Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化和鉴定
研究简报文章编号:1000-2790(2002)19-1820-02
I型胶原蛋白的提取纯化和鉴定
王彦宏朱平冷南解慧
(第四军医大学西京医院临床免疫科陕西西安710033)
关键词:I型胶原蛋白;胃蛋白酶;关节炎
中图号:R593.22文献标识码:B
1材料和方法
1.1材料胃蛋白酶及I型胶原蛋白(C I)标准品购自美国Sigma公司.M r14.4~97.4>103低分子标准蛋白购自上海丽珠东风生化技术有限公司.CS-9000薄层扫描仪购自日本岛津公司.
1:Protein marker;2:C I(Sigma)2g L-1;3:C I(Sigma)1g
L-1;4:C I1g L-1;5:C I0.5g L-1;6:C I0.25g L-1; 7:0.125g L-1.
图1SDS-PAGE分析经DEAE-52纤维素柱层析纯化的C I
1.2方法新鲜牛软骨剥去骨膜在液氮冷冻下磨成粉称质量用10倍体积的4mol L-1盐酸胍-0.05mmol L-1
Tris-~Cl(p~7.5)混悬后于4 下搅拌24h12000g离心20min弃上清用0.5mmol L-1乙酸充分洗涤.沉淀用4倍的0.5mmol L-1乙酸(内含1g L-1胃蛋白酶)混悬 4 下搅拌48h20000g离心20min取上清然后用3mmol
L-1的NaCl沉淀过夜离心沉淀用0.1mmol L-1乙酸溶解此即为粗制之I型胶原蛋白(C I).DE52离子交换柱经
0.05mmol L-1Tris-~Cl-0.2mmol L-1NaCl(p~7.4)平衡后装入高度为20cm体积为120mL的交换柱内.缓缓加入经平衡液透析后之粗制C I在核酸蛋白检测仪检测下(7=280nm)调节流速约5mL min-1收集第1峰(C I)然后用3mmol L-1
收稿日期:2001-12-04;修回日期:2002-03-24
基金项目:国家新药基金资助项目(96-901-05-262)
通讯作者:朱平.Tel.(029)3375355Email.Zhuping https://www.360docs.net/doc/f0764937.html, 作者简介:王彦宏(1963-)男(汉族)陕西省扶风县人.主管技师. Tel.(029)3375360Email.cxyhfk https://www.360docs.net/doc/f0764937.html, NaCl4 下沉淀过夜离心取沉淀用0.5mmol L-1乙酸重溶解.透析此即为纯化后之C I.C I的鉴定:D采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电永(PAGE).选用50g L-1浓缩胶和120
g L-1分离胶样品分别为低分子标准蛋白(M r为97.4 66.
2 43.0 31.0 20.1和14.4>103)标准C I及不同批次的自产纯化C I.按常规电泳;@凝胶采用CS-9000薄层扫描仪扫描7=580nm.
2结果C I的SDS-PAGE的条带经与C I对照品(Sigma 公司产品)和标准分子蛋白的条带对照均一致(图1).SDS-
PAGE薄层扫描结果如图2.
图2薄层扫描分析SDS-PAGE凝胶
3讨论I型胶原是RA的一种自身抗原抗胶原抗体和胶原特异性T细胞在关节炎的发生和发展中起重要作用[1-3]口服同种属或异种属I型胶原均有抑制减轻动物模型关节炎和人类RA的作用[4 5]国外多采用鸡I型胶原鉴于牛软骨来源更丰富我们采用胃蛋白酶消化法从牛软骨提取C I
并经DEAE-52离子交换柱层析纯化SDS-PAGE和薄层扫描鉴定均表明获得与Sigma公司产品分子质量一致的C I
为临床应用提供了实验方法和便利条件.
参考文献:
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Gineyts E,Rosenguist C,Gvist P.collagen type I C-telopeptide fragments as an index of cartilage degradation[J].
Bone,Z OO1;Z9(3):Z O9-Z15.
编辑许福明
技术方法文章编号:1OOO-Z79O(Z OOZ)19-18Z1-O1
六节通络仪治疗原发性高血压46例
张青,傅卫红,沙建平,唱荣艳
(解放军第451医院惠宾病房,陕西西安71OO54)
关键词:传统医学;经络;高血压
中图号:R544.1文献标识码:A
0引言高血压是严重危害人类健康的疾病之一,药物治疗存在一定的副作用和局限性,因此,非药物治疗近年来受到较为普遍的重视,为探索有效的非药物治疗方法,我们采用六节通络仪对原发性高血压进行治疗,并进行对照研究.
1对象和方法
1.1对象符合1999年世界卫生组织和国际血压联盟(W~0/IS~)制定的高血压诊断及分级标准的门诊或住院原发性高血压患者86(男5O,女36)例,其中I级高血压4O例, I级高血压46例.全部患者经1Wk药物冲洗期后随机分为六节通络仪治疗组45例,年龄(6Z 8)岁;对照组41例,年龄(61 7)岁,两组年龄,性别,血压等特征无差异(P>O.O5). 1.Z方法治疗组采用秦原金纶医疗仪器厂生产的六节通络仪,根据循经取穴,正负交替的原则,选择手足阳明经穴,足太阳经穴及督脉,任脉穴为主腧穴,双侧同时治疗,每次1h,1次d-1,14d.对照组口服硝苯地平缓释片(成都药业有限责任公司生产)1O mg,Z次d-Z.两组治疗期间停用其他影响血压的药物,观察治疗前后血压,心率,并记录治疗反应及不良作用.测量血压前休息5min,由专人使用同一血压计测量右侧上肢肱动脉血压,连续测量3次,间隔Z min,取平均值.取疗程结束前3d记录结果平均值与治疗前作比较,按(舒张压+1/3脉压)求得平均动脉压(MBP).
疗效标准:显效-舒张压下降大于等于1.33kPa并降至正常或下降Z.67kPa以上;有效-舒张压下降小于1.33kPa 但降至正常或下降1.33~Z.66kPa;无效-未达上述标准.
统计学处理:血压测量结果用I s表示,组间t检验,有效率比较用X Z检验.
2结果治疗组和对照组治疗后收缩压~舒张压~平均动脉压均明显下降,心率改变不明显(表1).治疗组总有效率91.1%(41/45),显效率4Z.Z%(19/45),有效率48.9%(Z Z/ 45);对照组总有效率9Z.7%(38/41),显效率43.9%(18/ 41),有效率48.8%(Z O/41).两组有效率无差异(P>O.O5).六节通络仪治疗组治疗期间无不良反应,对照组不良反应为面色潮红3例,头痛Z例,心悸1例,对症处理后能耐受治疗.
