水蛭素的分子改造与结构修饰研究进展_王航

#综述#

水蛭素的分子改造与结构修饰研究进展

王 航,许 静,谭树华*

(中国药科大学分子生物学教研室,江苏南京210009)

摘要:目的 为更好地开发利用重组水蛭素,综述国内外水蛭素结构修饰研究状况。方法 依据近年来国内外文献,进行分析、归纳和总结。结果与结论 笔者通过对水蛭素进行各种分子改造或者结构修饰来产生新的类似物蛋白,从而解决水蛭素在临床应用中出现的种种问题,有的也可能会出现新的功能。关键词:水蛭素;不良反应;结构修饰do i:10.3969/j.issn.1004-2407.2011.05.032

中图分类号:R914 文献标志码:A 文章编号:1004-2407(2011)05-0385-03

Advances in the study of structural modifications of hirudin

WA N G H ang ,X U Jing ,T A N Shuhua *(M olecular Biolog y Depa rtment,School of L ife Science &T echno log y,China P har maceut-i cal U niversity,Jiang su N anjing 210009,China)

Abstract:Objective T o study the structural mo dificatio ns of hir udin.M etho ds Based on lit eratures,the research pr og ress in hirudin st ruct ur al analo gues was analy zed and summar ized.Result and Co nclusion H ir udin has been mo dified w ith mo lecular transfor ma -t ion and structural modificatio ns.T he obtained pr oteins can allev iate adv erse r eact ion in clinical,or br ing new functions,such as thrombolysis,inhibiting the platelet agg reg atio n,and tar geting specifically.Key words:hirudin;adv erse reactio ns;st ructur al modificat ions 基金项目:国家自然科学基金项目(编号:30873191)作者简介:王航,女,在读硕士研究生*

通信作者:谭树华,男,教授

自1986年起,基因工程技术的发展使人们获得了建立在多种载体上的重组水蛭素。它在临床治疗和预防各种血栓形成中有着显著的作用,国内外医药界学者将水蛭素作为治疗心血管疾病的有效药物进行研究[1]。但是,临床应用水蛭素还存在一定出血的危险;而且,作为抗凝血酶药物,重组水蛭素预防动脉血栓的效果并不理想。本文将就近年来重组水蛭素临床出现的一些问题,以及近年来国内外重组水蛭素结构修饰类似物研究的最新进展进行综述。1 水蛭素及其结构类似物的不良反应

水蛭素是一种小分子多肽,进入体内后,被体内的蛋白酶切割而失活;而且,水蛭素不经肝脏代谢,以原形或其衍生物的形式经肾脏排泄,肾功能不全的病人因其排泄功能严重受损,存在很大的风险。

作为一种兼有抗血小板和抗凝的药物,其主要问题是出血并发症,可引起一定程度的脏器出血,导致轻度的贫血;高剂量给药除以上类似变化外,转氨酶升高,主要是因为重组水蛭素抑制凝血酶药理活性放大。目前水蛭素引起的出血反应尚无有效药物治疗。停止给药可缓解症状,但是有的情况这种措施并不十分奏效

[2]

。

生物技术药物均有一定程度的免疫原性,水蛭素的免疫原性比较弱。文献报道[3],临床上连续给药重组水蛭素5d 以上可使74%的患者产生抗水蛭素抗体(AH A b)。重组水蛭

素可能会产生严重的变态反应。2003年,Gr einacher 等发现进行重复给药的毒性实验和临床研究中有9例严重变态反应。其中4例在首次给药时,并无不良反应。2 水蛭素结构修饰物及类似物

目前的新药研究领域,开发一个全新的药物十分困难,研究热点大都集中在对现有药物的分子改造或是结构修饰上,同时设法降低毒副作用。针对在临床应用中所出现的问题,将重组水蛭素类多肽药物进行各种类型的结构修饰,以期降低不良反应。

