western转膜条件
western转膜条件
蛋白来源：RAW264.7 总蛋白
蛋白名称（可）：一些转录因子
蛋白分子量：40~70 KD
WB用膜类型、孔径：0.45 NC
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA
转膜时间：60~90 min
PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。
蛋白来源：皮细胞总蛋白
蛋白名称（可）：occludin & AKT
蛋白分子量：65 KD & 56 KD
WB用膜类型、孔径：0.45 PVDF
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100 V
转膜时间：60~70 min
设备名字是“Bio-Rad mini”。
蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：65 KD & 55 KD
WB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）
转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12 V
转膜时间：30-40 min
设备：“Bio-Rad mini”
建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。
蛋白来源：293T细胞
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：95 KD & 35 KD
WB用膜类型、孔径：PVDF
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90 V-110 V，控制电流不要超过300 mA。
转膜时间：70 min
蛋白来源：肿瘤手术标本
蛋白名称（可）：转录因子
蛋白分子量：33 KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流
转膜时间：150 min
转膜设备：湿转Bio-Rad
说明：相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。
蛋白来源：成纤维细胞
蛋白名称（可）：smad3
蛋白分子量：54 KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流
转膜时间：150 min
转膜设备：湿转Bio-Rad
蛋白来源：胰腺癌细胞
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：16 KDa and 42 KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：120 V 恒压
转膜时间：90 min
转膜设备：湿转Bio-Rad
蛋白来源：大鼠血管平滑肌细胞
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：72 KD，42 KD 和22 KD
WB用膜类型、孔径：一般的PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒流一膜0.26 A，两膜0.3 A。
转膜时间：90 min
设备：“Bio-Rad mini”
建议：转膜缓冲液最多用3次，最好现用现配，我们用的没有加SDS，转的时候最好能用冰块一类的东西降一下温，这样转的效果要好一些，转的时候一定要把治每层之间的气泡除去，同时使滤纸大于膜，膜大于胶，以免烧坏电极。
蛋白来源：大鼠PBMC
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：55 KD
WB用膜类型、孔径：0.22的PVDF膜
转膜方式（恒流）：湿转
转膜时间：60-90 min
设备：“Bio-Rad mini”
建议：转膜液用过两三次之后转膜效果就很差了其它按照常规就好了其实0.22的膜一般不怕转过头以我们的经验，转膜时间、电压其实也有很大围的调整，并不是非要固定于哪一个最合适，曾经做过一膜转，17 KD的和170 KD的，按照170 KD的条件，17 KD的转膜也很好的。
蛋白来源：人非小细胞肺癌细胞系
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：大于250 kD
WB用膜类型、孔径：millipore PVDF膜0.45 um
转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒流0.3A。
转膜时间：180min
设备：“Bio-Rad ”
建议：电转保持电压在70 V以上，保持低温，如果电压低过70就需要换缓冲液了。
蛋白来源：白血病细胞
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：28 KD
WB用膜类型、孔径：0.45的NC膜
转膜方式（恒流）：湿转，90 min，0.25 A
设备：“Bio-Rad ”
建议：海绵厚度要合适，一次转磨用的海绵太薄，导致治没夹紧，转膜后拿出来一看，marker 都变得七扭八歪。但是有前辈说垫的海绵太厚可能将胶压断，没经历过，不知道是不是会有这种情况。
蛋白来源：肿瘤细胞
蛋白名称（可）：磷酸化蛋白
蛋白分子量：10-200 KDa
WB用膜类型、孔径：millipore PVDF膜0.45 um
转膜方式（恒压、恒流）：120 v 恒压
转膜时间：120 min
转膜设备：湿转Bio-Rad
建议：转膜缓冲液只用2次，基本都转上，5%BSA封闭，减少背景。
蛋白来源：胰腺β细胞
蛋白名称（可）：******
蛋白分子量：90-130 KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：250 mA 恒流
转膜时间：150 min
转膜设备：湿转
蛋白来源：原核表达
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：38 KD
WB用膜类型、孔径：0.45 NC
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压：100 V
转膜时间：120 min
蛋白来源：心脏
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：220 kDa，130 kDa，70 kDa，41kDa
WB用膜类型、孔径：PVDF
转膜方式（恒压、恒流）：恒压
转膜时间：70 v120 min，180 min，5-6 h
转膜设备：伯乐湿转
建议改进方向（可选）：40 kDa一下，70 v ，60-90 min足够，40-70 kDa 90-120 min即可。
70-120 kDa ，70 v，120-180 min足够，120-180 kDa ，180-240 min，180 kDa以上建议6 h。
蛋白来源：卵巢癌细胞膜蛋白
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：53 KD
