慢病毒使用安全和注意事项
慢病毒安全使用和注意事项
?慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）
1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%
乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。
4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
6)实验完毕用香皂清洗双手。
?慢病毒收到后的注意事项
1)慢病毒的储存
用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。
b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。
2)慢病毒的稀释
汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册
用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。
宿舍安全用电常识及注意事项
宿舍安全用电常识及注意事项 为强化保安员生活用电基本常识，加强寝室安全用电的管理，预防火灾等事故的发生，保障保安员的生命和财产安全，特强调以下几点； （一）安全用电常识： 1.认识了解电源总开关，学会在紧急情况下切断寝室电源。 2.不用手或导电物（如铁丝、钉子、别针等金属制品）去接触、探试电源插座内部；不用湿手触摸电器，不用湿布擦拭电器。 3.电脑、充电器等使用完毕后应拔掉电源插头或关闭接线板上的开关；插拔电源插头时不要用力拉拽电线，以防止电线的绝缘层受损造成触电；电线的绝缘皮剥落，要及时更换新线或者用绝缘胶布包好。发生线路故障必须及时报有关维修部门（报修电话：82150112）更换或维修，严禁私自更换或维修。 4.发现有人触电要设法及时关断电源；或者用不导电物（如干燥的木棍等）将触电者与带电的电器分开，不要用手去直接救人，以防触电。 5.不随意在寝室内更改、拆卸、安装电源线路、插座、插头等，也不要把铁钉等硬物凿入墙面，以防发生电线短路、触电等意外事故。 6.电源接线板不应放在床上，应放在书桌等通风安全处，周围不要有易燃物品，也不要将接线板放在小杂物容易跌入或容易被水侵入的地方，电线不要与床架等金属物接触。接线板上不能接过多电源插头，禁止多个互接。 7.寝室无人情况下必须切断所有电源，尤其是插排，做到“人走断电”，防止发生火灾。 8.严禁私自跨寝室、跨寝室进行计算机联网或在公共网络线上私拉乱接。 （二）寝室用电注意事项： 1.在使用过程中如发现充电器、台灯等有冒烟、冒火花、发出焦糊的异味等情况，应立即关掉电源开关，停止使用。 2.有些充电设备使用时间过长会造成险情，出门时，请同学们自觉检查一下充电器是否处于安全状态。长时间外出前务必拔掉所有充电器，以避免火灾事故的发生。 3.要避免在雷雨天气的环境下使用带电物品，易使充电器、电插排等遭受雷击，这样不仅会损坏电器，还会发生触电危险。要拔下电源插座。 4.充电器等长期搁置不用，容易受潮、受腐蚀而损坏，重新使用前需要认真检查。 5.手机、台灯在充电过程中会散发出热量，应注意保持电器所处工作环境的良好通风，不在过高的环境温度下启用，将它们远离纸张、棉布等易燃物品，防止发生火灾。 6.使用台灯灯具时，不要在灯罩上或其附近放置易燃物品，如纸片等，容易引起火灾。灯头接触不良、灯头与玻璃壳松动、电气线路破损、接头松动等也可引发火灾。灯具表面温度过高，玻璃壳受热不匀，如果有水珠溅到高热的灯泡上会引起灯泡爆裂，掉下的玻璃碎片或灯丝可能会造成人身伤害或使可燃物起火。台灯必须放在桌面上使用；不得使用床头灯。 7.手机充电时间过长、边充电边打电话而导致电话机身发热，都属于高危易爆状况物品。 8.严禁在宿舍里使用劣质电器及非安全电器，如电炉、电锅、电热杯、热得快、电热褥、取暖器、电烫斗等电热器具。
慢病毒转染手册
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因
慢病毒载体使用手册
LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus. lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro. Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319). Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit https://www.360docs.net/doc/f12230362.html, to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: https://www.360docs.net/doc/f12230362.html,/gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material. Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005
不容忽视的排插及用电安全
