色谱分析在多肽分离中的应用

色谱技术在多肽分离中的应用

1.多肽概况

肽是α－氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。

多肽也简称为肽，是20世纪被发现的。多肽有生物活性多肽和人工合成多肽两种。生物提取的多肽具有很强的活性，所以叫做活性肽！只有活性的肽才能对人体产生很好的效果!但是人工合成的多肽有很多是没有活性的，是需要筛选的，只有活性肽才能被人体安全使用。

多肽是α－氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由10-100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。它们的分子量低于10000Da（Dalton道尔顿），能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。也有文献把由2-10个氨基酸组成的肽称为寡肽（小分子肽）；10-50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质。

多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。多肽类药物是我国药物研究中的一个活跃的领域，多肽类物质广泛存在于自然界中的，如何从天然动物、植物、微生物中分离活性多肽物质，随着分子生物学的发展、基因工程技术、多肽合成技术的兴起,并出现一些新的方法[1]。

2. 多肽分离方法

多肽物质本质上属于低分子蛋白，它的分离方法与蛋白质的分离方法相似，常用的提取分离方法，包括化学萃取法(如醇提、丙酮法)、水泡法、冻融法、酶解法、沉淀法、超滤法、离心法、逆流分溶法、层析法、电泳法等。但根据不同的实验材料不同采用不同的方法，实际应用中常常是几种方法的组合使用。

2.1液相色谱分离法

2.1.1高效液相色谱分离多肽

高效液相色谱分离多肽是近年来常用的方法之一，其具有分离效果好，速度快，回收率高的特点。根据分离过程中的物理、化学原理不同分为反向高效液相色谱，离子交换色谱、凝胶过滤色谱等。

冀峰[2]等使用岛津氨基酸柱后衍生系统锂型分析柱建立了24种氨基酸的高效液相色谱柱后衍生分析方法，成功测定了某两种市售样品牛奶中的皮革水解蛋白含量。

2.1.2 反向高效液相色谱

反向高效液相色谱是根据溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水性差别进行分离的洗脱色谱法。主要用于分子量低于5000的小分子多肽。Wilce等人[3]对2106种肽保留性质与结构进行分析, 得出不同氨基酸组成与保留系数的影响关系。王欣[4]等人使用反响高效液相色谱对奥曲肽等三种小肽进行了分离纯化，结果经检测后奥曲肽的纯度为97.8%。

2.1.3 影响液相色谱分离的因素

2.1.

3.1液相色谱分离模式和固定相的研制

液相色谱分离模式的研究和新固相的研制一直都非常活跃,最近几年相继出现了膜分离色谱,分子烙印手性固定相,棒状液相色谱柱,不同功能团球型聚合物固定相,具有生物功能膜色谱,纤维素亲和膜色谱以及硅胶填料改性的各种液相色谱固定相,为进一步深层次开拓应用范围奠定了基础[5]。

2.1.

3.2样品预处理新技术

样品预处理是样品分析中至关重要的一环。减少杂质对待测物的干扰和样品

中预富集是液相色谱分析取得成功的关键。尤其是在生物化学,临床医学,生物医学和环境监测等分析领域更为重要。20世纪70年代大孔网状聚合物和硅胶键合相的研究,出现了固相萃取(SPE)。由于该技术减少了分析样的污染,节约了溶剂的消耗,缩短样品预处理时间,很快得到了具体的应用,取得了明显的效果。固相微萃取技术(SPME) ,众多分析工作者对其进行了研究,使该技术得到进一步发展和广泛的应用。它是一根纤细的熔融石英纤维表面涂布一层聚合物并将其作为萃取介质(称为萃取头) ,再将萃取头直接进入样品溶液(即直接浸没-固相微萃取方法) 或采用顶空-固相微萃取方法采样。由于聚合物涂层的种类很多,因而可对样品组分进行选择性的富集和采集。然后将吸附组分热脱附或淋洗脱附对样品进行气相色谱,液相色谱及毛细电泳等分离分析。固相微萃取技术与液相色谱分离分析方法连用则开辟了更加广阔的应用前景。尤其在生物化学分析,临床医学和生物医学方面呈出了它独特的优势,为许多常规的分析系统提供了选择和补充。

2.1.