WB用膜类型、孔径：PVDF膜0.45 um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压
转膜时间：80 V 100 min
转膜设备：湿转Bio-Rad
蛋白来源：人宫颈癌HELA细胞总蛋白
蛋白名称（可）：β-actin
蛋白分子量：42
WB用膜类型、孔径：PVDF膜0.45 um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压
转膜时间：50 4 h
转膜设备：湿转Bio-Rad
蛋白来源：脑组织
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：16 KD、27 KD、32 KD、42 KD
WB用膜类型、孔径：PVDF 0.22 um
转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒流1 mA/cm2或2 mA/cm2
转膜时间：不定
转膜设备：六一仪器
建议：我共做了六个蛋白，所以总在想节约时间的方式。
在预试时我会观察电压数与转膜效率的关系，所以我不会按时间来定何时转完，而是按电压来定。通过染胶来确定电压数与转移蛋白分子量上限的关系。这样有的5分钟就转完了，不用多浪费时间。并且六一的半干转膜仪随着使用次数的增多，效率也会下降，所以时间和转膜效率（尤其是使用后期）的关系并不稳定，单纯依靠时间有时会有问题。
蛋白来源：CHO cell
蛋白名称（可）：酶原
蛋白分子量：40 KD
WB用膜类型、孔径：0.22的PVDF膜（Biorad）
转膜方式（恒压）：100 V，湿转，转膜时间：60 min。
设备：Tanon（天能）
建议：
1. 转膜液现用现配，用完倒掉。
2. 转膜时间，电压可以适当调整。分子量大或者小一些的蛋白，采用此条件一样转膜效率很高。
蛋白来源：Hepg2
蛋白名称（可）：EGFR
蛋白分子量：170kd
WB用膜类型、孔径：pvdf 0.45
转膜方式（恒压、恒流）：24V
转膜时间：2个半小时
转膜设备：伯乐半干转
蛋白来源：肝癌细胞
蛋白名称：HIF-1α
蛋白分子量：120 kD
WB用膜类型、孔径：NC膜
转膜方式（恒压）：80伏，湿转
转膜时间：150分钟
设备：“Bio-Rad mini”
建议：湿转，转膜液特别重要，否则会导致电压或者电流不稳影响转膜条带。转膜均现配先用，不重复利用。转膜时间一般是150分钟，80伏恒压。经春红染色，靠近蛋白胶的一侧膜上蛋白染色深，膜另外一面染色浅，说明蛋白未转过。该湿转条件自己做过的蛋白分子量围：170-36 kD。
蛋白来源：心肌细胞总和膜
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：128 KD，100，60，55，43 KD
WB用膜类型、孔径：NC膜0.2 um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压
转膜时间：70 V 200 min
转膜设备：湿转Bio-Rad
建议：转膜液最好现配现现用，或配成母液，最好不重复使用，70 V电压下，电流约154 mA。甲醇可以加到150 ml。对大分子量如200 KD转膜时间延长6-8 h。
蛋白来源：肺脏
蛋白名称（可）：ICAM-1
蛋白分子量：85~110 KD
WB用膜类型、孔径：0.22NC
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流300 mA
转膜时间：120 min
设备名字Bio-Rad mini
一抗用的santa cruz 1 mL包装的。比例调整到1：800做出很好的条带。效价会一直降低的。去年做的这个指标，今年夏天做就不行了。
蛋白来源：成纤维细胞
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：16 KDa
WB用膜类型、孔径：0.2 um PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：0.2 A恒流
转膜时间：65 min
转膜设备：湿转Bio-Rad
蛋白来源：成纤维细胞
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：28 KDa
WB用膜类型、孔径：0.2 umPVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：0.25 A恒流
转膜时间：60 min
转膜设备：湿转Bio-Rad
蛋白来源：人肿瘤细胞
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：80 KD
WB用膜类型、孔径：0.45 um PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：半干转移系统恒流，勿超过0.85 mA/cm2，同时转多膜电流需累加（串联）
转膜时间：60-90 min
设备：Bio-Rad
其实有些东西并不是非常严格的，要转移的目的蛋白分子量小，那么转移的时间就短一些，反之，则长一点；蛋白量充足，可以多转一会，蛋白量较少，则要少转一下，免得蛋白穿膜而过到了滤纸上而前功尽弃。
蛋白来源：人和鼠肝癌细胞总蛋白、胞浆、胞核蛋白
蛋白名称（可）：***
蛋白分子量：17--116 kd
WB用膜类型、孔径：PVDF膜0.45 um
转膜方式（恒压、恒流）：恒流200 mA
转膜时间：3 h
转膜设备：湿转六一24D mini
蛋白来源：CO COS7 293T
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：80 72 56 52 48 25 18KD
WB用膜类型、孔径：0.45 um PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：湿转90 V 电流约为230--280 mA之间。两膜串联叠加。
转膜时间：40 min
设备：Bio-Rad 法码西亚
蛋白来源：人肿瘤细胞
蛋白名称（可）：磷酸化蛋白
蛋白分子量：30-60 KDa
WB用膜类型、孔径：pall NC膜0.45 um
转膜方式（恒压、恒流）：恒流0.85-1 mA/平方厘米膜
转膜时间：60-90 min
转膜设备: 六一半干转
建议：转膜缓冲液用新鲜配制的，可先配成2倍的母液，转膜液的多少会影响电转的效率，一般将吸水纸润湿即可，不要和膜一起浸泡，这样效果很好。
蛋白来源：人肝癌肿瘤细胞
蛋白名称（可）：notch
蛋白分子量：60-120 KDa
WB用膜类型、孔径：pall NC膜0.45 um
转膜方式（恒压、恒流）：恒流0.3 A
转膜时间：-20度冰柜120 min
转膜设备: 湿转Bio-Rad
建议：转膜缓冲液用新鲜配制的，可先配成10倍或5倍的母液，保持低温是转膜效果的一个保证，这样效果很好。
蛋白来源：胶质瘤细胞总蛋白和核蛋白
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：18 KDa 、36 KDa、55 KDa、98 KDa
WB用膜类型、孔径：NC膜PALL
转膜方式（恒压、恒流）：0.35 恒流
转膜时间：60 min
转膜设备：湿转Bio-Rad mini