不容忽视的排插及用电安全 先从插座谈起 很多家庭装修时都喜欢在每面墙体安装无数个电源插座。其中除了空调专用的16A（安培）插座以外，其余都应该是标定10A的插座。因此，我们在选购排插时，也应以不大于10A的产品为主，否则可能会出现电源插头不能插进墙壁上的固定插座中的情况。此外，无论是电器还是排插，其电源插头都有两线和三线的标准，其中三线插座分别为左零线（不带电）、右火线（带电）、上地线（防漏电保护），而两线插座则只有火线和零线。从安全的角度来看，三线标准的插头非常重要。 举个最简单的例子，当两线插座和两线插头的台灯碰到一起时，隐患就出现了。由于两线插头旋转180度之后仍然可以插入墙壁上的固定插座，因此会导致插座内原来的火线与零线位置发生变换：开关没有控制火线，反而控制了零线；火线（原本应该是零线）的电流会直接连接到灯口的螺纹上，只要墙壁上的插座中有电，灯口螺纹就带220V电压电流。此时当你在更换或擦拭灯泡（或者小孩误碰螺纹）时就会触电受伤，甚至丧命！当然，这只是一个极端的例子，而且很多电器也很难买到三线插座的款式，但是这最基本的原理还是需要我们掌握的。 现在电热水壶很流行，如果你将它与排插相连，在热水的过程中触摸一下排插的导线，是不是有明显的温度？原因就是导线内部的金属线缆在导电时会有电阻，在使用大功率电器（或多种电器同时工作）会产生热量，当温度超过了绝缘部分的承受极限时就会融化，导致短路甚至燃烧。从这个角度来看，排插导线（包括插座内部的金属触点和连接它们的铜片）的品质，将直接影响排插的寿命和安全。 一般来说，导线的横截面积越大（越粗）电阻越小，也就能负载更大功率的电器设备，并承载更高的温度。而排插导线内通常由三根（零、火、地）更细的导线组成，这些导线分别被绝缘材料包裹，内部则是由数十根头发丝般的铜丝（也有镀铜色的铝丝）缠绕构成，所谓的导线横截面积实际上是三股铜丝的总和。可惜不是所有品牌的排插都会注明导线横截面积的参数，普通用户很难鉴定孰优孰劣，建议大家直接选择大品牌旗下的产品。 挑选排插的
腺病毒详解
腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，基因组长约25-45kb，理论上可编码22-40个基因。衣壳（capsid）呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。衣壳含有240个六联体（hexon）、12个五联体（penton）及12根纤毛（fiber），除此之外还有其他一些小蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2等。六联体是形成病毒衣壳20个三角形面的主要蛋白，12个顶端是5个五联体亚单位和3个纤毛蛋白构成的复合物，12根纤毛以五联体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头节区（knob）。五联体和纤毛的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。 腺病毒含13%DNA和87%的蛋白质，病毒体分子量约为175×106。病毒基因组为线状双链DNA，大约含35kb～36kb，腺病毒12、18 和31型的DNA组成中，G+C mol%最低（48%～49%），属于对动物具有高致癌性基因型。腺病毒1、2、4、5、8等型的G+C mol%较高（61%），致癌性反而低或无。这是一种用于人腺病毒分离株的分组的标准，根据其基因同源性将人腺病毒分为A～F等6组。 腺病毒的基因组以线性的双链DNA形式存在，由蛋白VII和一种称为mu的小蛋白紧密地环绕在其周围，起到类组蛋白样的作用。另一种蛋白V将这种DNA-蛋白复合物连接起来，并通过蛋白VI与病毒衣壳连接在一起。在两条链的5′端各以共价键结合着一个被称为DNA 末端蛋白（pTP）复合物（DNA-TPC）的特化的结构，与腺病毒复制密切相关。腺病毒基因组的两端各有一段100bp的反向末端重复序列（ITR），是复制的起始位点。在左端ITR的3′侧有一段长约300bp的包装信号（ψ）介导腺病毒基因组包装入病毒衣壳。对腺病毒而言，只有包括两端的ITR和包装信号（ψ）的约0.5kb的序列是顺式作用元件，也就是说必须由腺病毒载体自身携带，而其他的30余种蛋白都可以通过辅助病毒（或细胞）反式补足。 病毒蛋白约11种（TP和PⅠ～PⅩ），其中有4种蛋白（病毒多肽PⅤ、PⅦ，末端蛋白TP、酶蛋白PⅩ）与病毒基因构成病毒核心，多肽PⅦ是主要的核心蛋白，如同组蛋白一样包裹病毒基因DNA。构成病毒衣壳的蛋白质约7种。多肽PⅡ是病毒衣壳中最丰富和最主要成分，六邻体是由3个PⅡ分子紧密相连组成。多肽PⅥ、PⅧ在六邻体与病毒核心之间形成连接桥，并与多肽PⅨ一起稳定着六邻体分子的晶格排列。5个分子多肽PⅢ相连构成五邻体的基座蛋白，PⅢa为五邻体的周围蛋白，也参与衣壳的组成，五邻体通过PⅤ与病毒核心相连。多肽PⅣ主要构成病毒三聚体纤突，纤突与病毒血凝活性相关，因血凝素（纤突）具有型特异性，常用血凝抑制试验（HI）对临床分离株进行分型。 分类及自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒有49种，分为A、B、C、D、E 和F六个亚群（subgroup）。基因治疗常用的人的2型及5型腺病毒在血清学分类上均属C亚群，在DNA序列上有95%的同源性。二者的增殖能力非常强，滴度通常可以达到109pfu (plaque forming unit)/ml，其在单个细胞中的基因组拷贝数可达104（约占细胞总DNA的10%）。病毒颗粒比较稳定，通过CsCl梯度离心可以达到1010~1011pfu/ml，满足动物实验的要求。
慢病毒使用操作指南
慢病毒使用操作指南? 一、慢病毒的储存与稀释: ?1. 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于 4 ℃保存;如需长期保存请放置于-80℃(病毒置于冻存管,并使用封口膜封口） 注:Ａ．病毒可以存放于－80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过６个月,我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度。??B.反复冻融会降低病毒滴度:每次冻融会降低病毒滴度10％;因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融,为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2. 