病理学技术

一、病理标本的接收

病理标本的接收是在取材、固定组织前首先要做的第一步工作，它是临床与病理科交接的一个重要环节，它为开展病理学检查、病理档案的保存奠定了基础。标本接收程序如下。1．首先核对病理申请单与标本上的红色号码是否一致。

2．核查病理申请单上写明的送检标本及数目是否与实际送检标本一致。 3．观察送检标本的大小及固定液比例是否合适。

(1)穿刺活检及纤支镜所取的小标本，4％中性甲醛(10％中性福尔马林)固定组织的量应在6～10倍。

(2)对于较大的手术切除标本，应及时切开固定；核对后将病理申请单和标本编上病理标本号。

4．将病人姓名、性别、年龄、病历号、科别、临床诊断、部位、标本来源、标本例数等逐项录入电脑存储。

5．作为病理资料不仅要做好计算机录入工作，还须进行文字登记，以便病理档案长期保存。

二、组织固定

一、固定的目的和意义

固定的目的就是要通过使用化学和物理的方法，尽可能地保存组织细胞离体时具有的生理和病理形态结构及生物化学和免疫化学成分。

良好的固定是制作优秀病理切片的基础，也是特殊染色、组织化学、免疫组织化学和组织原位分子杂交等技术方法赖以成功的基础。

因此，在病理技术工作中必须高度重视固定的质量。

二、组织固定的注意事项

1．及时取材：由于甲醛对组织的平均穿透速度只有0.8 mm/h，因此手术切除的送检标本应及时切开进行取材，以便保证重要的镜检部位能及时地得到固定。

2．及时固定：完成取材的组织块应立即投入固定液以便尽可能地保存组织细胞的形态结构和抗原性。

3．液量充分：一般情况下要求固定液的量应为组织体积的6～10倍。

4、固定时间：。送检来的大器官应及时切开固定，大标本取材后（2cm厚）固定时间需要6～12个小时，小标本一般需要3～6个小时；当室温低18℃时，应在37℃以下的温箱内加温4～6个小时。

三、取材

取材的好坏，直接影响切片的质量。取材时，除了按取材规范以外，还应注意：

（1）要有一把锋利的取材刀，在切割组织时要避免取材刀来回拖拉，。

（2）切取的组织块厚薄要均匀，一般厚度以0.2 ～0.3cm，大小以1.5X2.0 cm为适。（3）较容易发脆的组织如甲状腺、肝脏、血块、淋巴结、大块癌组织等可适当厚一点，而脂肪组织、肺组织、纤维性肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应略取薄一些。（4）淋巴结应修掉两侧球冠，并尽量剔除周围脂肪组织。

（5）如组织内有缝线、钉书针或骨组织，必须除去或避开，如碰到不可避免的骨组织或钙

化组织，应与技术室讲明，进行脱钙处理。

（6）在切取纤维组织、肌肉组织时，应注意纤维或肌肉的走向，尽可能选择与纤维或肌肉的走向平行、并以此为长轴切取。

（7）取材时间：对于外科手术切除的较大表本如胃、肺、肠等最好先固定再取材。

四、组织脱水、透明

组织经固定后会有大量水分，组织脱水是用某些溶剂逐渐将组织内的水分置换出来，以利于透明剂和石蜡的渗入。标本经过固定和冲洗后，组织中含有较多的水分，必须将组织块内的水分置换出来，这一过程叫做脱水。无论是用石蜡切片，还是用火棉胶切片，都必须除去组织中所含水分，因含水组织与石蜡、火棉胶等包埋材料不相容，常用的脱水剂为一系列不同浓度的乙醇。

脱水的步骤是：80%、90%、95%、100%各种浓度乙醇2小时，此过程可用脱水机自控完成。

五、包埋

组织块经过固定、脱水、透明、浸蜡等处理后，用包埋剂(如石蜡、树脂、塑料等)将其包制成含组织块的蜡块或塑料块等的过程称为包埋。不同的包埋方法有不同的要求，经包埋后，组织可达到一定的硬度和韧度，有利于切成理想的薄片。

包埋步骤

先将熔化的石蜡注入包埋托内(模具)，而后用镊子将经过浸蜡的组织块从脱水盒中取出，放入包埋托中央，放在小冷台上，用镊子轻按组织块，以达到组织块平整，盖上脱水盒底，再加好石蜡，移至冷冻台上，待冷冻好后，卸下组织蜡块待切。包埋时应根据组织的不同，选择大小型号适合的包埋托；有要求直立包埋的组织要用镊子将组织固定在蜡块中央稍停片刻，以使组织在蜡凝时立住，达到立埋的要求。

注意事项：

1．每次夹取组织块时，镊子用乙醇灯加热至温度适中。2．包埋托内不要有水、碎蜡等异物，以免影响包埋质量。 3．包埋蜡的温度要控制好，包埋蜡的熔点应为58~60℃。 4．包埋蜡加入少量蜂蜡(蜜蜡)，可以增加韧度，利于切片。 5．夹取组织块放人包埋托内时，一定要注意包埋面。