转缓液的配制有点讲究。如果蛋白大于一百多，一般加入SDS，时间延长结果会更好些。由于，目前试验的蛋白就都不大，所以，我们都采用不加SDS的转缓液，跑出来的条带也很整齐、干净。
蛋白来源大肠癌205
蛋白名称（可）：
蛋白分子量：92 kd，43 kd
WB用膜类型、孔径：0.45pvdf
转膜方式（恒压、恒流）：恒压
转膜时间：90 min
转膜设备：湿转，天能。
蛋白来源：大鼠脑组织
蛋白名称（可）：BDNF（28 KDa）、Bactin（42 KDa）、LaminB（72 KDa），以及磷酸化蛋白（43 KDa）
WB用膜类型、孔径：PVDF（0.45）膜
转膜方式（恒压、恒流）：300 mA 恒流
转膜时间：60 min
转膜设备：湿转Bio-Rad Mini
PVDF转膜实验步骤及注意事项
蛋白质转膜实验注意事项（用于N端测序） 转膜实验操作要点 1、SDS－PAGE电泳：按常规条件进行（CAPS系统:用于>=20KD蛋白；Tris－Tricine 系统：用于低分子量蛋白，也可用于高分子量蛋白）； 2、甲醇浓度：CAPS电印迹缓冲液中甲醇浓度范围是0-20％（甲醇浓度高，用于低分子量蛋白转印；甲醇浓度低甚至不含甲醇的用于高分子量蛋白的转印）； 3、PVDF膜处理：取出PVDF膜，用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。（注：此后的操作须防止PVDF膜干涸。如果膜变干，须重复本步骤的操作）； 4、凝胶处理：取出电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5-10分钟。（注：转移某些强碱性蛋白pI>9.0时，可省略本步骤）； 5、安装转印槽子：将滤纸和海绵放入电印迹缓冲液中浸泡一下，然后按海绵、滤纸、PVDF 膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中； 6、转印条件：在50V恒压条件下（100-170mA）于室温下进行电印迹转移，转移时间为0.5-2小时。（注：务必排尽凝胶和PVDF膜之间的气泡。例如对70kD以上的蛋白质须延长转移时间）； 7、PVDF膜染色前处理：取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，然后进行染色； 8、膜染色：考马斯亮蓝染色（将0.1％考马斯亮蓝R-250溶于40％甲醇/1％乙酸中）30-50秒（切勿超过1分钟），50％甲醇脱色（勤换脱色液），用去离子水充分洗涤，然后晾干即可； 转膜实验注意事项 1）电泳胶要求：尽可能使用厚胶，以保证膜上高载量； 2）预电泳处理：低电流跑空胶2～2.5小时，防止胶内杂质污染； 3）转印缓冲液：不能使用Tris-甘氨酸缓冲液，推荐使用CAPS缓冲液； 4）转印膜选择：不能用NC膜，务必使用PVDF膜；
Western超详细实验步骤
Western实验步骤 1. 电泳(Electrophoresis) （1）SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。 一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。 配胶步骤： 1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。 2.按比例配分离胶（8ml-10ml） 3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面 4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。（如果今日不上样可以放入4°C冰箱） 注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理 1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加 3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀 2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。 3.12000r离心5分钟。 （3）上样与电泳 1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右 2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。 3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳） 注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。 3.转膜(Transfer) 1.物品准备，甲醇，转膜缓冲液，滤纸，转膜槽，玻璃皿3个，制冰。 2.取下胶板，用专门的板将玻璃板分离（务必不要将胶弄破，动作轻些，从下面和上面分离玻璃板），切适合大小的胶（不要切掉MAKER）。 3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中，记录胶的顺序，剪与胶同等大小的滤纸和转膜纸PVDF膜，PVDF膜要放入甲醇中浸15秒（一般1-2分钟），胶要切角做标记（不要切到maker）,一般一个切三个角，一个切一个角，记录顺序 4.铺膜，PVDF膜铺在胶上，在PVDF膜上铺三层滤纸，然后胶的对侧面铺三层滤纸即可（滤纸要大于等PVDF膜，PVDF膜要大于等胶），赶尽气饱。 5.再将铺好的膜胶滤纸，转入转膜夹中，有PVDF膜这面放在正极侧（即无色透明夹这面），再将夹子放入转膜槽里（电极不要放错，蛋白质带负电的）
western转膜条件
western 转膜条件 蛋白来源：RAW264.7 总蛋白蛋白名称（可保密）：一些转录因子蛋白分子量：40~70 KD WB用膜类型、孔径：0.45 NC 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA 转膜时间：60~90 min PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min 就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。 蛋白来源：内皮细胞总蛋白蛋白名称（可保密）：occludin & AKT 蛋白分子量：65 KD & 56 KD WB用膜类型、孔径：0.45 PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100 V 转膜时间：60~70 min 设备名字是“ Bio-Rad mini ”。 蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：65 KD & 55 KD WB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12 V 转膜时间：30-40 min 设备：“ Bio-Rad mini ” 建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。 