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后,使用培养目的细胞用PＢＳ或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分 装后４℃保存(请尽量在三天内用完）,分装后使用。??二、慢病毒用于体外 (in vitro）实验:感染培养原代细胞和建系细胞 1. 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invａbｉo提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献,了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性,感染复数（MOI 值）以及在体内（iｎｖiｖo)注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（ＭOI 值）(使用２4孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性） ?２. 慢病毒感染目的细胞预实验 ①慢病毒感染目的细胞预实验注意事项 A. 测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的(HEK2９3T,Hｅla) 细胞作为平行实验的对照细胞。? B.在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基(培养目的细胞用）稀释;理论上，含有血清、双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。?C．Invabio提供的病毒单位为TＵ/mｌ，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有１X1０8个具有生物活性的慢病毒颗粒。 ?②以24孔培养板为例,进行目的细胞和HEK29３T 细胞的感染预实验? 实验前按照不同的ＭOI设置不同的感染孔，并根据MOＩ和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用ＰBＳ溶液或者无血清培养基稀释病毒原液??第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔,每个孔内接种3~５Ｘ10４个目的细胞,铺板时细胞的融合率为５0％左右，每孔培养基体积为10０μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。 1、取出４℃保存的第二天，观察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验:?? 病毒,使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可)；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI 准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢
lentivirus generation 慢病毒转染手册
Generation o f L entivirus Reagents ?293T: ATCC ?Fugene 6 transfection reagent: Roche cat# 11814443001 ?FBS: Invitrogen cat# 16000-044 ?DMEM: Invitrogen cat# 11965-118 ?Pen/strep: Invitrogen cat# 15140-155 ?L-glutamine: Invitrogen cat# 25030-156 ?Non essential amino acid (NEAA): Invitrogen cat# 11140-050 ?Amicon Ultra Ultracel 100K: Millipore: cat# UFC910024 ?Beckman centrifuge tubes: Beckman: cat# 344058 293T/fibroblast media (500 mls): DMEM (450 ml) 10% FBS (50 ml) Pen/strep (5ml) L-glutamine (5ml) NEAA (5 ml) Reagent setup Lentiviral vectors:Prepare all vector plasmids with Qiagen Maxiprep kits, including lentiviral packaging vectors and lentiviral transfer vectors A. Production of Virus 1. Seed 2x106 293T cells on a 100-cm tissue culture dish and incubate overnight until cells reach ~70% confluence (~1-2 days). Replace with 10 ml of fresh media 2 hours before transfection. 2. Mix lentiviral transfer vector and packaging vectors in 600 ul of DMEM in an eppendorf tube. Add 50 ul of Fugene6 directly to the DNA mixture, making sure Fugene6 does not come in contact with the plastic. Gently vortex tube containing transfection mixture and incubate at RT for 20 min.
