饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法
《饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法》河南省地方标准编制说明
一、编制的目的和意义
氨基酸是羧酸碳原子上的氢原子被氨基取代后的化合物，氨基酸分子中含有基和氨羧基两种官能团。与羟基酸类似，其可按照氨基连在碳链上的不同位置而分为α-，β-，γ-...w-氨基酸，但经蛋白质水解后得到的氨基酸都是α-氨基，它们是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，是维持动物生长所必需的营养物质，其种类和含量是评价饲料蛋白质营养价值的根本指标，测定饲料中的氨基酸具有非常重要的意义。
随着畜牧养殖业的迅猛发展，对饲料营养成分分析也提出了更高的要求。饲料分析已从比较单一的高含量营养成分，如蛋白质、脂肪等的总量分析，深入到比较复杂的微量营养素，如多种氨基酸、维生素、微量元素及饲料中的有害物质等分析。目前，饲料产品国标中氨基酸的测定采用的是离子交换柱后茚三酮衍生色谱法。但众所周知，该方法使用的氨基酸自动分析仪价格昂贵（约70万左右），专属性强，只能分析氨基酸，且分析速度慢。而采用高效液相色谱法测定氨基酸，具有价格便宜，分析速度快、灵敏度高、操作简
便的特点，其次，目前很多实验室都配置了高效液相色谱仪，其价格易于接受（约10万左右），而且它的分析范围很广，可测定饲料中的氨基酸、维生素、碳水化合物、脂肪酸、有机酸、添加剂(风味剂、防腐剂等)和有害物质(如黄曲霉素、棉酚和农药残留等)，因而实现了一机多用的可能。相比于目前国标方法GB/T 18246-2000《饲料中氨基酸的测定》规定的氨基酸分析方法，高效液相则具有较好的通用性，应用范围广且市场占有率高，利于推广。随着高效液相色谱技术的日趋成熟和普及，高效液相色谱法必将成为各检测机构测定氨基酸含量的主要方法。
二、任务来源及编制原则和依据
2.1 任务来源
根据河南省质量技术监督局文件《河南省质量技术监督局关于下达2017年第四批河南省地方标准制修订计划的通知》豫质监标发〔2017〕355号的要求，由河南海瑞正检测技术有限公司负责对项目编号为20174210667的河南省地方标准《饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法》的起草、制定工作。
2.2 编制原则
本标准编制符合国家法律、法规和政策，本着严格遵循“规范性、实用性、统一性、协调性、完整性”的原则，开
展了本次研究工作，填补检测方法单一的空白，并注重标准的可操作性。
2.3 编制依据
本标准在编制过程中参照的主要标准及依据如下：
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 10648 饲料标签
GB/T 14699.1 饲料采样
GB/T 18246-2000 饲料中氨基酸的测定
GB 19489 实验室生物安全通用要求
三、编制过程
2017年11月9日,收到河南省质量技术监督局下达的标准制修订通知，本标准被列入2017年第四批河南省地方标准制修订计划。
收到制定计划后，作为项目主持单位，河南海瑞正检测技术有限公司成立了标准起草小组。小组成员经充分讨论和酝酿，制订了实施方案，就起草工作进行调研、汇总、分析、试验验证、制定标准框架、起草标准进度等内容，进行了明确的分工。
2017年12月标准起草小组相关人员就着手收集了饲料中氨基酸的测定的标准、书籍资料等，并分门别类整理出了有关方面的研究论文、技术文献资料。根据标准制定相关要
求，考虑与现行国家标准的一致性原则，重点研究国内外有关饲料中氨基酸检测的标准体系。
2018年1月～3月，标准编写小组编写制定整理出了标准编写所需的资料，为起草标准作出了多方面的准备。与此同时，实验室相关人员按计划进行了大量试验验证工作。
2018年4月，标准编写小组对有关文献资料进行了梳理总结，同时召开了标准起草小组会议，对编写提纲进行了讨论，标准编制严格按照《标准化工作导则》（GB/T 1.1）关于标准的结构和编写规定等要求进行，初步确定了标准框架。
根据试验资料和所有参与试验人员意见，在科学分析的基础上，组织有关专家规定了适用范围、规范性引用文件、方法原理、设备材料、测定步骤、结果的表述、试验结果的判定等，起草了标准草案。
2018年5月，标准起草单位将标准草案送至饲料中氨基酸检测的有关专家学者征求意见，编制出了《河南省地方标准征求意见汇总表》。
2018年6月，标准起草小组根据征求专家学者反馈的指导意见，对标准草案的每一组数据、每一句表述进行了认真而全面的补充、调整和完善，并经多次小组讨论最终形成《饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法》征求意见稿并完成上报工作。
主要起草人及其任务分工：
项目主持人：兰尊海，河南海瑞正检测技术有限公司，主持本项地方标准的制定与编写。
主要起草人：
兰尊海：河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制定和技术推广。
单慧燕：河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制定和应用。
易善平：河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制校订和应用。
薛宁：河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制定。
许亚楠：河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的校订和应用。
李培娜：河南海瑞正检测技术有限公司，负责此标准方法的应用。
孙世雯：河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准校订和应用。
四、主要内容的确定
（一）与国标方法GB/T 18246-2000 《饲料中氨基酸的测定》的对比：
1.出峰时间进行比较
根据标准要求，用高效液相色谱法和国标方法GB/T 18246-2000 《饲料中氨基酸的测定》，对氨基酸样品进行分析，出峰时间如图1、图2所示，氨基酸分析仪出峰完全在110 min左右，而高效液相色谱法的出峰时间在36 min 左右，大大节省了检测时间，提高了工作效率。
图1 氨基酸自动分析仪-氨基酸色谱图
图2 高效液相色谱法-17种氨基酸色谱图
2.结果准确性进行比较
选用浓缩料和脱脂鱼粉两类饲料样品，分别进行本方法和国标方法GB/T 18246-2000《饲料中氨基酸的测定》，两种方法进行比对，结果从表1可以看出，两组数据的相对偏差分别为0.50%、0.28%，远远小于标准要求4.0% 的相对偏