表1两组治疗前后血压及心率的变化(kPa,I s)组别收缩压舒张压平均动脉压心率(次min-1)
治疗组(n=45)治疗前Z1.O9 Z.Z41Z.6O 1.4116.6O 1.6775.3 1O.5治疗后17.6O 1.39b1O.O9 O.75b11.88 1.O9b7O.5 8.Z b
对照组(n=41)治疗前Z O.83 Z.O81Z.69 1.O116.OO 1.4473.6 14.Z 治疗后17.5Z 1.Z7b1O.88 O.87b11.79 1.36b8O.4 7.5b
b P 3讨论高血压属中医学~头痛,~眩晕等范畴,其发病机制与肝阳上亢,肝肾阴虚,阴阳失衡密切相关[1].大量临床实践证明,针刺疗法对高血压有较好的疗效,针刺与高血压相关的经络,可产生经络本身所具有的传导感应,纠正阴阳失衡,偏盛偏衰所致的高血压病的虚实证候,达到补虚泄实,恢复人体阴阳平衡的作用,使血压下降[Z].有研究表明,针刺可调节自发性高血压大鼠的中枢和外周去甲肾上腺素~多巴胺和5-~T的含量,调节脑内和外周交感神经系统的活动,使外周血管阻力下降,降低血压[3].针刺具有滋阴潜阳~平肝熄风~宁心安神作用的穴位,不仅能较快的改善头痛~眩晕等高血压症状,还能调节神经系统,改善心肌代谢,解除外周血管痉挛,降低外周阻力,从而使血压下降.但传统体针及灸法痛苦较大,患者不易坚持治疗,六节通络仪采用现代电子技术,遵循大调合的基本原理,通过调频发射多种适合人体的电子脉冲,对穴位无创作用,腹背要穴同时治疗,一些禁针禁灸的穴位亦可选 收稿日期:Z OOZ-O5-Z Z;修回日期:Z OOZ-O6-Z3 作者简介:张青(196O-),女(汉族),上海市人.副主任医师,科主任.Tel.(OZ9)Z Z31884Ext.571用[4],且具有降压作用平稳,患者依从性好的特点,其降压效果与口服硝苯地平缓释片无明显差异,而且无服药所常见的头痛,面色潮红等副作用,对老年患者,长期高血压已产生耐受的患者更为适用,但其作用机制及长期效果尚有待进一步研究. 参考文献: [1]皱碧云,颜红红.活血熄风汤配合尼群地平治疗原发性高血压 病64例临床观察[J].新中医,Z OO1;33(1O):38-39. [Z]孙洪如,谢英彪,徐立群,王天宇.高血压病的自然疗法[M]. 南京:江苏科学技术出版社,1999:16O-19O. [3]周逸平,王月兰,方志斌.针刺对S~R血压及N E,D A,5-~T含 量的影响和血压与血粘度的关系[J].针刺研究,1995;Z O(3):55 -57. [4]张青,傅卫红,沙建萍,高炳趁,邓雅莉,唱荣艳.六节通络 仪治疗脑血管病偏瘫36例[J].第四军医大学学报,Z OO1; Z Z(15):14Z9. 编辑许昌泰 Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化和鉴定 作者：王彦宏， 朱平， 冷南， 解慧 作者单位：第四军医大学西京医院临床免疫科,陕西,西安,710033 刊名： 第四军医大学学报 英文刊名：JOURNAL OF THE FOURTH MILITARY MEDICAL UNIVERSITY 年，卷(期)：2002,23(19) 被引用次数：5次 参考文献(5条) 1.Schulze-Koops H;Kalden JR The balance of Th1/Th2 cytokines in rheumatoid arthritis[外文期刊] 2001(05) 2.Garnero P;Gineyts E;Christgau S;Finck B,Delmas PD Association of baseline levels of urinary glucosyl-galactosyl-pyridinoline and type Ⅱ collagen C-telopeptide with progression of joint destruction in patecnts with early rheumatoid arthritis[外文期刊] 2002(01) 3.Myers LK;Higgins GC;Finkel TH;Reed AM,Thompson JW,Walton RC,Hendrickson J,Kerr NC,Pandya-Lipman RK,Shlopov BV,Stastny P,Postlethwaite AE,Kang AH Juvenile arthritis and autoimmunity to type Ⅱcollagen 2001(08) 4.Christgau S;Garnero P;Fledelius C;Moniz C,Ensig M,Gineyts E,Rosenquist C,Qvist P collagen type ⅡC-telopeptide fragments as an index of cartilage degradation[外文期刊] 2001(03) 5.Snomden N;Reynlds I;Morgan K;HolLt T cell responses to Human type Ⅱ collagen in patients with rheumatoid arthritis and healthy controls 1997(07) 本文读者也读过(10条) 1.张志胜.刘安军.刘媛.菅景影.ZHANG Zhi-sheng.LIU An-jun.LIU Yuan.JIAN Jing-ying口服羊软骨Ⅱ型胶原蛋白抑制小鼠佐剂性关节炎研究[期刊论文]-河北农业大学学报2006,29(5) 2.刘小康.方治平.肖逸.蒋维.王浴生.LIU Xiao-kang.FANG Zhi-Ping.XIAO Yi.JIANG Wei.WANG Yu-sheng鸡Ⅱ型胶原蛋白的药物动力学研究[期刊论文]-华西药学杂志2001,16(2) 3.许海.徐玉东.刘兰涛.陈国荣.钟淑琦.马月秋口服Ⅱ型胶原蛋白对佐剂性关节炎大鼠白细胞介素1-β表达的影响[期刊论文]-哈尔滨医科大学学报2007,41(5) 4.刘媛.王健.王永刚.张志胜.LIU Yuan.WANG Jian.WANG Yong-gang.ZHANG Zhi-sheng羊软骨Ⅱ型胶原蛋白的提纯工艺[期刊论文]-食品研究与开发2009,30(11) 5.钱娴娟.胡永秀.赵文明用FPLC系统提纯可溶型Ⅱ型胶原蛋白[期刊论文]-免疫学杂志2001,17(3) 6.王彦宏.朱平.冷南.韩捷.解慧离子交换色谱一步法纯化Ⅱ型胶原蛋白[期刊论文]-细胞与分子免疫学杂志2000,16(6) 7.姜旭淦.朱敏娟.葛彦文.吴亮.陈盛霞.许化溪.JIANG Xu-gan.ZHU Min-juan.GE Yan-wen.WU Liang.CHEN Sheng-xia.XU Hua-xiⅡ型胶原蛋白抗血清的制备和检测[期刊论文]-江苏大学学报(医学版)2008,18(1) 8.姜旭淦.陈盛霞.丁建霞.王卉放.马洁.吴亮.许化溪.JIANG Xu-gan.CHEN Sheng-xia.Ding Jian-xia.WANG Hui-fang.Ma Jie.WU Liang.XU Hua-xi猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定[期刊论文]-江苏大学学报（医学版）2006,16(5) 9.姜旭淦.陈盛霞.王卉放.吴亮.许化溪.JIANG Xugan.CHEN Shengxia.WANG Huifang.WU Liang.XU Huaxi可溶性Ⅱ型胶原蛋白提取纯化条件的研究[期刊论文]-临床检验杂志2006,24(6) 10.卫晋雄.赵怡芳.程珺.朔敬人唾液腺腺样囊性癌细胞合成Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的研究[期刊论文]-中国口腔颌面外科杂志2003,1(2) 引证文献(5条) 1.