蛋白来源：293T 细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：95 KD & 35 KD WB用膜类型、孔径：PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90 V-110 V ，控制电流不要超过300 mA。转膜时间：70 min 蛋白来源：肿瘤手术标本蛋白名称（可保密）：转录因子蛋白分子量：33 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min 转膜设备：湿转Bio-Rad 说明：相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。 蛋白来源：成纤维细胞 蛋白名称（可保密）：smad3 蛋白分子量：54 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流 转膜时间：150 min 转膜设备：湿转Bio-Rad 蛋白来源：胰腺癌细胞 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：16 KDa and 42 KDa
Western操作步骤
Western-Blot 操作流程及注意事项 Western操作步骤 （一）蛋白样品制备 （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2~7.3）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3. 按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合） 4. 每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行） 6. 于4℃下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷） 7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。 （个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液，按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强） （2）组织中总蛋白的提取： 1. 将少量组织块置于1~2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。 3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 4. 裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml 离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： 1. 将培养液倒至15ml 离心管中，于2500rpm 离心5min。 2. 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后PBS 重复洗涤一次。 3. 用枪吸干上清后，加100 μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 4. 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （二）蛋白含量的测定 （1）制作标准曲线 1. 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 2. 取18 个1.5ml 离心管，3 个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。
Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜
Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜 PAGE倒胶的仪器我们在前面WesternBlot仪器之选已经介绍过了，除了顺手的工具能防止漏胶，PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，小气病发作的后果往往是得不偿失——胶凝不好多半是这里疏忽（或者混合不匀），因为相对配胶的其他组分，AP算最活跃分子——如果还有诸如漏加某组分或者配比错误或者Buffer搞错，那绝对是你自己找骂，不值得同情。水要用去离子的纯水，MilliQ级更好。Cambrex(原来的FMC)有商品化的丙烯酰胺母液，很贵，也很好——配出的胶对200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE胶，条带清晰漂亮，可惜一直没有搞清楚配方的奥秘；但是数十倍于丙烯酰胺粉剂的价格令人却步，不过，对接触丙烯酰胺粉尘严重过敏的人可以选择这个。更加豪华的选择是已经凝好的预制胶，各种配方各种比例各种梳孔大小多少任君选择，打开即用，当然更直接方便，更吸引人的是结果漂亮，分辨率高，特别是重复性好，条带真正是"razor sharp"啊！平时都能用这么豪华的东西心情当然超爽啊，实验紧凑又轻松，效率也更高啊！如果实验都能这么“好马配好鞍”，想必更容易出结果，也就更容易拿经费吧！什么时候我们的实验才能实现这种良性循环啊！Invitrogen旗下的Norvex和Cambrex（原来的FMC）PAGEr都是首选预制胶。可是在“社会主义初级阶段”这种奢侈品平时流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了新的优惠活动，买3盒NuPAGE预制胶就送电泳仪或者电转移，面对这种诱惑，你难道就没有一点非份之想的冲动？ 上样电泳：上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer （别小气，重复使用会降低缓冲能力的），好像基本不会出问题了。当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。 电泳结果检查：如果要做Western Blot，是否需要先检查电泳结果呢？能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng 蛋白。可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot
western转膜
western blot转移电泳一般操作流程 总的来说，半干转、湿转的程序和基本原理是相同的。胶和膜预稀释并用电转缓冲液平衡；滤纸/胶/膜/滤纸三明治放入电转设备中；正确的方向确保蛋白转移到膜上。合适的电压/电流条件对于电转的成败是非常重要的。
电转缓冲液和电转条件的选择 对于不同的电转设备，当选用不同的胶和缓冲液时，要求不同的电压/电流。变性凝胶需要增加电转时间，而低分子量的蛋白需要相应的缩短电转时间。现在实验室常用的Bio-rad 小型Mini Trans-Blot转印槽（湿转）和Trans-Blot半干转印系统转印槽（半干转）相应的电转参数如下表： 槽式转印半干转印 Mini Trans-Blot槽Trans-Blot半干转印系统转印槽印迹区域（宽 x 长）10 x 7.5 厘米24 x 16 厘米 转移参数 凝胶夹数 2 -