3.3固相萃取柱的选择

为避免样品在上液相色谱、气相色谱、LC-MS-MS、GC-MS 时可能造成色谱柱或源的污染，固相萃取成为去除杂质的必要手段，但经常会遇到柱子的选择、溶剂的选择、操作上的问题[6]。

主要影响有

柱压力的选择：柱压力可分为: 减压、加压、常压。减压柱能够减少固定相硅胶的使用量，缺点有: 第一，大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发( 有时在固相萃取柱外面有水汽凝结) ; 第二，可能会造成易分解物质的损失; 第三，抽气泵的使用，会延长过柱萃取时间，增加噪音。固相萃取柱加压是一种较好的使用方式，特别适用于易分解样品的分离。加压可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集时间，缺点是:减低柱子的塔板数; 压力过大，溶剂流速过快减低分离效果，所以柱加压在普通的有机化合物的分离中较适用。其他条件相同时，常压柱效率最高，但耗时，比如天然化合物的分离。

固相萃取柱的尺寸选择：理想的固相萃取柱类型应该是内径和长度均较大。

柱长加大，相应的塔板数则高，柱内径较大，进样后样品的原点则小( 反映在柱子上就是样品层较薄) ，分离度变大。缺点是采用内径较大的萃取柱需

较多的硅胶和溶剂，增加实验成本。现在常用萃取柱直径与长度比一般在1∶5～1∶10，固定相硅胶量是样品量的30～40倍。

2.2凝胶过滤色谱

凝胶过滤色谱,根据物质尺寸大小的不同分离。如果分子的尺寸大于树脂的最大孔径，这种分子就不能进入树脂颗粒内部，它所经过的有效体积最小，最先从洗脱液中流出。而小分子能够进入树脂的孔道中，经过的有效体积比较大，从洗脱液中流出较晚，分子量越小，流出越晚。倪莉采用凝胶过滤色谱Sephadex G-15分离纯化出丝素肽。

凝胶过滤色谱因其操作方法简单、重复性强等特点在生物大分子的分离纯化中被广泛使用，特别在基因工程蛋白质类药物的精细纯化中起着难以替代的作用。但由于蛋白质凝胶过滤色谱要求样品上样体积较小及洗脱流速较小时才能获得理想的分辨率，这使得凝胶过滤色谱经常成为蛋白质大规模纯化工艺中的限速步骤。

在蛋白质的凝胶过滤色谱中，样品上样量和洗脱流速是影响分辨率的重要因素，一般而言，为了获得好的分辨率，必须减少样品上样量和使用慢的洗脱速度，故凝胶过滤成为蛋白质纯化中最为耗时的一个阶段。虽然采用大直径的色谱柱和耐受较高流速的凝胶填料可以初步解决上述问题，但是成本极高。因此，左等根据AKTAexplorer色谱系统管道自动切换功能进行了上样方法的改进。在常规分离中，记录下开始出峰的体积V1和全部色谱峰出完的体积V2，记V3=V2-V1，则在每次上样洗脱V3后再进行下一次上样。不会产生峰混杂[7]。

2.3 离子交换色谱

离子交换色谱是以离子交换树脂作固定相，在流动相带着试样通过离子交换树脂时，由于不同的离子与固定相具有不同的亲合力而获得分离的色谱法。细胞毒素———F(CTX-F)采用阳离子交换色谱法被许云禄等成功地分离纯化了。在离子交换色谱中, 除纯粹的离子交换过程外, 溶质和固定相之间还存在非离子交换范畴的相互作用,其中包括作为填料基质的有机聚合物中带有的芳香环骨架对

溶质的吸附作用、氢键作用和水合作用等, 最重要的非离子作用是吸附作用. 这种溶质和固定相之间的吸附作用不仅局限于具有芳香结构和烯键结构的有机离子, 几乎所有可极化的无机和有机离子都能观察得到。