关于慢病毒感染的相关知识总结..
慢病毒使用操作手册 一、慢病毒的储存与稀释: 1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） ①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 ②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。 二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验： 感染培养原代细胞和建系细胞。慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。 慢病毒感染目的细胞预实验 1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项： ①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。 ②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 ③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。 2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。 第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。 第二天，准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含
排插的用电安全常识
排插的用电安全常识 排插的用电安全常识 先从插座谈起 很多家庭装修时都喜欢在每面墙体安装无数个电源插座。其中除了空调专用的16A(安培)插座以外，其余都应该是标定10A的插座。因此，我们在选购排插时，也应以不大于10A的产品为主，否则可能会出现电源插头不能插进墙壁上的固定插座中的情况。此外，无论是电器还是排插，其电源插头都有两线和三线的标准，其中三线插座分别为左零线(不带电)、右火线(带电)、上地线(防漏电保护)，而两线插座则只有火线和零线。从安全的角度来看，三线标准的插头非常重要。 举个最简单的例子，当两线插座和两线插头的台灯碰到一起时，隐患就出现了。由于两线插头旋转180度之后仍然可以插入墙壁上的固定插座，因此会导致插座内原来的火线与零线位置发生变换：开关没有控制火线，反而控制了零线;火线(原本应该是零线)的电流会直接连接到灯口的螺纹上，只要墙壁上的插座中有电，灯口螺纹就带220V电压电流。此时当你在更换或擦拭灯泡(或者小孩误碰螺纹)时就会触电受伤，甚至丧命!当然，这只是一个极端的例子，而且很多电器也很难买到三线插座的款式，但是这最基本的原理还是需要我们掌握的。 现在电热水壶很流行，如果你将它与排插相连，在热水的过程中
触摸一下排插的导线，是不是有明显的温度?原因就是导线内部的金属线缆在导电时会有电阻，在使用大功率电器(或多种电器同时工作)会产生热量，当温度超过了绝缘部分的承受极限时就会融化，导致短路甚至燃烧。从这个角度来看，排插导线(包括插座内部的金属触点和连接它们的铜片)的品质，将直接影响排插的寿命和安全。 一般来说，导线的横截面积越大(越粗)电阻越小，也就能负载更大功率的电器设备，并承载更高的温度。而排插导线内通常由三根(零、火、地)更细的导线组成，这些导线分别被绝缘材料包裹，内部则是由数十根头发丝般的铜丝(也有镀铜色的铝丝)缠绕构成，所谓的导线横截面积实际上是三股铜丝的总和。可惜不是所有品牌的排插都会注明导线横截面积的参数，普通用户很难鉴定孰优孰劣，建议大家直接选择大品牌旗下的'产品。 挑选排插的3个关键点 每款排插都有一个最大的额定功率值(多为2500W)，在同时工作的电器太多或导线品质不佳的情况下会产生非常夸张的高温，网上也不乏某些家庭因将空调插在劣质排插上而引发火灾的报道。当温度达到极致时，排插的外壳材料将成为安全的最后一道屏障。 目前排插的外壳主要以ABS工程塑料和PC材料为主，前者成本相对低廉但阻燃性一般，耐温只有70℃左右，在极端情况下引起火灾的普遍就以这种材料的排插为主。而PC材料的特色就是阻燃，在750℃灼热丝接触下也不会着火(或火焰在30秒内自熄)。因此，我们在挑选排插时一定要选择PC材料为主的产品，品牌排插都会在包装或说
腺病毒常见问题与解答
腺病毒常见问题与解答 1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？ 有要求。对E1和E3双缺失的腺病毒载体，比如AdMax的Kit C、Kit D等，其总包装的 外源片断要求小于8 kb。而对于只有E1缺失或E3缺失的载体，比如Kit A、Kit B等，外源片断要求小于5 kb。注意，外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。 2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？ 腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。根据经验，完成一个完 整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012 VP左右. 3、如何提高腺病毒的活性？ 提高腺病毒的活性，关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程，如果扩增的病毒滴度高，那么纯化后就会更高的。 