差，说明高效液相测定氨基酸结果准确可靠，方法可行。
表1 两种方法氨基酸的测定结果
组分名称本标准 GB/T 18246 本标准 GB/T 18246 浓缩料脱脂鱼粉
天门冬氨酸（asp） 3.28 3.19 6.30 6.22 谷氨酸（glu） 5.49 5.46 9.70 9.84 丝氨酸（ser） 1.37 1.36 2.68 2.84 精氨酸（arg） 2.23 2.20 4.20 4.30 甘氨酸（gly） 1.24 1.20 4.55 4.52 苏氨酸（thr） 1.08 1.07 2.99 3.01 脯氨酸（pro） 1.37 1.34 3.02 2.90 丙氨酸（ala） 1.25 1.20 4.45 4.37 缬氨酸（val） 1.35 1.35 3.60 3.45 蛋氨酸（met）0.57 0.56 2.15 2.09 胱氨酸（cys）0.26 0.26 0.53 0.50
异亮氨酸（ile） 1.25 1.31 3.14 3.06 亮氨酸（leu） 2.19 2.16 5.53 5.34
苯丙氨酸（phe） 1.45 1.44 2.92 2.87 组氨酸（his）0.87 0.87 1.85 1.87 赖氨酸（lys） 1.86 1.86 5.80 5.82 酪氨酸（tyr）0.89 0.88 2.24 2.30
氨基酸总和27.99 27.71 65.67 65.30 相对偏差（%）0.50 0.28
（二）高效液相色谱法实验条件的优化：
1.样品前处理优化条件
酸解剂用量的优化：分别取酸解剂5 mL、10 mL、15 mL，由表2实验结果表明酸解剂为5 mL时，结果较低，说明水解不完全，在酸解剂用量为10 mL和15 mL时，结果一致，说明水解完全，本着节约的原则，为减少浪费，10 mL为最佳酸解剂的用量。
组分名称
酸解剂（mL)
5 10 15
天门冬氨酸（asp） 5.96 6.28 6.28
谷氨酸（glu）8.98 9.63 9.57
丝氨酸（ser） 2.09 2.32 2.38
精氨酸（arg） 3.84 4.10 4.05
甘氨酸（gly） 4.34 4.62 4.63
苏氨酸（thr） 2.76 2.96 2.98
脯氨酸（pro） 2.89 3.10 3.09
丙氨酸（ala） 4.24 4.56 4.52
缬氨酸（val） 3.45 3.68 3.67
蛋氨酸（met） 2.02 2.22 2.22
胱氨酸（cys）0.46 0.52 0.53
异亮氨酸（ile） 2.92 3.09 3.05
亮氨酸（leu） 5.08 5.45 5.44
苯丙氨酸（phe） 2.72 2.76 2.76
组氨酸（his） 1.63 1.74 1.68
赖氨酸（lys） 5.40 5.74 5.71
酪氨酸（tyr） 2.06 2.19 2.15
氨基酸总和60.84 64.94 64.71
2.衍生温度的优化:
将衍生温度设置为50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃五个梯度，其余参数同标准要求，结果如表3所示，衍生温度在50 ℃到60 ℃时，结果处于上升趋势，在60 ℃到65 ℃时，结果稳定，在70 ℃时，结果明显偏高，由此说明，温度低于60 ℃时，衍生不完全，结果偏低；温度高于65 ℃时，衍生试剂里的有机试剂易挥发，导致结果偏高。综合考虑，衍生温度选定在60 ℃时较为合适。
组分名称
衍生温度（℃)
50 55 60 65 70
天门冬氨酸（asp） 5.50 5.99 6.29 6.27 6.63 谷氨酸（glu）8.82 9.27 9.66 9.59 9.84 丝氨酸（ser） 2.23 2.29 2.32 2.26 2.30 精氨酸（arg） 3.85 4.04 4.09 4.08 4.16 甘氨酸（gly） 4.34 4.49 4.61 4.58 4.82 苏氨酸（thr） 2.83 2.96 2.98 2.95 3.15 脯氨酸（pro） 2.93 2.99 3.09 3.08 3.21 丙氨酸（ala） 4.25 4.39 4.55 4.53 4.73 缬氨酸（val） 3.45 3.53 3.66 3.64 3.76 蛋氨酸（met） 2.11 2.12 2.23 2.26 2.33 胱氨酸（cys）0.48 0.50 0.54 0.54 0.55
异亮氨酸（ile） 2.92 2.96 3.09 3.08 3.23 亮氨酸（leu） 5.16 5.25 5.44 5.43 5.65
苯丙氨酸（phe） 2.51 2.73 2.75 2.75 2.88 组氨酸（his） 1.49 1.65 1.74 1.77 1.87 赖氨酸（lys） 5.37 5.56 5.75 5.73 5.92 酪氨酸（tyr） 1.98 1.98 2.18 2.17 2.27
氨基酸总和60.19 62.69 64.97 64.69 67.30 3.衍生时间的优化
将衍生时间设置为：20 min、25 min、30 min、35 min，结果如表4数据可以看出，衍生时间由20 min到30 min时，结果呈上升趋势，表明衍生时间低于30 min时，衍生不完全，实验结果偏低；衍生时间为30 min和35 min时，结果相同，说明在30 min时样品已经衍生完全，本着提高效率、节约资源的原则，确定30 min为最佳衍生时间。
组分名称
衍生时间（min)
20 25 30 35
天门冬氨酸（asp） 5.62 6.02 6.29 6.30
谷氨酸（glu）8.81 9.22 9.64 9.67
丝氨酸（ser） 2.10 2.32 2.37 2.35
精氨酸（arg） 3.79 3.92 4.12 4.15
甘氨酸（gly） 4.33 4.45 4.70 4.67
苏氨酸（thr） 2.77 2.93 2.98 3.02
脯氨酸（pro） 2.89 2.96 3.13 3.13
丙氨酸（ala） 4.21 4.33 4.56 4.57
缬氨酸（val） 3.43 3.52 3.68 3.62
蛋氨酸（met） 2.06 2.11 2.22 2.26
胱氨酸（cys）0.51 0.54 0.56 0.53
异亮氨酸（ile） 2.89 2.95 3.14 3.11
亮氨酸（leu） 5.10 5.20 5.53 5.49
苯丙氨酸（phe） 2.55 2.64 2.77 2.77
组氨酸（his） 1.37 1.56 1.68 1.73
赖氨酸（lys） 5.37 5.49 5.78 5.73
酪氨酸（tyr） 2.03 2.08 2.22 2.22 氨基酸总和59.81 62.23 65.38 65.31
4.方法精密度实验
取试样溶液一份，按照本标准要求的色谱条件重复进样6次，结果如表5所示,氨基酸各组分的相对标准偏差在0.63%～2.28%之间，实验结果表明：该方法测定氨基酸有较好的重复性。