缓冲液要求450ml ≤200 ml 电极距离4cm 按夹层结构厚度确定 转移时间（高强度）60分钟15–60 分钟 冷却蓝胶冷却装置/冷却旋管- 凝胶容量 18.3 x 19.3 厘米- 1 块凝胶（2 块凝胶堆叠）16 x 20 厘米- 1 块凝胶（2块凝胶堆叠）16 x 16 厘米- 13.3 x 8.7 厘米- 3 个凝胶并列 8.3 x 7.3 厘米每个凝胶夹1块凝胶共2个 凝胶夹（两种尺寸）4个凝胶并列 8.6 x 6.8 厘米 通常我们在做湿转的时候，选择100V恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在120-350mA之间，分子量在60KD以下的60分钟即可，分子量在60KD 以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。所以如果你所需要转印的蛋白分子量差得比较多（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考虑将胶从中间分开，两部分分别采用不同时间转印，能达到你理想的效果。电转液一般可以重复使用3次，之后电流会过大，不适合再使用。 而对于半干转，我们一般选择恒流（膜面积的3倍：3 mA/cm2）之间一般60分钟，同样根据蛋白分子量适当调节时间。 需要注意的是：低温对于膜的转印是至关重要的，尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率（胶用考马斯亮蓝加热染色，膜用
Western 转膜步骤 操作方法
Western 转膜步骤操作方法 Western转膜步骤(建议用伯乐电泳系统来操作完成) 下面的步骤适用于通过Xcell Ⅱ转印系统进行蛋白印记的大部分应用。为达到最佳效果，用户的优化是必要的。 I. 所需材料：?Xcell SureLock?或Xcell Ⅱ?Mini-Cell以及Blot Module（Cat. Nos. EI10001, EI9001及EI9051） ?电泳后的迷你胶（mini-gel）（最大的尺寸9cm*9cm） ?预先切割好的印记膜： 硝酸纤维素（Cat. no. LC2000或LC2001）， PVDF（Cat. No. LC2002）或Nylon+（Cat. No. LC2003） ?转印垫（Cat. No. EI9052） ?甲醇 ?去离子水 ?转移缓冲液（配方见下文） ?用于平衡膜，滤纸和转移垫的浅盘 II. 规格： 转印槽尺寸：14.5cm x 14cm x 11cm Blot Module容积：约200ml 下缓冲液槽容积：600ml Blot尺寸：约9cm*9cm 注意：在以下步骤中，应该始终使用手套以避免凝胶和膜的污染，并防止接触电泳和电转过程中常用的刺激物。 Ⅲ材料制备 a) 转膜缓冲液- 请注意对大多数转膜我们推荐使用强度减半的Towbin缓冲液，其中含有20％的甲醇。使用Xcell Ⅱ转印系统进行成功的转膜，0.5Xtowbin缓冲液就可以提供足够的离子强度，而不产生过多的热量。这种缓冲液可能不适合其它的转印系统，反过来也是这样。一升的转膜缓冲液制备方法如下（含20％甲醇的0.5X Towbin） 使用我们的Tris-Glycine转膜缓冲液：去离子水760 ml 转膜缓冲液（Cat. No. LC3675）40 ml (25×未稀释液) 甲醇200 ml 总体积1000 ml 自己制备Tris-Glycine转膜缓冲液： Tris 碱(12mM) 1.45 g 甘氨酸(96mM) 7.2 g 甲醇（20％终浓度）200 ml
[原创]-Western-blot转膜整个过程
转膜（T r a r s m e m b r a n）1转膜的定义 将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。 2转移膜的选择 杂交膜的选择是决定Westernblot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Westernblot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45μm和0.2μm两种规格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如用0.45μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。 最常用于WesternBlot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose,NC）膜和聚偏二氟乙烯（PolyvinylideneFluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 硝酸纤维素（nitrocellulose,NC）膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；NC韧性较差，易损坏。 聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。 膜的选择主要根据： p膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； p不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）； p如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。 几种膜的性质对比 PVDF膜NC膜尼龙膜背景低低较高 蛋白结合能力100-200μg/cm280-100μg/cm2>400ug/cm2机械强度强干的膜很脆软而结实 溶剂抗性强差差
western转膜条件
w e s t e r n转膜条件 蛋白来源：RAW264.7总蛋白 蛋白名称（可保密）：一些转录因子 蛋白分子量：40~70KD WB用膜类型、孔径：0.45NC 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400mA 转膜时间：60~90min PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，?曾经因为失误，转了15min就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。 蛋白来源：内皮细胞总蛋白 蛋白名称（可保密）：occludin&AKT 蛋白分子量：65KD&56KD WB用膜类型、孔径：0.45PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100V 转膜时间：60~70min 设备名字是“Bio-Radmini”。 蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白 蛋白名称（可保密）：保密 蛋白分子量：65KD&55KD WB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理） 转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12V 转膜时间：30-40min 设备：“Bio-Radmini” 建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。? 蛋白来源：293T细胞 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：95KD&35KD WB用膜类型、孔径：PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90V-110V，控制电流不要超过300mA。转膜时间：70min? 蛋白来源：肿瘤手术标本 蛋白名称（可保密）：转录因子 蛋白分子量：33KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350mA恒流 转膜时间：150min