宁志刚.王富友.崔运利.熊娟.杨柳可溶性猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取与鉴定[期刊论文]-重庆医学 2011(10) 2.沈杰.鲍建芳.何东仪.张之澧.倪立青乌梢蛇Ⅱ型胶原提取及其诱导大鼠关节炎特性的研究[期刊论文]-现代免疫学 2007(3) 3.姜旭淦.陈盛霞.王卉放.吴亮.许化溪可溶性Ⅱ型胶原蛋白提取纯化条件的研究[期刊论文]-临床检验杂志 2006(6) 4.姜旭淦.陈盛霞.丁建霞.王卉放.马洁.吴亮.许化溪猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定[期刊论文]-江苏大学学报（医学版） 2006(5) 5.郭云.张景锡.彭必先各类型胶原的分离方法[期刊论文]-明胶科学与技术 2005(3) 本文链接：https://www.360docs.net/doc/f0764937.html,/Periodical_dsjydxxb_4200219031.aspx (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910257876.7 (22)申请日 2019.04.01 (71)申请人 武汉轻工大学 地址 430023 湖北省武汉市汉口常青花园 学府南路68号 (72)发明人 徐玉玲 汪海波 何浪 李盛 张军涛 未本美 (74)专利代理机构 北京思创大成知识产权代理 有限公司 11614 代理人 高爽 (51)Int.Cl. C07K 14/78(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (54)发明名称一种胶原蛋白及其提取方法(57)摘要本发明公开了一种胶原蛋白及其提取方法。该方法包括如下步骤：1)将含有胶原蛋白的动物组织在液氮中进行冷冻、研磨；2)将研磨后的动物组织以酸/酶法提取胶原蛋白，得到胶原蛋白溶液；3)将胶原蛋白溶液透析、冻干后，得到粉末状的所述胶原蛋白。本发明采用冷冻研磨预处理方法，在液氮中预先冷冻含有胶原蛋白的动物组织一段时间，利用研磨仪在一定频率下研磨成粉末，该方法处理后，三螺旋结构及热变性温度并未受影响，能在保持天然胶原纤维化性能的基础上，比原有不冷冻研磨的酸提法的提取率提高18％-82％，这对于胶原应用及胶原基生物材料 的应用具有重要意义。权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 109796529 A 2019.05.24 C N 109796529 A 权 利 要 求 书1/1页CN 109796529 A 1.一种胶原蛋白提取方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： 1)将含有胶原蛋白的动物组织在液氮中进行冷冻、研磨； 2)将研磨后的动物组织以酸/酶法提取胶原蛋白，得到胶原蛋白溶液； 3)将胶原蛋白溶液盐析、透析、冻干后，得到粉末状的所述胶原蛋白。 2.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，进行步骤1)之前，还包括预处理步骤： 将含有胶原蛋白的动物组织脱脂、除杂蛋白后，干燥。 3.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中， 所述含有胶原蛋白的动物组织为哺乳动物皮和/或鱼类皮； 所述胶原蛋白为哺乳动物皮胶原蛋白和/或鱼皮胶原蛋白。 4.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，冷冻的时间为16～32h。 5.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，所述研磨的时间为3-25min。 6.根据权利要求5所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，所述研磨的时间为10-20min。 7.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，所述研磨的频率为10～25HZ。 8.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤2)中，酸/酶法提取胶原蛋白的步骤包括： 将研磨后的样品使用0.4～0.6mol/L乙酸浸泡并搅拌3～5d，再加入胃蛋白酶使混合溶液中胃蛋白酶的浓度为1.5～2.5％，搅拌16～32h后得到胶原蛋白溶液。 9.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤3)中，所述透析的时间≥3d。 10.由权利要求1-9中任意一项所述的胶原蛋白提取方法得到的胶原蛋白。 2 2011届本科生毕业论文 题目芦丁的提取分离及鉴定作者单位陇东学院化学化工学院指导老师胡浩斌 作者姓名张娜娜 专业班级2007级化学本科(2)班提交时间二〇一一年四月 2011届本科生毕业论文 芦丁的提取分离及鉴定 张娜娜，胡浩斌 （陇东学院化学化工学院，甘肃庆阳745000）摘要：目的以芦丁为例学习黄酮类化合物的提取方法，掌握黄酮类成分的主要性质及黄酮甙，甙元和糖的部分鉴定方法。方法采用水提法、碱水(石灰水) 提取法、有机溶剂(乙醇) 回流法对芦丁进行提取分离，并对其进行定性分析及色谱鉴定。结果水提法、碱水(石灰水) 提取法、有机溶剂(乙醇) 回流法，三种方法均可制的芦丁，且质量合格。结论从提高芦丁产率和纯度的角度出发，乙醇回流是较理想的提取方法。制得芦丁产率高，且测定方法简单、迅速、灵敏度高。 关键词：槐花米；芦丁；槲皮素；提取；分离；鉴定 Extraction, Seperation and Identification of Rutin Zhang Nana, Hu Haobin (College of Chemistry and Chemical Engineering, Longdong University, Qingyang 745000, Gansu) Abstraction: Objection Rutin as an example to learn the extraction of flavonoids square. Grasp the main properties and flavonoids ingredients flavonoids glucoside. Method W ith the water extraction method, buck (limewater) extraction,organic solvent (alcohol) extraction to extraction and separation of rutin and chromatographic identification. Result With water formulation,Buck (limewater) extraction,organic solvent (alcohol) method of extraction rutin backflow separation,three methods are made rutin and obtaining rutin quality qualified. Conclusion From improve yield and purity of rutin angle, ethanol refluxing was ideal extraction method. Preparation of rutin of high yield,high sensitivity. determination method is simple to rutin rapid. Key word: Sophora japonica; rutin; quercetin; extraction; separation; identification 引言 随着人们生活水平及质量的不断提高，心脑血管病的发病率也呈上升趋势，而且死亡率居各种疾病之首，因此，对治疗和预防心脑血管病的药品与保健品的开发研究就显得尤为重要， 1 槐花米中芦丁的提取与鉴定 背景知识 芦丁（Rutin）又称芸香苷，广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica L 的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高(含量可达12-16%)，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水形成的苷。 芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有3分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10 000；沸水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液，酸化后又可析出，因此，本实验采用碱提取酸沉淀法提取芦丁。 芦丁具有维生素P样作用。能维持血管的正常通透性，减低血管的脆性，缩短流血时间，可作为高血压病的辅助治疗剂。亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。 一、实验目的 通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作；熟悉芦丁、槲皮素的结构性质和检识方法。 二、实验要求 独立完成实验，从槐花米中提取出芦丁并进行鉴定。 三、实验原理 芦丁属黄酮类化合物，分子中有较多酚羟基，具弱酸性，易溶于热碱中，酸化后又析出，因此可以用碱溶酸沉的方法提取芦丁，又利用芦丁在冷水和热水中溶解度相差较大的特性进行重结晶精制。 四、实验材料和器皿 【器皿】 烧杯（500ml）2个，试管2个，布氏漏斗1个，玻璃棒1根，抽滤瓶1个，滴管，移液管（10ml）1根，洗耳球1个，滤纸，pH试纸，电热炉，真空抽滤机。 【材料】 槐米花30 g，饱和石灰水，0.4%硼砂水溶液，镁粉，pH试纸，浓盐酸，95%乙醇，10% α萘酚乙醇溶液，浓硫酸，蒸馏水。 五、实验内容 操作步骤： 称取30g槐花米于研钵中研成粉状物，置于500mL烧杯中，加入饱和石灰水，加热至沸，并不断搅拌，煮沸30分钟后，趁热抽滤。然后用浓盐酸调节pH值为4~5。放置1-2h，使沉淀完全，抽滤，沉淀用水洗涤2~3次，得到芦丁的粗产物。 流程图： 胶原蛋白的提取方法 胶原蛋白的提取与纯化的目标是尽量使胶原提取的产率、纯度更高，并且使所提取的胶原能满足不同领域的要求。迄今为止，胶原的提取方法主要有以下4种：酸法、碱法、盐法、酶法。在实际提取过程中，不同提取方法之间往往相互结合，以取得较好的提取效果。 1、酸法提取 酸法提取主要采用低离子浓度酸性条件浸渍处理原料，从而破坏分子间的盐键和希夫碱，而引起纤维膨胀、溶解。作为溶剂使用的酸，主要有盐酸或亚硫酸、磷酸、硫酸、醋酸、柠檬酸和甲酸等。酸法是提取胶原蛋白比较常用和有效的方法，用酸法提取的胶原最大程度地保持了其三股螺旋结构。此法处理快速，所得产品的分子量是连续的，适用于医用生物材 料及原料的制备，但产品得率低，设备腐蚀严重，污染重。赵苍碧等采用0.3 %的醋酸溶液在 4 ℃下从牛腱中提取胶原蛋白，得到高纯度的胶原蛋白溶液。余海等采用0.5 mol/L的醋酸溶液在4 ℃下从鼠尾肌腱胶成功提取出I型胶原蛋白。Takeshi等胶原蛋白课题组 采用0.5 mol/L的醋酸溶液从海妒鱼、鳍鱼、金枪鱼、水母等的皮中提取、分离出纯度较高的胶原蛋白，并对所提取的胶原蛋白的理化性质作了系统的研究。2、碱法提取 碱法提取胶原蛋白常用的处理剂为石灰、氢氧化钠、碳酸钠等。如Holzer等采用1 %～1.5 %石灰水浸泡的方法提取胶原蛋白。由于它容易造成肽键水解，因此得到的水解产物分子量比较低。所以，若想保留胶原的三股螺旋结构，此法不可取。 3、盐法提取 盐法提取胶原蛋白所用的中性盐有盐酸-三羟甲基胺基甲烷(Tris-HCl)、氯化钠、柠檬酸盐等。在中性条件下，当盐的浓度达到一定量时，胶原溶解。并且可采用不同浓度的氯化钠对提取的胶原蛋白进行盐析处理，可以沉淀出不同类型的胶原蛋白。 4、酶法提取 实验二芦丁的提取及鉴定 （一）概述 芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica 的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水合成的苷。 芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁具有维生素P样作用。有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗剂，亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。实验目的和要求 实验目的 ①通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 ②通过芦丁结构的检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。 ③了解UV及NMR在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。 要求 ①要拿到以下三个化合物：芦丁、槲皮素、芦丁的全乙酰化合物。 ②能够拿根据化学试验及UV、NMR数据初步推断出芦丁的结构。并对黄酮类化合物的结构测定有一般性的了解。 试验方法 芦丁的提取与分离（见下图） 芦丁的鉴定 ①芦丁的定性反应 取芦丁3~4mg，加乙醇5~6ml使其溶解，分成三份作下述试验： A. 取上述溶液1~2ml，加2滴浓盐酸，在酌加少许镁粉，注意观察颜色变化情况。 B. 取上述溶液1~2ml，然后滴加2%柠檬酸的甲醇溶液，注意观察颜色变化情况，在继续向试管中加入2%ZrOCl2的甲醇溶液，并详细记录颜色变化情况。 C. 取上述溶液1~2ml，然后再加入10%α-等体积的萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴加浓硫酸，注意观察两液面产生的颜色变化。 ②芦丁的紫外光谱解析 取芦丁溶于色谱纯甲醇中，加入规定的试剂，测定其UV光谱，试解析光谱并初步判断其结构。 综合化学实验: 芦丁的提取分离和鉴定 芦丁简介: 芦丁（Rutin）又名芸香苷化学式: C27H30O16·3H2O，是一种浅黄色针状结晶有机化合物，广泛存在于自然界植物中，是一种被人们广泛使用的有机天然产物。目前已发现含有芦丁的植物至少在70种以上，常见的如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均有不同含量。尤其以中药槐米（豆科、槐属，槐树Sophorajaponica的花蕾）和荞麦中含量最高，因此槐米可作为大量提取芦丁的天然植物原料。 中药槐米（炒碳）味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。西医研究其主要有效成分为有机化合物“芦丁”而中药槐米中芦丁的含量可高达12~16%，是主要的芦丁天然来源。槐米中还含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。