组分名称
测定次数
RSD(%) 1 2 3 4 5 6
天门冬氨酸（asp）6.47 6.43 6.31 6.37 6.25 6.38 1.26 谷氨酸（glu）9.74 9.71 9.67 9.68 9.44 9.68 1.13 丝氨酸（ser） 2.23 2.25 2.23 2.26 2.23 2.28 0.95 精氨酸（arg） 4.24 4.15 4.25 4.18 4.14 4.24 1.15 甘氨酸（gly） 4.74 4.65 4.65 4.57 4.53 4.63 1.54 苏氨酸（thr） 2.93 2.94 2.93 2.86 2.95 2.92 1.02 脯氨酸（pro） 3.15 3.10 3.08 3.04 2.97 3.02 2.04 丙氨酸（ala） 4.63 4.55 4.52 4.47 4.37 4.45 1.99 缬氨酸（val） 3.82 3.68 3.68 3.64 3.56 3.68 2.28 蛋氨酸（met） 2.24 2.22 2.22 2.24 2.21 2.25 0.83 胱氨酸（cys）0.56 0.55 0.54 0.55 0.54 0.56 1.41 异亮氨酸（ile） 3.22 3.22 3.23 3.19 3.19 3.24 0.63 亮氨酸（leu） 5.63 5.57 5.59 5.51 5.44 5.58 1.22 苯丙氨酸（phe） 2.96 2.98 2.99 2.94 2.88 2.98 1.44 组氨酸（his） 1.84 1.85 1.87 1.88 1.77 1.86 2.13 赖氨酸（lys） 2.90 2.88 5.84 5.78 5.73 5.84 1.09 酪氨酸（tyr） 2.07 2.02 2.06 2.01 2.01 2.03 1.18 氨基酸总和66.34 65.73 65.65 65.16 65.63 65.45 1.10
五、与有关的法律、法规和强制性国家标准的关系
本标准为新制订的地方标准，在标准的制订过程中严格贯彻国家有关方针政策、法律法规，以符合国家相关规范性文件为前提，在法规许可范围内提出科学合理的检测要求，与现行的国家相关法律、法规无冲突和不一致之处，遵循了政策性和协调同一性的原则。
六、标准实施的建议
该项技术标准的制定，试验数据充分、科学性强，可作
为河南省推荐性地方标准在饲料中氨基酸的测定工作中进一步推广应用。由于本标准为首次制定，建议全省的检测机构和企业能深入理解和熟练运用该标准，同时加大标准宣贯力度，建议作为推荐性地方标准发布实施。
高效液相色谱法测定氨基酸
脑蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案 1、仪器与试药 1.1 仪器 1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters1525型泵，Waters2487型检测器，Waters5CH 型柱温箱，WatersBREEZE数据处理软件，水浴恒温器（精度±0.1℃），旋涡器，微量移液器，衍生专用管；CP225D型分析天平（德国）；4umNora-Pak TM C18（3.9mm×150mm，5μm）色谱柱（美国） 1.2 药品与试剂 16种氨基酸（门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）由中国药品生物制品检定所提供。 脑蛋白水解物注射液，云南盟生药业有限公司生产，规格10ml/支。批号：2013、2013、2013. 乙腈（HPLC级）；EDTA（分析纯）；磷酸（分析纯）；二乙胺（分析纯）；三水合乙酸钠（分析纯）。2、方法与结果 2.1色谱条件流动相A为AccQTag醋酸—磷酸盐缓冲液；由AccQTagEluent A浓缩制备AccQTag洗脱液,用前稀释10倍（或按以下方法配制：称19.04g三水合乙酸钠，加1000ml纯化水，搅拌，溶解，用50%H3PO4将pH调至5.2，加入1ml 1mg/ml的EDTA溶液，加入2.37ml二乙胺，用50%H3PO4滴定至pH4.95，用水溶性过滤器过滤，超声，脱气，备用。）；流动相B为60% HPLC级乙腈，按梯度表梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；进样量5μl；柱温38℃。
时间 (min) 流速 (ml/min) % A % B 曲线 起始 1.0 100 0 * 0.5 1.0 98 2 6 15.0 1.0 93 7 6 19.0 1.0 90 10 6 32.0 1.0 65 35 6 33.0 1.0 65 35 6 34.0 1.0 0 100 6 37.0 1.0 0 100 6 38.0 1.0 100 0 6 42.0 1.0 100 0 6 2.2对照品溶液、供试品溶液的制备分别精密称取16种氨基酸标准品，用纯化水配制成浓度如下表 所示的混合溶液。 名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）门冬氨酸 4.80 苏氨酸 1.20 异亮氨酸 1.10 丝氨酸 2.60 丙氨酸 2.50 亮氨酸 2.70 谷氨酸 6.20 脯氨酸 2.00 苯丙氨酸 1.20 甘氨酸 2.40 缬氨酸 1.60 色氨酸0.40 组氨酸0.90 甲硫氨酸 1.00 精氨酸 1.20 赖氨酸 3.45 取上述溶液0.1ml，加纯化水0.9ml，旋涡器混匀，作为对照品溶液；取脑蛋白水解物注射液，加水稀释成含总氮为1mg/ml的溶液，取0.1ml，加纯化水0.9ml,旋涡器混匀，作为供试品溶液。 衍生剂配制将水浴锅设置55℃，加热，待温度稳定, 取AccQFluor衍生剂2A，轻轻弹击,确保AccQFluor 衍生剂2A粉末全落在瓶底，吸取AccQFluor衍生稀释剂2B 1ml并放掉，清洗移液器管，再吸取AccQFluor 衍生稀释剂2B 1ml，加入AccQFluor衍生剂2A的瓶中，振荡10秒钟，在恒温水浴锅中溶解，保持10分钟。于干燥器中室温保存一周,于干燥器中4℃保存二周。 2.3测定方法分别取20ul对照品溶液和供试品溶液加入衍生专用管底部，加入60uLAccQFluor硼酸
高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯
实验七高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯 一.实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二.实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t (R2)-t (R1) ] /1.7*(W 1 ＋W 2 ) 式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t (R1) 为相邻两峰中前一峰的保留 时间； W 1及W 2 为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。 表1色谱柱测试条件 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水 四.实验步骤 1、色谱条件 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8） 柱温：室温 流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％ 检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm； 进样体积：100μl定量环，实际注射每次可控制在200μl。 2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。 五.实验结果
氨基酸概况-主要供应商
氨基酸工业现状及趋势 世界上最大的氨基酸消费市场是饲料添加剂，氨基酸作为饲料添加剂主要有4 个方面的功效：①促进动物生长发育；②改善肉质，提高产量；③节省蛋白饲料，提高饲料转化率； ④降低成本，提高饲料利用率。目前国内用于饲料添加剂的氨基酸主要有赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸。其中赖氨酸和蛋氨酸占饲料工业的95% 以上，而苏氨酸的使用呈增长趋势，需求的增长促进了产量和产能的提高。表1 为近10 年来，世界三种氨基酸产量及主要生产商。 表1 近10年来世界三种氨基酸产量及主要生产商 品名1996年1999年2002年2006年主要生产商 DL-蛋氨酸35 50 55 65 德固萨、住友、诺伟司、安迪苏 L-赖氨酸30 60 65 80 味之素、ADM、巴斯夫、大成、德固萨、协和、希杰L-苏氨酸 2.5 3 4 12 味之素、ADM、德固萨、协和 1、蛋氨酸 近年来，国内外市场对蛋氨酸的需求逐年强劲增长，成为需求增长最快的氨基酸品种之一。1993年，全世界蛋氨酸产量为26万t，1999年达50万t，2002年为55万t。目前，全球的年产能约为100万t，年产量约为70万t。预计全球总产能会达到110万t/年左右，但产量不会超过70万t，市场仍将明显供过于求。蛋氨酸的生产主要集中在安迪苏、德固赛和诺伟司，约占世界产量的90%，其中诺伟司的产能最大。 1.1中国市场概况 在中国市场，每年都要从国外大量进口蛋氨酸，现已成为中国化学原料药进口的大宗产品，2003年进口量高达7万t，进口额过1亿美元。据专家预测，到2010年，全世界蛋氨酸需求将达到90万t，中国的需求量也将超过10万t。近年中国对蛋氨酸的需求量还将持续增长，但一定时期内依靠大量进口来满足。中国是世界第2大饲料生产国，市场需求的年增长率7%-8%，蛋氨酸基本依靠进口。在中国市场，日本公司占据了43%份额、德固赛为21%、诺伟司10%、安迪苏为21%，其他占5%。由于中国蛋氨酸市场快速扩张且竞争日趋激烈，国外蛋氨酸生产厂商均加大了在中国的销售力度。 目前，中国生产蛋氨酸在工艺技术、原料、设备、成本等方面还存在一些有待解决的问题，但火爆的市场已对企业产生了巨大的诱惑，已有企业着手蛋氨酸规模生产的研发、设计和规划。 据了解，德固赛并未忽视蛋氨酸医药保健用途的开发。2004年12月德固赛在广西南宁武鸣投资的安力泰美诗药业公司的L-(左旋)蛋氨酸新生产线正式建成投产。本次新建的这条
高效液相色谱方法的验证
高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法
方法验证的目的 目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。 方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。
方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性
准确度 定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定 原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收 杂质定量 测定：加样回收（n 3 9） 杂质对照品 方法比对 回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%） C:试验测定值
精密度 定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性 测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。 同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。
专属性 定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定 杂质测定 测定： 限量检查 空白制剂，模拟复方 加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查
氨基酸测定方法
4.1 光度分析法[5] [6] β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质[7]，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH 值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。 4.1.1试剂的配制： 缓冲液的配制：配制pH= 6.00的NaAc －HAc 缓冲溶液 β-氨基丙酸标准溶液的配制： 用电子天平准确称取1.020 g β-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=6.00缓冲溶液中，得到C = 4.080 g/L 标准溶液。 茚三酮试剂的配制：称取0.5g 茚三酮溶于100ml 蒸馏水中，得到5g/L 的茚三酮水溶液。 4.1.2标准曲线的确定 分别准确移取0.30ml 、0.40ml 、0.50ml 、0.60ml 、0.70ml 、0.80ml 、0.90ml 、1.00ml 标准液于8个比色管中，用pH=6.00的缓冲溶液稀释到5.00ml 再加入1ml 茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min 。