western转膜条件
western转膜条件 蛋白来源：RAW264.7 总蛋白 蛋白名称（可保密）：一些转录因子 蛋白分子量：40~70 KD WB用膜类型、孔径：0.45 NC 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA 转膜时间：60~90 min PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。 蛋白来源：内皮细胞总蛋白 蛋白名称（可保密）：occludin & AKT 蛋白分子量：65 KD & 56 KD WB用膜类型、孔径：0.45 PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100 V 转膜时间：60~70 min 设备名字是“Bio-Rad min i”。 蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白 蛋白名称（可保密）：保密 蛋白分子量：65 KD & 55 KD WB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理） 转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12 V 转膜时间：30-40 min 设备：“Bio-Rad mini” 建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。 蛋白来源：293T细胞 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：95 KD & 35 KD WB用膜类型、孔径：PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90 V-110 V，控制电流不要超过300 mA。 转膜时间：70 min 蛋白来源：肿瘤手术标本 蛋白名称（可保密）：转录因子 蛋白分子量：33 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。BCA法。 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 (2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。 (3)电泳
i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。 两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾 干。 ii.灌胶与上样 （1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。 （操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。） （2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。） （3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 （4）配4%的浓缩胶,加入TEMED（TEMED,中文名为四甲基乙二胺，是一种无色透明的液体，有微腥臭味，可以用于配制SDS-PAGE胶。TEMED可以催化APS产生自由基，从而加速聚丙烯酰胺凝胶的聚合,可作为一种促凝剂使用）后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
[原创]-Western-blot转膜整个过程
转膜（Trarsmembran） 1 转膜的定义 将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。 2 转移膜的选择 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45 μm和0.2 μm两种规格的NC膜。大于20 kD的蛋白可用0.45 μm的膜，小于20 kD的蛋白就要用0.2 μm的膜了，如用0.45 μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。 最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；NC韧性较差，易损坏。 聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。 膜的选择主要根据： p 膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； p 不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）； p 如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。 几种膜的性质对比 PVDF膜NC膜尼龙膜 背景低低较高蛋白结合能力100-200 μg/cm280-100 μg/cm2>400 ug/cm2 机械强度强干的膜很脆软而结实 溶剂抗性强差差
Western Blot(WB)操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查
Western Blot（WB）操作中需要注意事项 与结果不理想可能的原因自查 第一部分 WB操作中需要注意事项 一、蛋白样品的准备 1、样品质量 所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。 2、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB 一般5×106就足够 3、小分子量蛋白10KD需要的注意点 1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE 体系 2）也可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可 4、大分子量蛋白200KD需要的注意点 1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心 2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析） 3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高 二、制胶 1、凝胶质量 不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。 2、在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象 1）加水时不能对着胶冲，要沿着玻璃板缓慢流行 2）加水满后一定要保证上方水平面是平齐的 3）加胶要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固等现象 4）有其他人的经验是用异丙醇封胶封胶后左右晃一下