2.1 水蛭素融合蛋白 研究表明,许多抗凝溶栓药物具有协同和互补作用,利用蛋白融合技术连接,产生的融合蛋白较单一使用有更好的活性,有的甚至产生新的活性[4]。

2.1.1 葡激酶-重组水蛭素融合蛋白 溶栓和抗凝药物的联合治疗,是当前临床治疗血栓相关性疾病的重要给药方案。葡激酶与纤溶酶原结合后能激活纤溶酶原,使之成为有活性的纤溶酶,产生的级联反应能激活更多的纤溶酶原,发挥溶栓作用。重组融合蛋白是葡激酶和水蛭素通过1个X a 因子连接起来的蛋白多肽。L ian 等[5]通过1个螺旋结构序列将葡激酶和水蛭素构建成1个Y 形异源二聚体,使两者都具有游离的N 末端而不影响各自的功能。融合蛋白不仅保持了原有的抗凝和溶栓活性,还对富含纤维蛋白的血栓具有一定的靶向性,因而有着广阔的应用前景。

2.1.2 纤维蛋白抗体-重组水蛭素融合蛋白 纤维蛋白抗体与水蛭素通过化学偶联,能够有效抑制纤维蛋白的沉积。牛晋阳等[6]利用特异存在于凝血部位的活性凝血因子FXa 的活性和水蛭素N 末端延伸会使水蛭素丧失抗凝血活性的特性,将水蛭素的N 末端与含凝血因子FXa 识别位点的短肽相融合,使得融合蛋白在非血栓部位不表现出抗凝血活性。在血栓部位,由于人体血液中无活性的凝血因子F X 在凝血部位被活化成活性形式的凝血因子F Xa,后者再将水蛭素从融合蛋白上切割下来,使其发挥抗凝血作用,从而在不减少水蛭素抗凝血活性的同时,最大程度地降低了出血。这在临床上具有非常重要的意义。

2.2 RGD -重组双功能水蛭素 R GD 肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的短肽,是整合素与其配体蛋白相互作

用的识别位点。自研究者[7]于1984年首次报道纤维蛋白原中所含的RG D序列为细胞识别位点以来,RGD肽及其衍生物就成为众多学者关注与研究的热点。RG D与GPòb/óa 作用时高度保守,是识别配体所必需的。天然水蛭素不含有RGD序列,只对凝血酶诱导的血小板聚集有抑制作用。许多研究表明,含R GD序列的外源性多肽能抑制纤维蛋白原与血小板膜GP Ilb/óa结合,抑制血小板激活和聚集,从而显示抗凝、防栓作用。基于此,研究者将RGD序列用于制备靶向溶栓药物[8]。近年来,以RGD序列为基础的GPòb/óa受体拮抗剂,被广泛应用于治疗临床急性冠状动脉综合征[9]。将RGD序列融合于水蛭素分子中,使这种水蛭素的衍生物既有抗凝血酶作用,又有抗血小板激活和聚集双重功能,并使这2种功能非常匹配。两者在产生治疗效果的同时,双功能水蛭素的治疗剂量可降低至天然水蛭素半衰期的1/2~1/3,随着剂量的加大,治疗效果越好,并有明显的量效关系[10]。

2.3多功能融合水蛭素2005年,Szemraj等成功地在重组葡激酶的C末端加入组织型纤溶酶原激活剂的环饼状结构、RGD序列和水蛭素,得到融合蛋白复合物,实验结果该蛋白不但保留了各自原有的抗凝活性,而且有更好的抗纤维蛋白粘连活性。此后,Szemr aj等[11]还证明了此蛋白有着更强的溶栓活性。另外,K ow alski等[12]用同样的方法得到此融合蛋白。体外实验表明:与重组葡激酶相比,其有着更好的溶栓、抗凝和抗血小板聚集功能。