离子交换色谱既可以用于质粒和杂质的定量, 也可用于质粒不同拓扑形态的分析, 在药用质粒分析中应用最为广泛。质粒制备过程流分析的离子交换色谱介质包括多孔、灌注、薄壳和非多孔等4种类型[8]。

徐其进[9]等使用的胰蛋白酶溶液在加温下处理TSKgel CM-5PW和TSKgel DEAE-5PW离子交换色谱柱后, 柱压显著降低, 柱效提高一倍,交换容量也得到恢复。以此说明离子交换色谱柱的恢复程度和交换容量与处理液的用量有关。金振涛等[10]以工业化生产的海洋鱼皮胶原肽为研究对象,研究了从中分离抗氧化活性肽的方法。分别探索了分子排阻色谱和离子交换色谱直接梯度洗脱以及先等度洗脱,再梯度洗脱 3 种洗脱方法的分离效果,发现离子交换色谱先等度洗脱,再梯度洗脱分离效果最好,共分成5个洗脱峰。优化出此方法下的最佳洗脱液pH为5.5 ,最佳上样量为50mg。在优化的分离条件下分离并富集样品,脱盐后测定分离前后抗氧化活性,与原胶原肽相比,3 # 、4 # 、5 # 峰均显示出较强的抗氧化活性,其中3 # 峰活性最强,提高了10.6 倍。

2.3.1离子交换色谱介质

离子交换剂是离子交换色谱的基础,常见的有树脂、纤维素、葡聚糖和琼脂糖等。离子交换剂的功能团能与带正电的离子基团发生交换作用的,称为阳离子交换剂, 常见的功能基团如磺丙基和羧甲基等;离子交换剂的功能基团能与带负电的离子基团发生交换作用的,称为阴离子交换剂,常见的功能基团如季铵基和二乙基氨乙基等。又根据功能基团的解离性质,离子交换剂还可分为强离子交换剂和弱离子交换剂;前者如磺丙基、季铵基,后者如羧甲基、二乙基氨乙基。离子交换剂的强弱并不是指蛋白质与交换剂结合的牢固程度,而是取决于带电功能基团的酸离解常数pKa的大小。

2.3.2离子交换色谱中的疏水作用和吸附作用

在离子交换色谱中,虽然蛋白质与离子交换剂的结合以相反电荷之间的离子键为主,但实际上还存在疏水作用和吸附作用,这些作用对于物质的保留有着一定的影响[11]。离子交换过程中如果使用带有非极性骨架的离子交换剂就会出现疏水作用，这类离子交换剂的非极性骨架带有较强的疏水性,能与蛋白质分子中的某些疏水性氨基酸残基结合。在离子交换色谱柱的长期使用过程中,部分功能基团可能会流失,暴露出固定相的基质,此时溶质离子易与固定相基质发生吸附作用;或者,被测样品中有的溶质离子未被彻底洗脱,附着在固定相表面,导致溶质离子有可能与色谱固定相上的污染物发生吸附作用。因此,离子交换色谱中的吸附作用与固定相的种类和结构密切相关。

2.3.3离子交换色谱的保留机制

离子交换色谱对生物大分子的色谱保留行为是一个十分复杂的过程,这主要是因为在细菌素和酶等蛋白类物质的分离过程中,除了静电作用以外,还存在被分离物质与离子交换剂表面的疏水作用和吸附作用等。对离子色谱保留机理的研究历经了很长一段时间,目前普遍认可的可用于表征生物大分子色谱保留行为的模型是计量置换模型。该模型从热力学平衡常数出发,描述体系中溶质、流动相和固定相分子间多种相互作用,进而计算出组分间相互作用的定量关系及其量度的大小。该模型为我们提供了一种可以利用离子交换色谱分离具有相似化学和生物学性质的蛋白质的方法[12]。