研究文献证明芦丁具有VitP（维生素P）样作用（VitP具有生物类黄酮的功能，可防止维生素C被氧化而受到破坏，增强维生素功效；增加毛细血管壁强度，防止瘀伤。有助于牙龈出血的预防和治疗，有助于因内耳疾病引起的浮肿或头晕的治疗等）。而芦丁具有类似作用如可降低毛细血管脆性和调节通透性等，在医学临床上常将其用作毛细血管脆性引起的出血症以及防治高血压病等的辅助治疗药物。 芦丁是由槲皮素（quercetin）3位上的羟基与芸香糖（rutinose，一种由葡萄糖glucose与鼠李糖rhamnose组成的双糖）脱水合成的苷，是一种浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无结晶水时188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 补充知识: 胶原蛋白的提取 实验原料：猪皮，氯仿，乙醇，乙酸，0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，NaCl，NaOH，胃蛋白酶，蒸馏水。 实验器材：搅拌机，低温离心机，控温磁力搅拌器，电子天平，透析设备，PH试纸，烧杯，玻璃棒，小刀，研钵。 实验需配药品：A:氯仿/乙醇（2:1）约需400ml， B:0.5mol/L乙酸约3000ml， C:6mol/L NaOH溶液约40ml, D:质量分数0.1％、0.01％的乙酸（透析用）， E:含4.5mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl缓冲液约需200ml。 实验步骤： 1,猪皮的前处理： （1）称取猪皮50g，用氯仿/乙醇（2:1，A）溶液对其进行脱脂后切除皮下脂肪，去毛并细切； （2）将组织小块用乙醇和蒸馏水洗涤多次； （3）将洗涤后的组织放入搅拌机中搅拌成糊状，用含4.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5，E）充分洗涤（2h）以去除脂质及血清等成分，低温离心（8000r/min，30min，4℃）取沉淀。 2,提取胶原蛋白： （1）进行前处理后，在沉淀中加入500ml含胃蛋白酶250mg的0.5mol/L冰醋酸（B），搅拌并维持在4℃，提取48h； （2）高速冷冻离心机离心（4000r/min）吸取上清液。在上清液中加入NaCl至4.4mol/L （NaCl2.2mol）搅拌过夜； （3）低温离心，将沉淀溶于0.5mol/L冰醋酸中，再逐级用2.4mol/L（NaCl1.2mol，以500ml 冰醋酸计），1.7mol/L（NaCl0.85mol）及1.0mol/L（NaCl0.5mol）的NaCl反复盐析、酸溶。最后得到的上清液即为胶原粗提液。 3,胶原蛋白提纯: （1）在粗提胶原蛋白溶液缓慢加入6 mol/L NaOH溶液（C）调节pH值到7，冷冻离心除掉沉淀物，在剩余的溶液中加入氯化钠固体研细粉末，缓慢搅拌，4 ℃静置过夜保存；（2）离心取沉淀，用稀醋酸再次溶解，将溶解液装入透析袋中，用质量分数分别为0.1%、0.01%的乙酸溶液（D）透析1 d，再用蒸馏水透析3d，每天换透析液两次，最后得到的是纯度较高的胶原蛋白水溶液； （3）将纯化的胶原蛋白水溶液采用低温冷冻干燥法制备成纯胶原蛋白样品，备用。 胶原蛋白的提取、结构以及分子量测量综述 一、前言 胶原蛋白(collagen)是与各组织、器官机能有关的功能性蛋白 约占人体总蛋白的三分之一,存在于细胞外间质 是具有三股螺旋结构的蛋白质家族[1]。胶原是人体重要的细胞外基质成分,在细胞生物学中有重要应用价值。胶原是一个大的蛋白家族 至少有15个型别，各型胶原都具有一定的分子构型和组织分布特点，其中以Ⅰ型胶原分布最广含量最多 [2]。胶原蛋白 或称胶原 是按是否形成有周期性横纹的胶原原纤维collagenous fibril可将其分为原纤维胶原蛋白fibrillar or fibril-forming collagen和非原纤维收原蛋白nonfibrillar or non fibril forming collagen两大类。目前己发现的胶原蛋白类型己不下19种 原纤维胶原蛋白包括I、II、III、V、XI型胶原 在体内以胶原纤维的形式存在。胶原纤维是骨骼、肌腱、骨间膜、皮肤、软骨、韧带等器官的基本结构物质 使这些器官具有很高的抗张强度。胶原纤维与组织器官的生物力学特性密切相夫原纤维胶原蛋白包括I、II、III、V、和XI型胶原 其余均属于非原纤维胶原蛋白。非原纤维胶原蛋白具有胶原蛋白的基本特征 即三股螺旋结构 但其结构、分布和功能更具有多样性、非原纤维胶原蛋白按其超分了结构可进一步分类。 1.结合于胶原原纤维表面的胶原蛋白（fibril associated collagens with interrupted triple helice FACIT）包括IX XII XIV XVI X XI型胶原。 2.形成网状结构的胶原蛋白，包括IV VIII X型胶原。 3.形成串珠状纤维beaded filament的胶原蛋白有VI型胶原。 4.形成固着原纤维anchoring fibril 的胶原蛋白有VII型胶原。 5.有跨膜区的胶原蛋白有XIII和XVII型胶原。 6.结构尚未明确的胶原蛋白包括XV和XVIII型胶原等。胶原不仅作为组织的支持物,而且对细胞、组织乃至器官行使正常功能及伤口愈合都有重大影响。胶原作为医用生物材料比以往应用的金属、陶瓷或化学材料具有更大的优越，因此近20年来已被广泛用于临床 近年来 世界各国已将胶原制品广泛应用于临床修复软组织缺损覆盖烧伤创面、整形、牙周引导组织再生、口腔种植体、牙槽嵴再建及颌骨空腔修复。 二、胶原蛋白的提取 胶原多从牛皮、肌腱、鼠尾等部位提取，由于胶原是一个大的蛋白家族是细胞外间质的四大组分之一，几乎分布于所有的组织中。到目前为止已发现脊椎动物的胶原类型达十多种之多各型作用不一。胶原的异常改变涉及许多纤维化疾病。在肿瘤的发生与转移中胶原的分布和类型也发生改受。因此在提取时常将各型分别提取。目前从组织提取胶原多采用分级盐析的方法。在酸性条件下，I型和Ill型胶原沉淀的盐浓度临界点相近 在中性条件下III型和IV型胶原沉淀的盐浓度临界点又很接近。因此提取时难度较大，程序复杂，需过柱纯化，而且花费时间长，易发生胶原变性。主要的提取方法分述如下：I型和II型胶原主要分布于细胞，组织之间及结缔组织间质中，属于间质胶原，在脏器纤维化病理过程中I型和II型胶原起着重要作用。I型胶原是结缔组织间质中最主要的成分。一般制品多以I型胶原为材料文献上I型胶原的提取一般采用多次超速高心的办法。李成章、樊明文[3]。从人胚骨中提取了I型胶原，用于胶原制品的制作。采用胚胎骨组织来提取胶原，一般认为骨组织仅含有I 型胶原，选用骨组织作为提取原料可省去分型、过柱纯化等烦杂工序，简便经济，易获得纯度较高的I型胶原，他们的方法为将脱钙骨粉浸入0.5mol/LHAc24，48h，取上清缓慢加入研磨精细的NaCl，终浓度为4mol/L，搅拌过夜离心35 000×g，20min，下同，去上清，其沉淀物加入0.5 mol/L HAc透析溶解，离心，取上清依次加入0.lmol/LTris-HCI终浓度为0.01mol/L，5mol/LNaOH调pH至7.4，NaCl终浓度为4mol/L，搅拌过夜，离心，去上清，沉淀以4 mol/L NaCI，0.05 mol/L Tris-HCI洗一次，再加0.5mol/LHAC透析溶解，离心去沉淀，上清装入透析袋内，对NaCl溶府透析，平衡后NaCl浓度为1O离心去上清，沉淀物用0.5mol/LHAC透析去盐溶解，离心去沉淀，上清浓缩冻干以上所有液体及操作温度均为4℃。为提高抽提纯度骨粉应越细越好，脱钙必须完全，采用EDTA脱钙，可使一些非胶原蛋白，如骨连接蛋白 实验四槐米中芸香苷的提取分离与鉴定 芦丁(Rutin)亦称芸香甙(Rutisude)，广泛存在于植物界中。