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm 下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。 4.1.3样品的测定 稀释待测液于0.24mg/ml —0.73mg/ml,调pH 值到6.00，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。 4.1.4 标准曲线的测定结果 β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml —0.73mg/ml 范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1： 0.20.30.40.50.60.70.80.9 1.0 1.1 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 吸光度加入标液体积(ml) B 图 1 标准曲线的测定 Fig 1 Determination of the standard curve 注：在沸水中加热10min ，β-氨基丙酸标准溶液5ml 、茚三酮水溶液1ml 、缓冲溶液pH=6.00 4.1.5样品的测定分析 将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的
饲料中可利用氨基酸研究进展
第4期401～409 JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSITY 季刊 2饲料中可利用氨基酸研究进展 刘超，闵育娜，雷海宁，白存江，段建功 （西北农林科技大学畜牧兽医研究院，咸阳窖店 712039） 摘要：综述了可利用氨基酸在饲料中的研究进展，对部分研究成果进行了评述。认为氨基酸可利用率的测定方法应从生产现场进行选择，畜禽可利用氨基酸需要量研究应成为研究重点，并对可利用氨基酸在日粮中的应用前景进行了展望。 关键词：饲料；可利用氨基酸；研究进展 中图分类号：S 816.11 文献标识码：A文章编号：1003-4315(2002)04-0401-09 1 氨基酸营养研究的理论基础 以蛋白质配制日粮并评定营养价值，是由于蛋白质是次于能量的重要营养物质，构成动物体蛋白质必需的氮元素与植物体相差的百分率最大（70.0 %）[1]；部分饲料成本，蛋白质饲料约占四分之一。因此，蛋白质资源利用和低蛋白质日粮的研究，是以提高蛋白质的生物学价值为目的。对氨基酸营养的认识，使人们明白蛋白质营养价值变化的基本原因。蛋白质不是整体消化，而是被分解成小肽或氨基酸吸收利用。使用纯合日粮或低蛋白质平衡氨基酸日粮并不能使动物达到最佳生产性能[2~4]，肽在蛋白质营养中有着特殊的意义[5，6]。蛋白质生物学价值不具备可加性，在实践上难以依次配制日粮[7]。由于不同氨基酸蛋白质配合后的互补作用，以及添加限制性氨基酸可使日粮其它氨基酸平衡性得到改变的事实，说明蛋白质生物学价值不具备理想的重现性，只能在特定的如基础日粮为无氮日粮时才能重现[8]。氨基酸可利用率的可加性、重现性，因能在日粮或非常规饲料评价中成功表达受到学者认同[9]，是蛋白质营养走向氨基酸营养的重要原因。 氨基酸从19世纪末Magendie发现到结构测定（Fischer）及willcock等人的添加试验，已认识到蛋白质营养价值受氨基酸组成的影响。Rose通过试验将氨基酸划分为必需和非必需。Block和Bolling注意到营养价值高的蛋白质在氨基酸组成上与采食该种蛋白质动物体蛋白氨基酸构成基本相似，由此提出了生长动物氨基酸需要量大体可由体蛋白氨基酸组成来确定的“理想蛋白质”新理论。Mettchell建议以体组织中赖氨酸与其它氨基酸的比例关系估测其需要量，由此赋予“理想蛋白质”以实质性内容，表示日粮中最佳氨基酸组成模 作者简介：刘超（1963–），男，陕西兴平人，副研究员，从事动物营养研究。 资助基金：陕西省重大产业科技示范资助项目（编号：96ST07） 收稿日期：2002–02–20 修改稿日期：2002–05–20
高效液相色谱法测定有机化合物的含量
实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。 液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。 反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置 待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作 （1）样品与流动相的处理 配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。 水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。 （2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液 流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。 如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液 洗液一般为：50%的甲醇。
高效液相色谱法测定甲硝唑的含量
实验二高效液相色谱法测定甲硝唑的含 量 一、实验目的 1.熟悉高效液相色谱仪主要结构组成及功能。 2.了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3.了解流动相的选择依据及配制方法。 4.掌握高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方法。 二、实验原理 高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。本实验以甲硝唑为测定对象，以反相HPLC来分离检测未知样中甲硝唑的含量。以甲硝唑标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度进行线性回归，再根据样品中甲硝唑的峰面积，由线性方程计算其浓度。 三、实验内容 （一）实验仪器与材料 1.实验仪器：高效液相色谱仪、精密天平、50mL烧杯、玻璃棒、称量纸、10mL容量瓶、50mL 容量瓶、注射器、洗瓶。 2.实验材料：甲硝唑原料、蒸馏水、HCl（0.1mol/L）、乙腈、三氟乙酸、超纯水。 （二）实验内容 1、色谱操作条件的制定： 色谱柱：C18柱（250×4.6mm,5μm）； 流动相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80） 流速：1mL/min 检测波长：277nm 柱温：35℃ 进样量：20μL 2、标准溶液配制 精密称取在105℃条件下干燥至恒重的甲硝唑对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解并定容至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的甲硝唑标准储备液，备用。 3、标准曲线的建立 （1）精密量取甲硝唑标准储备液分别为0.3mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL置于10 mL的容量瓶中，然后用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，得到浓度梯度为6μg/mL、10μg/mL、14μg/mL、18μg/mL和22μg/mL的标准溶液，分别过0.22μm的微孔滤膜过滤，滤
