、加工,使之成为具有明确生物学意义的生物信息[14]。通过对生物信息的查询、搜索、比较、分析,从中获取基因编码、基因调控、核酸和蛋白质结构功能及其相互关系等知识,从而探索未知世界。

2.6.1生物信息学与蛋白质分析

在蛋白质组分析过程中,生物信息学的作用不仅仅体现在数据库的查阅和资料的整合中,生物信息学软件在蛋白质组研究领域的作用更是至关重要的。蛋白质分析软件应用主要集中在蛋白质组研究中的分离技术和鉴定技术，对有价值的未知蛋白进行分析和预测。应用生物信息学，可以对蛋白质进行以下4个方面的分析预测。

2.6.1.1蛋白质的物理性质预测

从蛋白质序列出发,预测蛋白质的许多物理性质,包括等电点、分子量、酶切特性、疏

水性、电荷分布等。相关工具有Compute pI/MW(等电点和分子量工具)；PeptideMass(酶切特性工具)；TGREASE(疏水性工具)；SAPS(电荷分布工具)等[15]。

2.6.1.2蛋白质一级结构分析

根据20种氨基酸的理化性质可以分析电泳等实验中的未知蛋白质,同样也可以分析已知蛋白质的物化性质。ExPASy是一个由Swiss-Prot;TrEMBL;EMBL等多个数据库的集合，主要专注的领域是蛋白质分子和蛋白质组学，可以利用数据库中提供的一系列相应程序对蛋白质进行分析。

2.6.1.3蛋白质二级结构预测

蛋白质二级结构预测的基本依据是每一段相邻的氨基酸残基具有形成一定二级结构的倾向。因此进行二级结构预测需要通过统计和分析发现这些倾向或者规律。蛋白质二级结构预测的方法有3种[16]。一是由已知结构统计各种氨基酸残基形成二级结构的构象趋势,其中最常用的是Chou和Fasman法;二是基于氨基酸的物理化学性质,包括堆积性、疏水性、电荷性、氢键形成能力等;三是通过序列比对,由已知三维结构的同源蛋白推断未知蛋白的二级结构。各种方法预测的准确率随蛋白质类型的不同而变化。一般对于α螺旋预测精度较好,对β折叠差些,而对除α螺旋和β折叠等之外的无规则二级结构则效果很差。

2.6.1.4蛋白质的三维结构

蛋白质三维结构是预测时最复杂和最困难的预测技术。序列差异较大的蛋白质序列也可能折叠成类似的三维构象。由于蛋白质的折叠过程并不十分清晰,从理论上解决蛋白质折叠的问题还有待进一步的科学发展,但也有了一些有一定作用的三维结构预测方法。即与已知结构的序列比较,同源模建,threading算法和折叠识别方法[17]。

2.6.2生物信息学与蛋白质功能

生物信息学发展到今天,不仅可以对蛋白质组数据进行分析和预测,而且可以对已知或者未知的基因产物进行功能上全面的分析和预测。生物信息学最常用的分析方法是模式识别。主要是利用存在于蛋白质序列结构中的某些特殊的特征模体来识别相关蛋白质性质。换而言之,就是从新的蛋白序列中发现标志性的序列或者结构,以此建立模式,然后在已经建立好的已知蛋白质数据库中,搜集与此相似的模式,来确定未知蛋白质的归属,从而预测它的功能[18]。

许多基因是在特定时期和条件下被激活,才能表达出来,在正常人工模拟的环境下根本无法表达。类似于这样的未知蛋白质也需要通过生物信息学的方法计算分析预测,以获得它的功能信息。

3.结束语

蛋白质组学为直接在蛋白质水平上大规模研究基因功能提供了有力工具。利用质谱技术研究凝胶分离的蛋白质对蛋白质功能研究具有重要作用。蛋白质鉴定将在高通量、高灵敏度、完整性等方面进一步完善[19]；分析手段将向自动化、微量化、平行化方向发展。21世纪将是一个整体细胞生物学的时代，DNA和RNA的信息加上相应的蛋白质信息的补充和提高，将构成完整的细胞分子生物学的研究[20]。

参考文献：

[1]Wilkina MR,Ppasquali C, Appel RS,et al.Fom proteins to proteomes:large-scale protein identification by two-dimensional electrophoresis and aminoaci danalysis[J].Biotechology,1996,14(1):61-65

[2]欧阳学剑.蛋白质组学技术的研究[J].中国中医药现代远程教育,2008,6(11）:1439-1440

[3]冯昌银,郑智勇,余英豪.蛋白组学技术及其在器官移植中的应用[J].医学综述,2008,14(8):1147-1150

[4]李煌,李松,徐芸,等.蛋白质组学技术在细胞信号传递机制研究中的应用[J].国外医学（口腔医学分册）,2005,32(5): 344-346

[5]邹清华,张建中.蛋白质组学的相关技术及应用[J].生物技术通讯,2003,14(3):210-213.

[6]张宏一.蛋白质组学研究技术及其进展[J]. 生物技术通报,2005,6(4):31-34.

[7]Cordwell SJ,Basseal DJ,Bjellqvist B,et al. Electrophoresis,1997,18(8):1393~1398.

[8]卫功宏,印莉萍.蛋白质组学相关概念与技术及其研究进展[J].生物学杂志,2002,19(4):20-22.

[9]李明,周宗灿.蛋白质芯片[J].生命的化学,2001,21(2):156-157·

[10]李佰良.功能蛋白质组学[J].生命的化学. 1998,18 (6) ;1-3.

[11]StephenK,Burley.An overview of structural genomics[J].Nature StructrueBiolNovember 2000,supplement, 7:932-934·

[12]Emmett MR, Caprioli RM. Micro-electrospray mass spectrometry: ultra-high-sensitivity analysis of peptides and proteins[J]. J. Am. Soc. Mass Spectrom, 1994, 5:605–613.

[13]赵宏伟,田秀珠,王波.差异蛋白质组学研究与应用进展[J].医学与哲学:临床决策论坛版,2006,27(4): 45-47.

[14]明亮,刘杰.蛋白质组学及其在医学研究中的应用[J].南通大学学报(医学版),2006,26(2): 151-153.

[15]成海平,钱小红.蛋白质组研究的技术体系及其进展[J].生物化学与生物物理进展,2000,27(6):584-588.

[16]McDonald WH, Yates JR 3rd. Shotgun proteomics: integrating technologies to answer biological questions[J]. Curr. Opin. Mol. Ther, 2003, 5:302–309.

[17]Tanaka K. The origin of macromolecule ionization by laser irradiation (Nobel lecture) [J]. Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 2003, 42:3860–3870.

[18]Diane G. Mass spectrometry: gainingmass appeal in proteomics[J]. Nature Methods, 2005, 2(6): 465-471

[19]马静,葛熙,昌增益.蛋白质功能研究:历史、现状和将来[J].生命科学,2007,19(3): 294-300.

[20]Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, et al. Initial sequencing and analysis of the human genome[J]. Nature, 2001,409:860–921.