现已发现含芦丁的植物约有70余种，如烟叶、槐花米、荞麦叶、蒲公英中均含有大量的芦丁。尤以槐花米和荞麦叶中含量最高，可作为提取芦丁的原料，使用最多的是槐花米。 槐花米为豆科植物槐(Sophora japonica L。)的花蕾，所含主要成分为芦丁，含量可达12%~16%，其次含有槲皮素、三萜皂甙、槐花米甲素、乙素、丙素等。芦丁具有维生素P样作用，可降低毛细血管前壁的脆性和调节渗透性。临床上用于毛细血管脆性引起的出血症，并常作高血压症的辅助治疗药。 槐花米中主要化学成分的结构及性质： 1.芦丁(Rutin) 淡黄色细小针状结晶，℃~178℃(含三分子结晶)，188℃(无水物)。 溶解度： 水：1:100(冷)，1:200(热) 甲醇：1:100(冷)，1:9(热) 乙醇：1:650(冷)，1:60(热) 吡啶：1:(冷)，易溶(热) 不溶于乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。可溶于浓硫酸、浓盐酸，加水稀释复析出。 2. 槲皮素(Quercetin) 即芸香甙甙元，为黄色结晶，mp.313℃~314℃(含2分子结晶水)，316℃(无水物)。溶解度： 乙醇：1:290(无水乙醇)，1:23(热) 可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、吡啶、冰醋酸。不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚等。 3. 皂甙 粗品为白色粉末，mp.210℃~220℃(分解)。易溶于水、吡啶，能溶于200倍的甲醇中。酸水解后得白桦脂醇、槐二醇二种皂甙元及葡萄糖，葡萄糖醛酸及葡萄糖醛酸内酯。 (1) 白桦脂醇(Betulin) 无色针晶，℃~252℃。能溶于醋酸、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、 毕业论文外文资料翻译 学院：生物科学与工程学院 专业：生物工程 姓名：李秀莉 学号：120302214 外文出处：Food Chemistry 190(2016) 186-193 附件： 1.外文资料翻译译文；2.外文原文。 附件1：外文资料翻译译文 响应面优化蛋壳膜中胃蛋白酶溶性胶原蛋白提取工艺关键词： 蛋壳膜、响应面优化法、胃蛋白酶溶性胶原蛋白 摘要： 本文利用响应面优化法（RSM）确定了自变量对蛋壳膜中胃蛋白酶溶性胶原蛋白（PSC）提取产率的影响。采用中心复合设计（CCD）的实验设计和结果分析方法，选取最有可能的条件范围进行了优化实验：NaOH浓度（X1：0.4-1.2mol/L）,碱处理时间（X2：6-30h），酶浓度（X3：15-75U/mg）以及水解时间（X4：12-60h）。实验数据用适当的统计学方法通过多元线性回归分析得到一个二阶多项式方程，分析表明最佳提取条件为：NaOH浓度为0.76mol/L，碱处理时间为18h，酶浓度为50U/mg，水解时间为43.42h。在最佳提取条件下的提取率实验值是30.049%，这与预测值30.054%高度一致。 1.前言 胶原蛋白是脊椎动物的主要结构蛋白，大约占一个动物总蛋白的30%（Muyonga, Cole, & Duodo, 2004)。胶原蛋白的分子结构由三个多肽α-链扭曲在一起形成的一个三股螺旋体。在所有胶原蛋白的“胶原域”都发现了(Gly-X-Y)n重复。X和Y的位置往往分别被脯氨酸和羟脯氨酸占用（Gelse, Poschl, & Aigener, 2003）。目前，至少已有27中胶原蛋白类型已确定，其氨基酸序列、分子结构和功能明显不同（Canty & Kadler, 2005; Cheng, Hsu, Chang, Lin, & Sakata, 2009）。胶原蛋白已被广泛用作医药、化妆品、生物医学和食品行业的材料（Cheng et al.,2009）。一般来说，工业应用的胶原蛋白的主要来源是牛与猪的皮肤和骨头。然而，阮病毒疾病的爆发，如海绵脑病（BSE），传染性海绵脑病（TSE）和口蹄疫（FMD），以及禽流感，导致一些消费者对从这些动物体提取的胶原蛋白和胶原蛋白产品的担忧。此外，以猪为原料提取胶原蛋白不能被犹太人和穆斯林接收（Liu, Liang, Regenstein, & Zhou, 2012; Regenstein & Zhou, 2007）。因此，全球对胶原蛋白的代替原料的需求增加了，如水生动物。但是，关于胶原蛋白提取的其他来源的信息是有限的。 蛋壳作为副产品大约占了一个鸡蛋总重量（60g）的10%（Nys, Bain, & Immerseel, 2011）。据估计每年在伊朗蛋制品工业都产生100000吨的蛋壳。蛋壳膜存在于白色液体和固体蛋壳内表面之间。胶原蛋白占蛋壳膜总蛋白含量的10%（MacNeil, 2006）。在蛋 实验一槐米中芦丁的提取、分离和鉴定 一、概述 槐米系豆科植物槐树（Sophora japonica L.）的花蕾（槐米）。具有清热、凉血、止血的功效，用于治疗便血、痔血，尿血、血淋，崩漏，赤血痢下，风热目赤，痛疽疮毒，还可用于预防中风。近年来被用作治疗高血压的辅助药物。 药理实验证明，槐花米具有调节毛细血管的渗透作用，抗炎作用，解痉、抗渍疡作用，影响脂质代谢，抗菌等多种生物活性。槐花米中主要含有黄酮苷，皂苷、甾醇和鞣质等成分，其中芦丁(Rutin)含量最高，达12～20%。 主要化学成分的结构及理化性质： 芦丁（rutin）：C 27H 30 O 16 ·3H 2 O，浅黄色针状结晶，mp174～178℃（含三分子 水）；188℃（无水物）。难溶于冷水（1：8000～10000），可溶于热水（1：180～200），热甲醇（1：10），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：60），冷乙醇（1：650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。 槲皮素（quercetin）：C 15H 10 O 7 ·2H 2 O，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结 晶水），316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。 二、实验部分 （一）实验目的 1、通过芦丁的制备，掌握黄酮类化合物提取分离的原理和操作。 2、掌握酸水解将芦丁生成槲皮素的方法。 3、掌握芦丁与槲皮素的鉴别方法，聚酰胺薄膜的操作方法，电子天平的使用方法。 （二）实验原理 1、芦丁的提取原理：芦丁中含有多个酚羟基，具有酸性，故用碱提酸沉法。 2、芦丁的分离原理：芦丁在沸水中溶解，在冷水中析出。 3、芦丁的鉴定原理：芦丁与槲皮素分别为黄酮类化合物的苷与苷元，用Molish反应可以进行鉴别，也可以利用聚酰胺的氢键吸附性质进行定性分析，Rf值也应不同。 （三）实验药材、仪器与试剂 1、药材：槐米50g(每组)。 鱼鳞胶原蛋白的提取方法 摘要：人口、资源和环境是当前全球性的重大问题，加强对水产品的废弃物鱼鳞的加工利用和实现渔业生产的可持续发展已成为当今热门研究课题。文章简述了鱼鳞的结构特点，介绍了目前对鱼鳞胶原蛋白的提取方法，旨在使人们了解鱼鳞的真正价值所在，为其开发利用作参考。 关键词：鱼鳞胶原蛋白提取方法 近年来，淡水鱼加工业随着我国淡水鱼产量的增长而得到了较快的发展，鱼品加工也越来越广泛。但是，许多淡水鱼加工过程仅局限于对鱼体肌肉的利用，而对鱼鳞等废弃物的加工利用甚少。每年淡水鱼加工业的废弃物总量达到200万吨以上，其中鱼鳞约占15%，即30万吨。若能合理利用，可有效减少环境污染，又可提高企业效益，因此加大对鱼鳞含有物质的利用，可应用多个行业，其利用价值巨大，发展前景广阔。 