4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR（未翻译区）的额外的碱基会影响蛋白表达吗？ UTR尽可能短一些，特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。在起始密码子ATG 前面可以加一小段（6-9bp）的碱基序列可以增强目的基因的表达，比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。 5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞？ 参照文献报道是很简单的办法，也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。 Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞（包括分裂和非分裂细胞），比如肝、肌肉、神经组织等。但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞，比如乳腺癌、白血病细胞等，感染效率较低。 6、腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意哪些问题？ 1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。 2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。培养过夜后再感染病毒，效果较好。 3）选择适当的转导MOI（病毒感染单位数/细胞数），可以在MOI为0.1~1000范围内进行试验( 10倍比稀释)。 4）感染病毒时细胞培养液的体积尽量小一些，以完全覆盖细胞为准。如24孔板可用200ul，6孔板1ml。 5）感染时间为90分钟，每15分钟轻轻晃动培养液一次，以混匀。 6）选择适当表达检测时间，一般感染病毒24h后就能检测到目的基因的表达，48小时表达达到较高水平。 7、用于体内试验的腺病毒，是否要求纯化？ 是的，病毒纯化是很必要的。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会
慢病毒包装体系使用说明
慢病毒包装体系使用说明 本说明书适用于以下产品： 名称货号 慢病毒包装体系KLV3501 慢病毒包装体系（含293V细胞）KLV3502 慢病毒包装体系（含转染试剂）KLV3503 慢病毒包装体系（含293V细胞、转染试剂）KLV3504 北京英茂盛业生物科技有限公司 Web site：https://www.360docs.net/doc/f12230362.html,
1 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.360docs.net/doc/f12230362.html,/ 产品内容 KLV3501 KLV3502 KLV3503 KLV3504 慢病毒载体（过表达或RNA 干扰载体任选一种） 3 3 3 3 辅助载体pH1 3 3 3 3 辅助载体pH2 3 3 3 3 HEK293V 细胞 3 3 Polyfect-V 转染试剂 3 3 载体采用质粒形式发货，请在收到质粒后放-20℃冻存，也可以直接转化大肠杆菌感受态进行质粒扩增。 HEK293V 细胞采用干冰或培养瓶发货。请在收到细胞后根据附带说明书进行复苏或传代。 慢病毒载体 慢病毒载体中含有病毒整合和表达所需原件及表达外源目的基因的元件。外源基因通过载体中的多克隆位点插入慢病毒载体中进行表达。 pLV-EGFP-C 的载体图谱见下，本公司的其它慢病毒载体结构与之基本相似。其它载体信息见本公司网站https://www.360docs.net/doc/f12230362.html, 或本说明书后面的附表。
慢病毒包装载体 慢病毒包装载体包括pH1和pH2，表达生产病毒颗粒所需的病毒蛋白。载体图谱见下：
HEK293V细胞 包装细胞的状态对病毒包装效果有直接影响。我公司保存的293V细胞为低次代293V细胞，细胞性状稳定。在高密度下生长3天仍可保持贴壁状态，持续产生病毒颗粒，因此可多次收获病毒，降低病毒包装实验成本。 Polyfect‐V转染试剂 Polyfect-V转染试剂专为293V细胞转染及慢病毒包装研制,可以在细胞铺板同时进行转染，缩短病毒包装时间；无需要求细胞处于生长对数期，细胞转染时密度可以很高；细胞毒性极低；质粒和转染试剂用量是普通转染试剂的1/3到1/2等显著优点；包装病毒时转染效率接近100%，能提高病毒产量3-5倍。 3 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.360docs.net/doc/f12230362.html,/
安全使用排插注意事项(2021版)
( 安全常识 ) 单位：_________________________ 姓名：_________________________ 日期：_________________________ 精品文档 / Word文档 / 文字可改 安全使用排插注意事项(2021 版) Safety accidents can cause us great harm. Learn safety knowledge and stay away from safety accidents.