高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证
高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证作者：张建芝冯顺 来源：《维吾尔医药》2013年第07期 摘要：目的：确证用反相高效液相色谱法测定头孢氨苄含量的方法有效性和准确性。方法：以Diamonsil CLC-ODS（150mm x 6mm，10 lm）为色谱柱，水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液- 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相，检测波长为254 nm，外标法定量。结果：头孢氨苄浓度线性范围为0.02～0.20mg / ml，相关系数r= 0.9991，方法重复性试验 RSD为 1.42%。结论：该方法可简单高效地完成，结果准确性好、稳定可靠，确证高效液相色谱依然为头孢氨苄制剂的质量控制中有效可靠的方法。 关键词：头孢氨苄高效液相色谱法 头孢氨芐（Cefalexin，又译先锋霉素Ⅳ、头孢力新等）是一种半合成的第一代口服头孢霉素类类抗生素药物，化学名（6R，7R）-3-甲基-7-[（R）-2-氨基-2-苯乙酰氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，化学式C16H17N3O4S，在临床上广为使用。其含量测定在旧版的中国药典（ 1995年版）采用碘量法○1。但此法不仅操作步骤繁多，费工费时，干扰因素多；然后人们发明采用高效液相色谱法内标法测定的方法，但内标物保留时间过长，依然存在问题。最后人们又发现采用高效液相色谱法，用外标法测定其含量，方法操作简单方便、数据准确可靠，灵敏度较高，重复性好，最终获得了较为满意的结果○2。现在本文对这个方法进行确证，以确定该方法的有效性和准确性。 1.仪器与试药 分析天平（precisa instrument ltd switzer land xs 225a precisa ），高效液相色谱柱（diamonsic C18 250 * 46mm），检测器（UVD 170v），泵（P680 HPLC pump），头孢氨苄胶囊（广州白云山制药总厂批号：2110102） 2. 色谱条件 用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂：水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液 - 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相；检测波长为254nm；理论塔板数按头孢氨苄峰计算不低于1500。 3. 实验试剂制备 3.1 对照品储备液的制备：对照品储备液的制备：取头孢氨苄对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，为对照品储备液。 3.2 供试品溶液的制备：去装量差异项下的内容物，混合均匀，精密量取适量（约相当于头孢氨苄0.1g），置于 100ml 容量瓶里，加流动相适量，充分振摇使溶解，再加流动相稀释至
饲料中的氨基酸分析
饲料中的氨基酸分析 一. 仪器及试剂 仪器： 1). 天平一台（精度0.1mg）； 2). 恒温水浴锅一台； 3). 容量瓶； 4). 试管（1.5×15cm或1.5×10cm）； 5). 微量进样器（5μL或10μL）一支； 6). 微量可调移液枪（1000uμL，200μL）一支、吸头多个； 7). 旋涡混匀器一台； 8). HPLC系统及氨基酸分析专用柱（4.6×250mm 5μm）； 试剂： 1). 超纯水（≥18MΩ?cm）； 2). 乙腈（HPLC级）； 3). 三水合醋酸钠（分析纯）； 4). 冰醋酸（分析纯）； 5). 衍生试剂A和衍生试剂B溶液，至于冰箱保存（衍生试剂包对身体有害，用 时请做好防护措施）； 6). 正己烷（HPLC级）。 7). 0.1mol/L盐酸溶液：精密量取9.0mL浓盐酸，加去离子水稀释至1000mL。 8）6mol/L盐酸溶液:精密量取浓盐酸溶液，加到去离子纯化水以等比例混合，（再加入0.1%的苯酚试剂作为保护剂）。 二. 流动相的配制 流动相A：0.1mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）：乙睛＝93.0：7.0 配制方法：准确称取三水合醋酸钠13.6g于1000mL水中，搅拌均匀，使之溶解，用冰醋酸或氢氧化钠溶液调pH值至6.50；准确量取配制好的三水合醋酸钠溶液 930mL和乙腈70mL，混合均匀，抽滤过0.22μm滤膜；
流动相B：水：乙腈＝20.0：80.0 配制方法：准确量取水200mL和乙腈800mL，混合均匀，抽滤过0.22μm滤膜； 三. 衍生化反应 1. 2. 供试品溶液制备 精密称取饲料粉末样品100mg，置于50ml的圆底烧瓶中，加入10ml的6mol/L盐酸溶液，溶解，并在110度条件下加热回流反应24小时，反应完成后，放置冷却；冷却完后转移至100ml的量瓶中，加水分别3次润洗反应瓶，收集到量瓶中定容至100ml；充分混匀，再量取50ml的溶液蒸干，并用2ml水润洗定容，待衍生用。 3. 衍生步骤 1）分别将A、B两种衍生试剂用稀释剂稀释至原来浓度的1/5倍； 2）精密量取上述对照品溶液200μL，置于试管中，加入稀释后的A溶液100μL和稀释后的B 溶液100μL，摇匀，室温反应60min；然后加入正己烷溶液400μL旋紧盖子后振摇5~10s，室温静置分层，取下层200μL溶液，加入800μL水混合均匀，再取200μL加入800μL 水混合均匀，用孔径为0.22μm有机膜过滤，待分析； 3）供试品的衍生：供试品溶液200μL，置于试管中，加入稀释后的A溶液100μL和稀释后的B溶液100μL，摇匀，室温反应60min；然后加入正己烷溶液400μL旋紧盖子后振摇5~10s，室温静置分层，取下层200μL溶液，加入800μL水混合均匀，再取200μL加入800μL水混合均匀，用孔径为0.22μm有机膜过滤，待分析；