1 鱼鳞的结构与组成 鱼鳞是鱼体与外界接触的组织，是鱼类真皮层的变形物，通常占鱼体重量的1%~5%，起保护鱼体免受伤害的作用。通常鱼鳞可分为三种：(1)板鳃鱼所特有的木盾鳞；(2)斜方型、边缘相联的硬鳞；(3)最常见的骨鳞，在硬骨鱼中最多。鱼鳞主要由蛋白质，卵磷脂，羟基磷灰石和鸟嘌呤组成，其中有机物占41％一55％，钙盐38％～46％。蛋白质占总重的70％，主要为胶原蛋白和鱼鳞角蛋白。鱼鳞胶原蛋白主要为I型胶原。I型胶原蛋白为三股超螺旋结构，即三条多肽链每条都向左旋转形成左手螺旋结构，这三条肽链再以氢键相互结合形成右手超螺旋结构。这种结构非常稳定，胶原一般不溶于水和中性盐溶液、稀酸、稀碱及一般有机溶剂，溶于强酸和强碱。 2 鱼鳞胶原蛋白的提取方法 2.1鱼鳞提取胶原蛋白的前处理 在鱼鳞的前处理中主要做的是脱钙，方法主要有酸脱钙和EDTA脱钙。酸脱 龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/f0764937.html, 胶原蛋白肽粉的提取工艺 作者：蔡比泰 来源：《现代食品·下》2017年第03期 摘要：作为一种新兴的功能型蛋白配料，胶原蛋白肽近年来在国内外受到广泛关注，取 得了快速发展。本文主要分析胶原蛋白肽的功能特性以及提取工艺，并提出未来胶原蛋白肽产品的发展趋势，以供相关企业参考。 关键词：胶原蛋白肽；胶原蛋白；提取工艺 Abstract：As a new type of functional protein ingredient， collagen peptide has been paid more and more attention in recent years. In this paper， the functional properties and extraction technology of collagen peptide were analyzed， and the future development trend of collagen peptide was put forward， for reference to relevant enterprises. Key words：Collagen peptide； Collagen； Extraction technology 中图分类号：TS254.4 在国家经济水平不断提升的今天，人们更加关注生活质量和个人身体质量。而胶原蛋白肽产品以其良好的补水、锁水、抗氧化、抗肿瘤和起泡性等功能，被越来越多的应用于各种护肤、药物以及食品中。 1 胶原蛋白肽概述 胶原蛋白是一种纤维性蛋白质，广泛存在于动物的骨骼、皮肤、毛发和血管中，主要起到支持、维护和修复机体的作用。胶原蛋白的主要构成物质是氨基酸，经过水解之后会生成胶原蛋白肽以及副产品氨基酸。下面将从两个方面阐述胶原蛋白肽。 1.1 胶原蛋白肽的理化性质 由于胶原蛋白肽的分子量比较小，比胶原蛋白更容易溶解。在浓度达到50%的情况下，胶原蛋白肽依然不会出现浑浊现象，且黏稠度非常低。此外，在一般的pH下，其溶解度会增强。正是由于这些特性，胶原蛋白肽在饮料等产品中的应用非常广泛。 1.2 胶原蛋白肽的功能特性 胶原蛋白肽是胶原蛋白水解后制成的，大量的亲水基团暴露在外面，胶原蛋白肽的吸水性能和锁水性要比胶原蛋白强很多。所以，胶原蛋白肽被大量应用于护肤品中，主要起到锁住皮肤的水分以及补水的功效。胶原蛋白肽还经常作为食品添加剂被广泛应用到食物烹饪中，主要 实验21 胶原蛋白的提取工艺研究 一、实验目的 1．掌握胶原提取与分离的工艺方法。 2．掌握冷冻离心机的使用。 3．了解胶原提取的实验原理。 二、实验原理 胶原是生物体内一种纤维蛋白，主要存在于皮肤、骨、软骨及肌腱等组织中，占人体或其他动物体总蛋白含量的25～33%。胶原分为可溶性胶原和不溶性胶原。随着年龄的增长，胶原分子间出现共价键架桥。这些架桥大多位于胶原分子N及c端的非胶原性肽(端肽)部分，因而易被蛋白酶切断。在酸性条件下，以胃蛋白酶处理(底物﹕酶＝20～100﹕1)或中性条件下经木瓜蛋白酶处理，被切除部分端肽的胶原分子便变为可溶性。本实验采用胃蛋白酶消化法从猪皮或肌腱中提取胶原蛋白。 三、主要仪器与试剂 1．主要仪器 控温磁力搅拌器，高速组织捣碎机，酸度计（或pH试纸），高速冷冻离心机。 2．试剂 猪皮或肌腱，胃蛋白酶，醋酸，硫酸铜，硫酸钾，氢氧化钠，硫酸，硼酸，盐酸。 四、实验步骤 安全预防：醋酸具有刺激性气味，需要在通风橱中进行。 1．原料前处理 将新鲜猪皮或肌腱去脂肪、筋膜后，切成5 mm以下的薄片，越少越有利于提取胶原蛋白。然后除血，脱脂，再用蒸馏水漂洗干净，晾干备用。前处理时必须充分去除脂肪组织，胶原中一旦有脂质混入，无论是进行中性，还是酸性沉淀溶解都是不能去除的，最后只能得到乳浊状的胶原溶液。 2．胶原蛋白的提取 将上述预处理好的猪皮或肌腱称重后放入三角烧瓶中，分别加入一定量的酶和一定浓度的乙酸溶液进行水解，控制温度4 ℃左右缓慢搅拌3 d，然后用高速冷冻离心机以4000 r·min －1离心，取上清溶液，即可得粗提胶原蛋白溶液。 3．胶原蛋白提纯 在粗提胶原蛋白溶液缓慢加入6mol·L－1氢氧化钠溶液调节pH值到7，冷冻离心除掉沉淀物，在剩余的溶液中加入氯化钠固体研细粉末，缓慢搅拌，4 ℃静置过夜保存。离心取沉淀，用稀醋酸再次溶解，将溶解液装入透析袋中，用质量分数分别为0.1%的乙酸溶液透析1 d，再用蒸馏水透析，最后得到的是纯度较高的胶原蛋白水溶液。 4．蛋白质含量的测定 凯氏定氮法。 五、思考题 1．原料前处理时，为什么必须充分去除脂肪组织？ 2．胶原蛋白提纯过程中，在剩余溶液中加入氯化钠的作用是什么？ 3．酶解时，对提取温度和pH值有何要求？ 参考文献 实验一槐米中芦丁的提取、分离与鉴别 一、实验目的 （1）掌握黄酮类化合物的提取原理和方法。 （2）掌握黄酮类成分的主要理化性质及鉴别方法。 二、实验原理 芦丁(Rutin)亦称芸香苷(Rutisude)，广泛存在于植物界中。现已发现含芦丁的植物约有70余种，如烟叶、槐花米、荞麦叶、蒲公英中均含有大量的芦丁。尤以槐花米和荞麦叶中含量最高，可作为提取芦丁的原料，使用最多的是槐花米。 槐花米为豆科植物槐(Sophora japonica L)的花蕾，所含主要成分为芦丁，含量可达23.5%，槐花开放后降至13.0%，其次含有槲皮素、三萜皂甙、槐花米甲素、乙素、丙素等。芦丁具有维生素P样作用，可降低毛细血管前壁的脆性和调节渗透性，临床上用于毛细血管脆性引起的出血症，并常作高血压症的辅助治疗药。 芦丁(Rutin)为淡黄色细小针状结晶，mp.174℃~178℃(含三分子结晶)，188℃(无水物)。溶解度情况如下： 水：1:10000(冷)，1:200(热) 甲醇：1:100(冷)，1:9(热) 乙醇：1:300(冷)，1:30(热) 吡啶：1:11.7(冷)，易溶(热) 不溶于乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。可溶于浓硫酸、浓盐酸，加水稀释复析出。 芦丁可溶于热水，难溶于冷水，其分子结构中具有较多的酚羟基，显弱酸性，在碱液中易溶解，而在酸性条件下，易析出沉淀，故本实验采用碱溶解酸沉淀的方法自槐米中提取芦丁。再利用其在冷热水中溶解度的差别采用沸水为结晶溶剂进行精制。利用芦丁可被稀酸水解，生成苷元和糖，通过颜色反应、薄层层析等方法进行检识和确认芦丁。 三、实验内容 （一）芦丁(芸香苷)的提取 1. 取1.5g石灰粉（CaO），置于干净的小研钵中，加入10mL水研成乳液备用。