6．包埋好的蜡块，用刀修整时，一定要适当保留蜡块中组织周边的白蜡边，以利于连续切片。

7．每包埋完一块组织，镊子必须擦干净或用乙醇灯烧。

六、组织石蜡切片

(1)修整蜡块：可视其组织的大小，在组织边缘约0.1～0.2cm处，切去余蜡部分，否则易造成组织皱缩不平。

(2)准备好切片用具：切片刀、毛笔、眼科镊子（弯）、漂烘温控仪

(3)安装蜡块：将修好的蜡块安装在金属或木制持蜡器上。

(4)安装切片刀：将切片刀安装在切片机的刀台上，把刀台上的紧固螺丝旋紧，使切片时不产生振动，能保持一定的切片厚度。

(5)切片的厚度：切片机的厚度调节器上刻有0～50μm或0～25μm，可任意选择其厚度，石蜡切片的厚度一般在3～5μm。

(6)切片

(7)铺片：用眼科镊子镊起蜡带轻轻平铺在40～45℃的水面上，借水的张力和水的温度，将略皱的蜡带自然展平。

注意事项：(1)无冷台的病理科可以将包埋好的组织蜡块放到冰箱内，但如放置时间久温度太低注意切片时蜡块会产生热涨，切片会厚，要多切几张，后面的片子就会薄一些。

(2)为了能够连片，蜡块两端要有空白蜡。多的一端放在上面。

(3)展片槽温度不要过高，有时会有小组织块散漂在水面上造成污染。可用手纸折成与水槽宽度相同水面行走，将组织屑捞走。

(8)贴片、烘片：待切片在恒温水面上充分展平后，将蜡片捞到载玻片的中段处倾去载玻片上的余水，置入60～65℃恒温箱内或切片漂烘温控仪的烘箱内烤片15～30分钟，脱去溶化组织间隙的石蜡。

七、常规染色

苏木精(hematoxylin)和伊(eosin)染色方法，简称HE染色方法，是生物学、细胞学与组织学最广泛应用的染色方法。在病理科称为常规染色方法。病理学的诊断都是以HE方法为基础的。染色的目的是把组织切片或细胞涂片等浸入染料及其他染色剂配成的染色液中，经过适当的时间和处理，使组织或细胞及其他成分染上不同深浅的颜色，产生不同的折射率，从而便于光学显微镜下进行观察和研究。

步骤：

1、切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。（各两次，然后把水吸干）

2、苏木素染色15min，自来水冲洗。（吸干水）

3、盐酸乙醇分化30s（提插数下）。

4、自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min。（吸干水）

5、置伊红液30s

6、 75％乙醇1min→80％乙醇1min→95％的乙醇1min→100％的乙醇1min

进行染色前进行染色液的配制，应根据工作量的多少配制相应量的染液，同时应注意溶液种类的选择、溶液浓度、pH值等，另外也应注意配方的合理选择。在实际工作中，应做到以下几点。 (1)保持染液的清洁，应经常过滤或更换。

(2)染色时间应根据组织的种类、染液的新旧及特殊要求而决定。

(3)染色环境温度对染色效果也有着密切的影响，故染色时间必须依据不同条件灵活掌握。 (4)脱蜡干净与否对染色效果有着重要影响，烤片温度、脱蜡二甲苯的温度、二甲苯的新旧和二甲苯脱蜡的时间长短都与染色有着密切关联。

(5)标本脱水的好坏及固定的充足与否对染色效果影响极大。

(6)切片染色后，经梯度乙醇脱水，若每步的时间不足易造成切片发雾、模糊不清，影响诊断。

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八、封片

封片是将组织切片封固保存于载玻片与盖玻片之间，使之不与空气发生接触，防止其氧化、褪色，利于镜检观察及保存。一、手工封片

手工封片应注意以下七点。

(1)所用树胶浓度要适中，以一般速度滴下并恰能成珠既可。太稀时易溢出玻片，当二甲苯挥发后，组织切片就会收缩产生胶不匀并出现大片气泡。太浓时，滴在玻片上树胶不易散开，易产生气泡，难以驱除，并影响折光率。 (2)树胶用量多少应根据组织大小、厚薄而定。 (3)应迅速敏捷滴胶。

(4)封片时，切片上应保留适当的二甲苯，以防干封，产生气泡。 (5)为防止气泡，封片时，树胶不宜搅动。

(6)如遇有小气泡时可用镊子轻压盖玻片，排除气泡。

(7)封片时，若离面部较近，鼻、口呼出的气体会有水分造成切片云雾状甚至模糊不清，需引起注意。二、机器胶带封片机

机器胶带封片机不用树胶，只用少量二甲苯即可封片。使用方便，切片诊断后即可归档，不会因树胶不干造成粘片等。使用封片机时，首先检查二甲苯瓶，并检查滴液分注量，检查胶带可用量、选择胶带长短规格，检查接片筐是否安装到位。工作时开通电源，并打开过滤网开关。工作完成后，关闭2个电源，擦拭机器。三、机器盖玻片封片机