Western 不同转膜方法的取舍
转膜: 小分子量的蛋白半干转效果比较好， 大分子量（100KD）以上建议湿转。 具体转膜条件需要多摸一下。30-80KD半干转恒流1mA/cm2，1-1.5h 都可以，大分子湿转100V，2.5h以上应该可以，转完膜丽春红染出的条带比较清楚的话，一般都能有结果。 湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。 显影:转膜后看和你的蛋白分子量近似的预染Marker有没有转过去，如果marker没问题，那基本可以认为你的蛋白转过去了。 显色的话应该ECL好些吧，灵敏度更高呢，HRP标记的二抗孵育完后用TBST充分清洗，然后加ECL试剂，包好后压片，一般如果你能够看到荧光的话，压片5min以内就可以看一下，如果看不见的话，直接压半小时吧。暗室中压片，压片完后显影、定影、水洗，就可以了。要是对曝光时间没有把握，可以一次叠两张胶片，相当于做个梯度。 蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？ 解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用2.5 A/cm2，30min就应该够了。湿转，按照bio-rad的说明，用100mA，也得要半个多小时吧。 转膜时何为湿法，何为半干法？ 解答：半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法 半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小好像都有关系，那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢？一般的条件是怎样的？ 解答：半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；而湿转的话电流是恒定的，时间也是根据分子量而定。 western显色的方法主要有以下几种： i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
新手Western blot步骤及注意事项
WesternBlot操作步骤及注意事项 【原理】 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 【试剂及配制】 1、SDS-PAGE试剂：见试剂盒说明书。 2、电泳缓冲液 Tris（分子量121.14） 3.03g 甘氨酸（分子量75.07） 18.77g SDS 1g 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X电泳缓冲液进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X10倍，蒸馏水定容至1000ml）。电泳缓冲液使用2~3次后推荐更换。 3、转膜缓冲液 湿转法 48mmol/L Tris 2.375g 39mmol/L甘氨酸11.25g 0.0375%SDS 0.375g 加少部分蒸馏水溶解 20%甲醇200ml 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X转膜缓冲液（不含甲醇）进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X5倍，蒸馏水定容至500ml，或按10倍用量定容至1000ml等；用时取100ml，加入200ml 甲醇再加蒸馏水稀释至1000ml）。使用转膜缓冲液时注意室内通风。转膜缓冲液用于转膜一次后，建议更换新转移缓冲液，旧转移缓冲液可用于转膜前浸泡物品。 4、TBS缓冲液 1mol/LTris·HCl（pH7.5）10ml NaCl 8.8g 蒸馏水定容至1000ml 配制后室温保存，可配制成10XTBS缓冲液，使用时稀释10倍。 5、TBST缓冲液（洗膜液） 20%Tween20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用，现配现用，因含Tris缓冲液，其PH易受空气中二氧化碳影响，此外注意使用时不要直接接触到皮肤，其有致癌作用。
western blot转膜常见现象及处理方法
1，转膜不充分/过转 对于非小分子量尤其是大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不会出现过转情况，转膜不充分是主要原因，增加转膜力度无非是加大电压/电流，延长时间。但对于小分子蛋白（<30kd就要注意了，<15kd尤其要当心）很可能出现过转，丽春红染膜或观察marker有没有穿膜可以确认，没有丽春红也可以考染转膜后的胶，如果是一片空白，则要小心了，可适当降低转膜力度。对于低分子量一般转膜液不要加SDS以防过转，《抗体技术实验指南》提供的针对中低分子量的湿转缓与高分子量的相比也是不含SDS的。 2，封闭时间不足 这一点似乎多数人都不重视，所以有时候会有些意外。我一般室温2~4h，但4度过夜确实是最好的。另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握并获得较好的效果，对新手似乎更好。 3，抗体与封闭液有交叉。 实际上牛奶对于多数抗体来说还是很好的，但所有二抗也都写着：与牛奶可能有交叉反应。BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。单用TBST也可以，此法虽然减少了交叉，但单就封闭能力而言却也因此而降低。 4，抗原-抗体浓度过高 一般10min*3次就足够了，如果不放心可按自己意志加强时间、次数、洗脱液用量。 5，暴光时间过长 降低曝光时间，以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，对一切原因有效，但效果局限。 6，抗原-抗体浓度过高 降低抗体浓度或蛋白上样量，以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，仅对膜上蛋白和一抗引起的有效。 7，转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) 主要是气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上，这一步在操作时尤其要小心，我自己犯过，也看到其他人犯过。