高效液相色谱法测定手册
高效液相色谱法测定手册 一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。 二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。 三责任者：品控部。 四正文 1 简述 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
饲料中氨基酸含量
中国饲料成分及营养价值表（第24版） TABLES OF FEED COMPOSITION AND NUTRITIVE VALUES IN CHINA 表3. 饲料中氨基酸含量 Amino Acids 序号 中国饲料号CFN 饲料名称 Feed Name 干物质DM% 粗蛋白质 CP% 精氨酸Arg% 组氨酸His% 异亮氨酸Ile% 亮氨酸 Leu% 赖氨酸Lys% 蛋氨酸Met% 胱氨酸Cys% 苯丙氨酸Phe% 酪氨酸Tyr% 苏氨酸Thr% 色氨酸 Trp% 缬氨酸 Val% 1 4-07-0278 玉米corn grain 86.09.40.380.230.26 1.03 0.260.190.220.430.340.310.08 0.40 2 4-07-0288 玉米corn grain 86.08.50.500.290.270.74 0.360.150.180.370.280.300.08 0.46 3 4-07-0279 玉米corn grain 86.08.70.390.210.250.93 0.240.180.200.410.330.300.07 0.38 4 4-07-0280 玉米corn grain 86.0 7.8 0.370.20 0.24 0.93 0.230.150.150.380.310.290.06 0.35 5 4-07-0272 高粱sorghum grain 86.0 9.0 0.33 0.18 0.35 1.08 0.180.170.120.450.320.260.08 0.44 6 4-07-0270 小麦wheat grain 88.0 13.4 0.62 0.300.46 0.89 0.35 0.21 0.30 0.61 0.370.38 0.15 0.56 7 4-07-0274 大麦（裸）naked barley grain 87.0 13.0 0.64 0.16 0.43 0.87 0.440.14 0.25 0.68 0.40 0.43 0.16 0.63 8 4-07-0277 大麦（皮）barley grain 87.0 11.0 0.65 0.24 0.52 0.91 0.42 0.18 0.18 0.59 0.350.41 0.12 0.64 9 4-07-0281 黑麦rye 88.0 9.500.48 0.22 0.30 0.58 0.350.150.21 0.42 0.26 0.31 0.10 0.43 10 4-07-0273 稻谷paddy 86.07.8 0.57 0.15 0.32 0.58 0.290.190.160.40 0.37 0.25 0.10 0.47 11 4-07-0276 糙米rough rice 87.0 8.8 0.65 0.170.30 0.61 0.320.20 0.14 0.35 0.31 0.28 0.12 0.49 12 4-07-0275 碎米broken rice 88.010.4 0.78 0.27 0.39 0.74 0.42 0.22 0.17 0.49 0.390.38 0.12 0.57 13 4-07-0479 粟（谷子）millet grain 86.5 9.7 0.30 0.20 0.36 1.15 0.15 0.25 0.20 0.49 0.26 0.35 0.17 0.42 14 4-04-0067 木薯干cassava tuber flake 87.0 2.5 0.40 0.05 0.11 0.15 0.13 0.05 0.04 0.10 0.04 0.10 0.03 0.13 15 4-04-0068 甘薯干sweet potato tuber flake 87.0 4.0 0.16 0.08 0.17 0.26 0.160.06 0.08 0.19 0.130.180.05 0.27 16 4-08-0104 次粉wheat middling and reddog 88.0 15.4 0.86 0.41 0.55 1.06 0.59 0.23 0.37 0.66 0.46 0.50 0.21 0.72 17 4-08-0105 次粉wheat middling and reddog 87.013.60.850.330.480.98 0.520.160.330.630.450.500.18 0.68 18 4-08-0069 小麦麸wheat bran 87.015.7 1.000.410.510.96 0.630.230.320.620.430.500.25 0.71 19 4-08-0070 小麦麸wheat bran 87.014.30.880.370.460.88 0.560.220.310.570.340.450.18 0.65 20 4-08-0041 米糠rice bran 87.012.8 1.060.390.63 1.00 0.740.250.190.630.500.480.14 0.81 21 4-10-0025 米糠饼rice bran meal(exp.) 88.014.7 1.190.430.72 1.06 0.660.260.300.760.510.530.15 0.99 22 4-10-0018 米糠粕rice bran meal(sol.) 87.015.1 1.280.460.78 1.30 0.720.280.320.820.550.570.17 1.07 23 5-09-0127 大豆soybeans 87.0 35.5 2.57 0.59 1.28 2.72 2.20 0.56 0.70 1.42 0.64 1.41 0.45 1.50 CFIC 2013 24 动物科学数据分中心 CFIC 2013 24 动物科学数据分中心
高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因(含问题分析)