安全使用排插注意事项(2021版) 电源转换器也称排插，是一种量大面广的基础电器附件。其质量好坏，直接关系到各种电器设备的用电安全，与人们的生活和生命财产息息相关。有关资料显示，我国每年发生的电器火灾占全年火灾总数的30%以上，其中由于劣质插座引起的占相当大比例。在此郑重提醒大家，为了您和他人的安全，购买、使用排插时请注意以下几点： 1、购买排插最好到大型商场、超市选购知名品牌，并察看该产品有否通过国家3C强制认证，其标识是否齐全，有无厂名、厂址、产品型号规格、生产日期、检验合格证、使用说明书等；要切记保留好购买排插的单据或小票。 2、选购排插时请注意：排三级插头，接地级可旋转成内藏式的，变成两级的是不宜选择的；排插的插头是两级，可排插板上却有三
级插孔更不宜选购，因为无地线；注意插头与排插上标识的额定电流是否一致；排插插头插销不能太薄、太软；插头插入排插后应接触良好，没有松动的感觉，并且不太费力就能拔出。 3、插座不能放在床上及有易燃易爆物品的地方。 为了您和他人的安全，请使用符合安全标准的排插。近期，宿管员将对所有宿舍进行检查，不符合标准的将收到服务中心统一保管，直到离开本宿舍时再归还。请大家积极配合，安全、规范使用排插。请周知！ 云博创意设计 MzYunBo Creative Design Co., Ltd.
病毒包装实验整体流程及原理#(精选.)
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难以转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒
1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
重组腺病毒构建的标准操作规程
重组腺病毒构建的标准操作规程（编号：048） 1、目的及适用范围 该SOP用于规范真核细胞表达重组蛋白的操作。 2、主要仪器及试剂 电转仪、Adeasy-1系统（穿梭载体pshuttle-cmv,pAdtrack-CMV）、骨架病毒（pAdeasy-1）、重组菌（BJ5183感受态）、包装细胞（293A）、Taq酶。限制性内切酶、碱裂解法提取质粒溶液I、II、III、酚、氯仿 3、操作步骤 3.1目的基因的克隆：引物设计时要GOI中有没有Pme I/EcoRI和PacI酶切位点。 3.1.1通过限制酶切分析/PCR/基因测序确认GOI克隆到穿梭载体，翻译方向跟启动子方向相同。 3.1.2如果采用pShuttle 或pAdTrack，必须提供启动子和多聚腺苷酸信号。所有的穿梭载体必须包括一个Kozak 信号序列。 3.1.3因为在转化和转染前，用Pme I/EcoRI和PacI酶，所以要避免GOI中有这些酶的酶切位点。如果有PacI酶酶切位点，建议通过点突变除去。 3.1.4如果表达多个基因，避免头对头的方向，采用头尾相接的方式。 3.1.5建议在穿梭载体中，通过瞬时转染检测GOI的表达。 3.2制备电转 BJ5183 感受态细胞：BJ5183为链霉素抗性，固体和液体LB加终浓度为30μg/mL 的链霉素培养。划线培养、挑单菌落摇床培养，转接到200-300mL液体培养基中，37℃摇床培养至A550约0.8，转移到无菌离心管中冰浴10～30min，4℃3000rpm离心10min，用50mL灭菌的超纯水配制的10%甘油重悬,重复两次离心重悬，4℃3000rpm离心10min，用10mLWB重悬，4℃3000rpm离心10min最后用0.5mL重悬。分装20μL/管，-80℃冻存。 3.3用卡那抗性培养基培养2mL含有GOI穿梭质粒的细菌培养过夜。提取质粒DNA。推荐使用碱裂解法提取质粒，保证穿梭质粒的完整性可以提高在BJ5183细菌中重组的效率。 3.4 用Pme I或EcoRI线性化穿梭质粒：必须保证酶切完全。0.1μg-0.5μgDNA用300U的酶100μL 体系。电泳检测酶切是否完全。 3.5乙醇沉淀法回收纯化线性化的穿梭载体。 3.6 冰上操作：向20μLBJ5183感受态细胞中加入pAdeasy-1腺病毒骨架质粒和线性化的穿梭质粒，混匀，总体积不超过30μL。 3.7 将感受态和DNA混合物转移到用冰预冷的电转杯中，电击转化。电击完成后加入预热的LB 101