2.4聚乙二醇修饰水蛭素聚乙二醇(P EG)修饰是20世纪70年代后期发展起来的一项热门技术,已用于多种蛋白质药物或者非蛋白质药物的修饰。聚乙二醇修饰技术能够延长药物的半衰期,增强稳定性,降低免疫原性和抗原性;改变药物的分子结构从而改进药物动力学和药效学的性质,提高了作用部位的血药浓度。秦海娜等[13]在微酸性条件下定点修饰水蛭素的组氨酸残基,在得到单修饰产物的同时避免水蛭素活性中心赖氨酸残基的修饰,从而使修饰后产物的活性保留率更高。目前关于聚乙二醇化水蛭素的研究已经进展到了临床ò期,国外相关研究也主要集中在聚乙二醇化水蛭素的药代动力学方面[14-15]。

3水蛭素其他方面新的研究进展

利用现代生物工程技术和生物药剂学技术还可对蛋白多肽类药物进行化学修饰或制成前体药物改善其吸收,提高疗效。现用于临床的水蛭素注射剂还存在一系列问题:半衰期较短,对纯度要求较高,易经肾排泄,经常注射给患者带来不便。人们正在研究一些非注射给药途径,包括肺部、气管、鼻腔、口腔黏膜、直肠以及口服给药。Cen等[16]报道了将重组水蛭素制成肠溶胶囊,斯普拉-道来大鼠口服给药,结果表明,水蛭素肠溶胶囊不仅避免了胃中蛋白酶和胃酸对其的降解作用,与静脉注射相比其抗凝血时间延长,生物利用度有所提高。崔莉等[17]研究也表明,重组水蛭素ó在人工小肠液中比在人工胃液中稳定,EDT A-2N a可对其在小肠中的吸收起到促进作用,重组水蛭素ó的乳化微粒的抗凝血效果更好。因此,在今后的剂型开发中,可将重组水蛭素的乳化微粒制成肠溶制剂,以提高其生物利用度。

随着重组水蛭素药学研究的广泛开展,其适应证范围也在不断拓宽。孙宇等[18]研究了重组水蛭素对实验性白内障的影响和对眼的刺激性,采用D-半乳糖诱发哺乳期大鼠白内障模型和亚硒酸钠诱发哺乳期大鼠白内障模型进行实验,并用家兔进行眼刺激性实验。实验表明,重组水蛭素能减轻D-半乳糖和亚硒酸钠诱发哺乳期大鼠白内障模型的晶状体浑浊度,升高晶状体超氧化物歧化酶(SO D)活力,降低晶状体丙二醛(M DA)含量,对家兔眼无明显刺激性。崔莉等采用溶红细胞实验筛选促吸收剂,用正交实验制备了水蛭素滴眼液。结果表明,其制剂性质稳定,对硒性及半乳糖性大鼠白内障有显著的防治作用。

4前景展望

经过20年的临床应用研究,重组水蛭素及其类似物已经广泛地应用于血栓引发的各种病症,2种水蛭素和1种水蛭素类似物已经被美国FDA批准生产。A ng iamax是根据水蛭素的结构合成的含有20个氨基酸残基的水蛭素类似物,用于治疗不稳定性心绞痛、心肌梗死、以及受HIT干扰引起的皮肤冠状动脉及HIT血栓并发症等。重组水蛭素相对分子质量小,可渗透至血栓,对血栓结合的凝血酶发挥作用。与肝素、阿司匹林等传统抗凝药物相比,水蛭素用量少、疗效高、不良反应少。但水蛭素的临床应用也受到了各种限制,因此,研究如何延长水蛭素的半衰期,研制具有抗凝血酶及抗血小板激活、聚集双重功能的水蛭素衍生物,或研制重组水蛭素模拟肽,通过蛋白质工程技术减少水蛭素的出血副作用,以及研制水蛭素口服制剂等长效、低毒副作用、强效多功能抗凝、防栓药物也将成为今后的研究方向。

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(收稿日期:2011-04-01)