实验二 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因 一、目的要求 1、学习高效液相色谱仪的操作。 2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。 3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。 二、基本原理 咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%。可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式为： N N CH 3 H 3C O O N N CH 3 定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R 和峰面积A 后，可直接用t R 定性，用峰面积A 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。 三、仪器和试剂 1、Agilent 1100高效液相色谱仪。 2、色谱柱：Kromasil C18，5μ 150×4.6mm 。 3、流动相：30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超声波发生器脱气10min 。 4、 咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在110℃下烘干1h 。准确称取0.1000g 咖啡因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。标样浓度1000μg·mL -1。 5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。
高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯
高效液相色谱（HPLC ）法测定邻苯二甲酸酯 一、实验目的： 1. 了解高效液相色谱仪原理； 2. 学习高效液相色谱仪的基本操作方法； 3. 利用高效液相色谱仪测定邻苯二甲酸酯、邻苯二乙酸酯、邻苯二丁酸酯的峰图和含量。 二、实验原理： ① 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC ）是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱法有“四高一广”的特点：高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R ）的计算公式为： R ＝ 2[t (R2)-t (R1)] /1.7*(W 1＋W 2) //式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间；t (R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W 1 及W 2为此相邻两峰的半峰宽。 除另外有规定外，分离度应大于1.5。 ② 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE ，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。 但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。同时也有一定的致癌作用。 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC 分离检测。 三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul 微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用） ，高纯水，样品。 出峰次序 样品组成 1 邻苯二甲酸二甲酯（DMP ） 2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP) 3 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)
氨基酸含量测定
茚三酮比色测定氨基酸含量 一、实验原理 氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色或黄色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。生成的蓝紫色或黄色化合物颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长分别为570nm或350nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。 二、实验试剂 （1）1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2?H2O），搅拌过滤（作防腐剂）。滤液置冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。 （2）pH 8.04磷酸缓冲液： Ⅰ、准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。 Ⅱ、准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。 Ⅲ、取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。 （3）氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200μg/mL 氨基酸标准溶液。 三、实验方法及步骤 （1）标准曲线绘制 准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL （相当于0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为 4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于90℃水浴上加热至显色恒定为止（该加热过程至少需要25分钟），取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15min后，若生成蓝紫色化合物，在570nm波长下，以试剂空白为
高效液相色谱测定法标准操作规程
标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分
离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。