我的办法是把胶铺到膜上，先使其一边接触膜的一边，这样就会在胶和膜交界的地方形成一个水相前缘，然后慢慢落下凝胶，这样这个水相前缘就会逐渐推进直至胶膜重合，如是则不会有气泡产生。把胶铺到膜上而非相反是因为胶是透明的，可以看到水相前缘以及有无气泡产生。 8，抗体交叉反应，形成非特异性条带 非特异性条带在普通多抗比较多见，纯化多抗会好的多，但单抗也不是绝对没有，我也遇到过。关于western 的抗体选择在此提出我的观点：最理想的是混合单抗，其次是纯化多抗，单抗和多抗各有局限和特点，根据个人对特异性需求和蛋白的稳定性而定。考虑的参数主要是抗原表位和特异性两个因素，不包含每个抗体价格。混合单抗虽然针对多个表位但代价太高，需购置多个单抗然后混合，很少有人这么做。纯化多抗基本具有混合多抗的性质和优点，表位多，稳定性好，特异性也不差，我觉得是实际中的首选。单抗虽然特异性好，但如果其针对的表位在提取蛋白时被破坏则其敏感度会下降甚至为0，故不稳定。普通多抗虽然表位多，但因含其他抗体，特异性差了好多，会有很多杂带乃至背景。实际我做的抗体多数都是普通多抗，只要封闭的好，效果还是很不错的；单抗虽说不稳定，但实际中我都能做出来，尤其是内参，强烈推荐只选单抗。 9，SDS非特异性结合蛋白条带 使用无SDS转膜液. 10，封闭液有杂质颗粒（静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层） 主要原因是牛奶里面会有一些不悬浮的大颗粒，这些东西对封闭无益。我所有的牛奶全是配好后在4度静置（最好放在尖底的管子内），这样那些大颗粒就会沉淀到底部，吸取时不要担心牛奶不均而特意混匀，我只吸上面的，下面的颗粒则不要取。如是则在也没有遇到这种现象。不推荐过滤牛奶，因为耗时极长且得率极低。我用过几次但后来废弃了这种做法。
分子机制-蛋白检测-Western Blot(蛋白质印迹法)
主题：Western Blot（蛋白质印迹法） 概述： 蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 目的： 获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。 原理： 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 步骤： 1.提取组织或细胞蛋白； 2.测定蛋白质浓度； 3.电泳： 电泳条件为：恒压100V，待染料前沿移行到距离凝胶底部2-3mm时方可停止
（约120min）； 4.电转膜仪转膜： 转膜条件为：恒流250mA ，2h（时间可根据目的蛋白分子量适当调整）； 5.封闭：5%脱脂牛奶室温封闭1h； 6.加一抗：一抗封膜之后室温条件下摇1h然后放入4℃冰箱中过夜； 7.收一抗，PBST洗膜3次，10min/次； 8.二抗孵育： 室温孵育1h，所用二抗的比例和种属见步骤9）表格。 9.洗膜：PBST洗膜2次，PBS洗膜一次，10min/次。 10.显色 流程图：
Bio-Rad Western Blot半干法转膜的十大注意事项
Bio-Rad Western Blot半干法转膜的十大注意事项 Do not immerse the unit in liquid. Use special care when cleaning the anode plate to avoid scratching or marring the platinum. Do not use abrasives or strong detergents. The cathode plate (stainless steel) c an be cleaned with a mild abrasive to remove salt that may deposit du ring normal operation. The entire unit can also be periodically disas sembled and cleaned with water to remove salt deposits. 推荐清洗方法：转膜结束后，立即用双蒸水将转膜仪冲洗几次，并晾干。 Electrophoretic transfer of proteins and nucleic acids is dependent o n many factors. Observe the following guidelines to avoid mishaps tha t may result in serious damage to the instrument or injury to the ope rator. 1. Do not reverse polarity on this instrument. This will result in c orrosion and rusting of the stainless steel cathode. If this should o ccur, the stainless steel should be cleaned with a mild abrasive clea ner to remove the rust. 2. Do not exeed 25 V with this instrument. This could damage the ele ctrodes. 3. Do not adjust the pH of transfer buffers unless specifically indi cated. Following instructions carefully. Adjustment of pH of transfer buffers, when not indicated, will result in increased buffer conduct ivity. This is manifested by a higher than expected initial current o utput as shown by the power supply's current meter. Monitor buffer re sistance with the Model 200/2.0 power supply prior to each run to ins ure proper buffer conductivity. 4. Lengthy tranfer times are not recommended. Do not leave this instr ument unattached. Joule heat can be generated rapidly during semi-dry blotting. Transferring longer than 2 hours can damage the unit. 5. Power supply requirements. The Trans-Blot SD cell should only be u sed with the microprocessor-controlled Model 200/2.0 power supply or the Model 1000/500 power supply. 6. Do not operate this instrument in ambient temperatures exceeding 5 0 ℃.