2.4 毛细管电色谱技术

毛细管电色谱（Capillary Electro chromatography，CEC）是近十几年来综合了现代最新分离技术中高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）的优势而发展起来的一种高效微分离技术。所谓毛细管电色谱是在毛细管中填充或在毛细管壁涂布、键合色谱固定相，用高压直流电源（或辅加一定的压力）代替高压泵，即依靠电渗流（EOF）来推动流动相，使中性和带电荷的样品分子根据它们

在色谱固定相和流动相间分配系数的不同和自身电泳淌度的差异而达到分离分析的一种电分离模式[13]。与高效液相色谱相比,CE 的制备总量低,只适用于微量制备;对扩散系数小的生物大分子而言,CE 比HPLC 的分辨率高得多,因此CE 被用来作为收集非常纯的单一馏分的微量制备手段[14]。

毛细管电色谱的发展可追溯到20世纪50年代, Mould和Synge[15]将电场应用

到薄层液相色谱中进行寡糖分离, 1974年,Pretorius 等首次将电场引入到高效液

相色谱中, 显示出以电渗流( electro osmotic flow , 简称EOF) 作为流动相推动力进行分离的巨大优势, 但他们的文章在当时并未引起足够的关注。1990年, Tusda 等人发展了毛细管电色谱连续进样技术,利用柱系统中同时存在的压力流和电渗流对柱内样品进行了富集和分离。1995年, Guo等人首次利用溶胶- 凝胶技术制备了开管毛细管电色谱柱。Lord等人发展了毛细管电色谱与质谱联用技术, 并将其应用于染料分析中。1998年, Stead等人发展了毛细管电色谱柱上浓缩技术, 并用于血浆中甾类化合物的分析。Bayer等人首次实现了毛细管电色谱与核磁共振的联用。次年, Horvath等人进一步发展了毛细管电色谱的动力学理论, 对毛细管电色谱和高效液相色谱中影响柱效的各种参数进行了比较研究。Poppe 等人研究了填料孔结构对毛细管电色谱柱性能的影响。近年来, 国内外有关CEC 的分离机制、柱制备、应用研究以及全面的综述文章迅速增加, 且随着电色谱基本理论的进一步完善, 电色谱在生化药物的分析、制药工业、手性药物拆分等领域得到广泛应用。表明在分析领域中已出现毛细管电色谱这一新的研究热点[16]。

2.4.1毛细管电色谱柱

在CEC系统中，最重要的组成部分是CEC毛细管柱。根据固定相的存在形式，CEC 毛细管柱可分为填充柱、开管柱和连续床层三类。CEC 填充柱就是在各种不同孔径的毛细管内填充高效液相色谱常用填料，如ODS、硅胶、硅胶键合其他官能团（如C8、PH、CN、NH2等）、手性固定相等，并以此为分离基质，用电渗流或电渗流结合压力流推动流动相，进而实现样品分离。开管柱模式是用各种硅烷化试剂对毛细管内壁进行修饰，形成一层硅烷化的涂层，分析物通过在涂层上的分配，用电渗流或电渗流与压力一起驱动流动相进行分离。如果不加压力驱动，在普通毛细管电泳仪上就可以进行开管柱毛细管电色谱操作。连续床层毛细

管电色谱是通过原位聚合或熔凝在毛细管中形成连续、整体、多孔的固定相床层的一种电色谱模式。该柱模式不仅避免了填充柱中封口的制备，同时又可以克服开管柱相对较小的不足[17]。

CEC在毛细管柱的两端施加电压,可利用电场在填料表面和毛细管内表面产生的EO F 来推动流动相。与液相色谱的流动相的前锋呈“抛物线形”轮廓相比, EO F 的前锋流形呈“柱塞形”, 它能够显著地降低色谱过程中的峰展宽效应,因此CEC的柱效高于液相色谱的柱效。对于带电荷的物质而言,色谱的分配机理和电泳淌度同时参与分离过程,CEC的双重分离机理使得它非常适于分离中性和带电荷的物质; 与单独使用高效液相色谱(HPLC )和CE相比, CEC能够显著提高分离的选择性[18]。