称取槐米20g，于1000m1烧杯中，加0.4%硼砂水溶液200mL，在搅拌下小心加入石灰乳调至pH 8～9，加热至微沸，维持pH值20-30分钟，趁热抽滤，弃去滤渣，冷至60-70℃用浓盐酸调至pH4-5，放置过夜，减压过滤，得粗芦丁（滤 研究简报文章编号:1000-2790(2002)19-1820-02 I型胶原蛋白的提取纯化和鉴定 王彦宏朱平冷南解慧 (第四军医大学西京医院临床免疫科陕西西安710033) 关键词:I型胶原蛋白;胃蛋白酶;关节炎 中图号:R593.22文献标识码:B 1材料和方法 1.1材料胃蛋白酶及I型胶原蛋白(C I)标准品购自美国Sigma公司.M r14.4~97.4>103低分子标准蛋白购自上海丽珠东风生化技术有限公司.CS-9000薄层扫描仪购自日本岛津公司. 1:Protein marker;2:C I(Sigma)2g L-1;3:C I(Sigma)1g L-1;4:C I1g L-1;5:C I0.5g L-1;6:C I0.25g L-1; 7:0.125g L-1. 图1SDS-PAGE分析经DEAE-52纤维素柱层析纯化的C I 1.2方法新鲜牛软骨剥去骨膜在液氮冷冻下磨成粉称质量用10倍体积的4mol L-1盐酸胍-0.05mmol L-1 Tris-~Cl(p~7.5)混悬后于4 下搅拌24h12000g离心20min弃上清用0.5mmol L-1乙酸充分洗涤.沉淀用4倍的0.5mmol L-1乙酸(内含1g L-1胃蛋白酶)混悬 4 下搅拌48h20000g离心20min取上清然后用3mmol L-1的NaCl沉淀过夜离心沉淀用0.1mmol L-1乙酸溶解此即为粗制之I型胶原蛋白(C I).DE52离子交换柱经 0.05mmol L-1Tris-~Cl-0.2mmol L-1NaCl(p~7.4)平衡后装入高度为20cm体积为120mL的交换柱内.缓缓加入经平衡液透析后之粗制C I在核酸蛋白检测仪检测下(7=280nm)调节流速约5mL min-1收集第1峰(C I)然后用3mmol L-1 收稿日期:2001-12-04;修回日期:2002-03-24 基金项目:国家新药基金资助项目(96-901-05-262) 通讯作者:朱平.Tel.(029)3375355Email.Zhuping https://www.360docs.net/doc/f0764937.html, 作者简介:王彦宏(1963-)男(汉族)陕西省扶风县人.主管技师. Tel.(029)3375360Email.cxyhfk https://www.360docs.net/doc/f0764937.html, NaCl4 下沉淀过夜离心取沉淀用0.5mmol L-1乙酸重溶解.透析此即为纯化后之C I.C I的鉴定:D采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电永(PAGE).选用50g L-1浓缩胶和120 g L-1分离胶样品分别为低分子标准蛋白(M r为97.4 66. 2 43.0 31.0 20.1和14.4>103)标准C I及不同批次的自产纯化C I.按常规电泳;@凝胶采用CS-9000薄层扫描仪扫描7=580nm. 2结果C I的SDS-PAGE的条带经与C I对照品(Sigma 公司产品)和标准分子蛋白的条带对照均一致(图1).SDS- PAGE薄层扫描结果如图2. 图2薄层扫描分析SDS-PAGE凝胶 3讨论I型胶原是RA的一种自身抗原抗胶原抗体和胶原特异性T细胞在关节炎的发生和发展中起重要作用[1-3]口服同种属或异种属I型胶原均有抑制减轻动物模型关节炎和人类RA的作用[4 5]国外多采用鸡I型胶原鉴于牛软骨来源更丰富我们采用胃蛋白酶消化法从牛软骨提取C I 并经DEAE-52离子交换柱层析纯化SDS-PAGE和薄层扫描鉴定均表明获得与Sigma公司产品分子质量一致的C I 为临床应用提供了实验方法和便利条件. 参考文献: [1]Snomden N Reynlds I Morgan K~olLt.T cell responses to ~uman type I collagen in patients with rheumatoid arthritis and healthy controls[J].1997;40(7):1210-1218. [2]Myers LK~iggins GC Finkel T~Reed AM Thompson JW Walton RC~endrickson J Kerr NC Pandya-Lipman RK Shlopov BV Stastny P Postlethwaite AE Kang A~.Juvenile arthritis and autoimmunity to type I collagen[J]. 2001;44(8):1775-1781. [3]Garnero P Gineyts E Christgau S Finck B Delmas PD. Association of baseline levels of urinary glucosyl-galactosyl- 槐米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定 槐米为豆科植物槐（Sophora japonica L ．）的未开放花蕾。味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。槐米常炒炭应用。 槐米的主要化学成分为芦丁，其含量可达12～16％，其次含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。芦丁具有Vitp 样作用，可降低毛细血管脆性和调节通透性。临床上用作毛细血管脆性引起的出血症，常作为高血压症的辅助治疗药。 [目的要求] 1．通过芦丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 2．掌握槲皮素的制备原理及操作。 3．熟悉紫外光谱在黄酮结构鉴定中的应用 4．通过芦丁的结构检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。 [实验原理] 芦丁（rutin ）：C 27H 30O 16·3H 2O ，浅黄色针状结晶，mp174～178℃（含三分子水）；188℃（无水物）。难溶于冷水（1：8000～10000），可溶于热水（1：180～200），热甲醇（1：10），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：60），冷乙醇（1：650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。 槲皮素（quercetin ）：C 15H 10O 7·2H 2O ，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结晶水），316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。 芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。利用芦丁易溶热水、热乙醇， 较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择【CN109796529A】一种胶原蛋白及其提取方法【专利】
芦丁的提取分离及鉴定A4
槐花米中芦丁的提取、分离与鉴定
胶原蛋白的提取方法
芦丁的提取及鉴定
芦丁的提取分离和鉴定
胶原蛋白的提取
胶原蛋白的提取、结构以及分子量测量综述
实验四槐米中芸香苷的提取分离与鉴定
胶原蛋白提取
实验槐米中芦丁的提取分离和鉴定
鱼鳞胶原蛋白的提取方法
胶原蛋白肽粉的提取工艺
胶原蛋白的提取工艺研究
实验 槐米中芦丁的提取、分离与鉴别
Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化和鉴定
槐米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定