心血管系统药物的PK -PD 模型研究进展

李 冉,金 青*(青岛科技大学化工学院,山东青岛266042)

摘要:目的 对心血管系统药物的药动学-药效学(PK -P D)模型研究进行回顾和展望。方法 查阅文献资料,对相关内容进行总

结。结果 所得PK -PD 模型以S -E max 模型居多。心血管系统药物的PK -PD 模型日益呈现出精细化和复杂化的趋势。结论 应用PK -PD 模型对心血管系统药物的研究前景广阔,值得进一步推广。关键词:心血管药物;药动学;药效学;模型do i:10.3969/j.issn.1004-2407.2011.05.033

中图分类号:R94 文献标志码:A 文章编号:1004-2407(2011)05-0387-03作者简介:李冉,女,在读硕士研究生

*

通信作者:金青,女,副教授,硕士研究生导师

心血管疾病是危害人类健康的严重疾病。据世界卫生组织2008年发布的有关全球疾病状况的评估显示,死于心血管疾病的人数占全球总死亡人数的299。心血管系统药物主要作用于心脏或血管系统,改善心脏的功能,调节心脏血液的心输出量或改变循环系统各部分的血液分配,作用机制较为复杂。

药代动力学(pharmaco kinetics,PK )和药效动力学(phar -macodynamics,PD)是两个按时间同步进行的密切相关的动力学过程。两者结合起来,即PK -PD 模型,可以同时探讨机体对药物的作用以及药物对机体的作用,有助于准确而全面地了解药效消长与剂量(或浓度)及时间的关系,为药物的临床前研究以及临床应用提供研究方法和理论依据[1-2]。本文对近年来心血管系统药物的P K -P D 模型研究进行了综述。1 PK -PD 模型理论及分类

PK -PD 模型可依据其连结方式的4对不同属性分为4类[3]。分述如下:

1.1 直接连接模型和间接连接模型 直接连接是指血药浓度与作用部位浓度直接相关,用药后二者之间可迅速达到平衡,因此可直接将测定的血药浓度作为函数代入药效学模型,建立PK -PD 模型。间接连接是指血药浓度与作用部位的浓度不直接相关,用药一段时间后方能达到平衡,可观测到血药浓度与效应之间存在时间滞后。间接连接模型的PD 模型以S 形E max 模型为代表。V an Steeg 等[4]对S (-)-阿替洛尔在正常血压大鼠(WK Y )体内的药动学和药效学进行了研究。拟合结果表明,药动学符合三室模型,PD 模型为经典S -E max 模型。研究者用PK /P D 模型分析了心血管效应与B 受体阻断剂卡维地洛和阿替洛尔在健康受试者血药浓度之间的关系,以收缩压和舒张压作为效应指标,以A DA PT II 程序评价模拟参数[5]。结果表明卡维地洛和阿替洛尔药效与血药浓度之间存在逆时针滞后环,PK -P D 模型为S 形E max 模型。1.2 直接反应模型和间接反应模型 根据观测到的效应表达与效应部位的浓度连结关系的不同,可将P K -PD 模型分为直接反应模型和间接反应模型。直接反应是指作用部位的药物浓度直接决定药物的效应,即药物不能立刻产生效应,药物通过刺激或抑制某种生理过程,继而产生到达作用部位后立即产生反应,直接连接和间接连接都属于直接反应模型。

间接反应是指药物的效应并不是由作用部位的浓度直接决定的,即药物到达作用部位所期望的药理效应。间接反应PK -PD 模型有:Hao K.等[6]研究了替米沙坦在原发性高血压大鼠体内的特点,采用间接反应和效应室链接模型2种模型,并比较两种PK -PD 模型的拟合特性。结果表明,在原发性高血压大鼠体内,间接反应模型比效应室链式模型拟合更佳。1.3 软连接模型与硬连接模型 软连接和硬连接是根据建