张锴[19]等利用反相梯度加压毛细管电色谱分离多肽，以C18为固定相, 采用电压和压力联合驱动流动相, 研究反相加压毛细管电色谱分离多肽; 考察了加压电色谱中, 电压对带电和中性物质迁移的影响, 实现了梯度加压毛细管电色谱分离6种多肽; 结果表明,加压电色谱可以很好地抑制气泡形成, 实验结果准确, 重复性好; 梯度加压毛细管电色谱在复杂样品的分离分析中, 具有很大的潜力。

魏娟等[20]以毛细管等电聚焦( cIEF) 为第一维分离模式，以反相加压毛细管电色谱( pCEC) 为第二维分离模式，开展离线二维色谱分离研究，并对复杂肽段进行分离。羟丙基纤维素( HPC) 涂层的毛细管用于cIEF 分离，对6种标准蛋白质的平均分离柱效约为31 万。在毛细管末端引进电隔离槽，方便了第一维样品的收集。在加电6 kV下，第二维pCEC对多肽的分离比不加电时的分辨率和分离速度提高。实验中用牛血清白蛋白的酶解肽段对cIEF/pCEC二维体系进行考察，理论峰容量约为30000。将该平台用于人血红细胞破碎液酶解多肽的分离，7个片段共检测到约200 个峰。结果表明，cIEF/pCEC二维能较好地完成对复杂多肽的分离。

3.色谱技术在多肽分离中的应用实例

3.1乳酪蛋白源ACE抑制肽的分离纯化

以酪蛋白为原料, 采用微生物蛋白酶A水解, 其酶解产物对血管紧张素转

化酶(ACE) 的活性有较强的抑制作用( 水解度17.4%) 。采用DA201- C型大孔树脂脱盐, 样品脱盐率达到85%以上, ACE抑制率提高一倍, 并用Sephadex G- 15 ( 层析柱规格1.6cm×85cm I.D.) 对脱盐后产物分离纯化, 洗脱液为0.02 moL/ L醋酸缓冲液; 反相高效液相色谱( 色谱柱μBondapak C18 3.9 mm×300 mm I.D.和

μBondapak C18 19 mm×300 mm I.D.) 在以流动相A梯度洗脱的条件下对产物进一步分离纯化, 经纯度分析最终得到单一纯品, 其体外ACE抑制率达到84.4%和79.6%[21]。

3.2 凝胶过滤色谱分离大豆抗氧化肽

利用木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白制备大豆肽的水解液，水解液经Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分子量分级，根据分离图谱确定柱层析的最佳条件。在最佳条件下绘制标准曲线，并根据标准曲线判断分离组分的分子量分布。采用铁离子还原/抗氧化能力测定法（FRAP）、二苯基苦基苯肼法（DPPH）以及金属铜离子螯合能力测定法研究不同分子量大豆肽的抗氧化能力，并对抗氧化活性最佳的肽段进行进一步的HPLC分离和氨基酸组成分析[22]。

4.展望

目前,多肽的应用主要集中在多肽药物、多肽食品、多肽护肤品等方面。在多肽药物方面，艾滋病、SARS 病毒、肝炎等病毒性传染病用多肽疫苗预防;肿瘤可用结合特异肿瘤基因靶点的多肽治疗。在多肽食品方面，在食品工业中具有广阔的应用前景。根据来源不同,活性多肽营养食品主要有以下几类:乳蛋白肽类制品、植物肽类制品、胶原肽类制品、畜产类和水产类多肽制品等。在多肽护肤品方面，生物活性多肽添加到美容护肤品中,趋化诱导炎症细胞，促使靶细胞合成分泌细胞外基质如胶原等，都是与靶细胞上的特异受体结合而起到作用。

随着生命科学和生物工程技术的迅速发展,人类对多肽物质的研究的兴趣日益增强，不断建立的新的分离方法，并形成一套完整的分离多肽物质的技术，向着快速、灵敏及高自动化方向发展，来满足科研和生产的需求。许多分离出来的多肽，经系统的研究逐步的运用到药物、食品等领域。

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