昆虫细胞蛋白表达常见问题解析

1、昆虫细胞蛋白表达系统能否将两个基因共同表达？

答：昆虫细胞可以同时表达多个基因,杆状病毒衣壳内可以容纳较大的

外源DNA插入片段，可以分别构建2个质粒，然后一起转染昆虫细胞，这种方式的优点是可以分别优化两个蛋白的表达水平，可以控制两个

蛋白的表达平衡，相对于一个质粒共表达的方式缺点是在蛋白表达之

前质粒构建，质粒抽提，蛋白病毒包被工作及成本费用都是增加一倍的；另一种共表达的方式是pFastBac Dual载体上构建两个目的基因，就可以同时表达两个蛋白。pFastBac Dual载体上两个启动子分别为

PH和P10启动子，其中PH启动子蛋白表达效率要高于P10启动子。

2、昆虫细胞蛋白表达系统的优势

（1）、可以表达大分子量的蛋白，目前做过250KD蛋白表达，依然稳

定性较好，没有断裂或降解。

（2）、昆虫细胞相对哺乳动物细胞培养相对简单，27度培养，无需

CO2补充，目前商业化的培养基细胞培养非常成熟，细胞密度能够达到15*10^6个/ml，昆虫表达系统成本较哺乳表达系统较低。

（3）、病毒一次包被，长期使用，稳定表达。较哺乳瞬时表达系统而言，该系统放大表达较容易，不需要抽提大量的质粒，质粒的质量以

及批次差异会影响蛋白表达。昆虫表达系统只需要包被好病毒，做好

表达小试即可稳定放大表达。

（4）、昆虫细胞体系能进行翻译后的加工修饰，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等；

（5）、可以同时表达多个基因，比如抗体、 fab、互相结合作用的蛋

白等；

（6）、杆状病毒对脊椎动物无感染性。

（7）、可以表达有毒蛋白，比如抗菌肽。

3、昆虫病毒的保存方式对病毒有怎样的影响？

答：制备病毒时添加2%的细胞培养级别的BSA或者胎牛血清，有助于保护病毒，如果忘记添加，在收货病毒后添加，放在4度或者负80保存，短期使用（一般半年左右）可以放在4度，长期使用建议负80保存，再次使用建议检测一下病毒滴度或者做个表达小试，防止病毒滴度降低或失效。对于长期项目，放大项目也可以考虑制备BIIC,液氮保存。

4、哪一类蛋白更适合昆虫表达系统？

答：激酶、HDAC（组蛋白去乙酰化酶）、病毒/昆虫来源的蛋白、糖蛋白、细胞因子、衣壳蛋白、VLP、包膜蛋白、膜蛋白。这些蛋白有的本身属于比较困难表达的蛋白，可以使用昆虫体系尝试表达。

5、衣壳蛋白表达后，如何鉴定纯化， VLP是什么？

答：衣壳蛋白纯化有些难度，主要会蛋白可溶性不好、不挂柱、形成聚体等问题，一般都是需要多步纯化的方式获得比较纯的蛋白。

VlP病毒类似颗粒，不含有核酸，有较强的免疫原性和生物活性，没有感染性，安全性高，所以适合开发疫苗。要想成功制备VLP需要考虑的工作比较多，在构建、纯化、鉴定、稳定性、活性以及规模化纯化都是需要努力的。

构建：对于非囊膜病毒而言，主要形成的VLP是其核衣壳蛋白，可以

通过嵌合表达，为什么要做嵌合，对于一些病毒而言，一个病毒属或

科里面的不同病毒他形成VLP的效率不一样，因此要借助那些组装效

率高的VLP，来嵌合组装效率不高的病毒。再者是制备二联或二价疫苗。对于囊膜病毒而言，带有GPI锚定序列的外源蛋白，一旦表达后可以

自动装配到细胞膜上面，再通过囊膜病毒自身的出芽，最终就在病毒

囊膜上。

纯化：有的病毒纯化后用专用的缓冲液透析可以促进蛋白组装成VLP,

有的病毒不能通过传统的纯化方式完成组装，可能这种纯化方式破坏

了已经组装好的病毒。小量纯化有蔗糖密度梯度离心和氯化铯密度梯

度离心的方式，能够有效的保护vlp结构。

电镜观察：需要处理样品，低盐、去蔗糖防止制备样片风干的时候有

晶体影响染色效果。用钟鼎专用推荐的缓冲液可以减少蛋白聚集。染

色时间不能太长。

6、昆虫蛋白表达是用昆虫吗？

答：不是，是通过培养昆虫细胞来表达蛋白的。也有用昆虫来表达蛋

白的，比如家蚕，这个属于侵染昆虫，属于家蚕系统（BmNPV），家蚕

表达蛋白能大量表达，但是家蚕表达蛋白后蛋白的纯化会非常困难，

并且我们的家蚕的培养环境和技术也有限，所以我们不推荐家蚕来表

达蛋白。

7、目的蛋白表达后和病毒一起释放到胞外吗？

答：目的蛋白是否释放到胞外主要由蛋白本身的性质决定以及是否添加信号肽决定，若目的蛋白在载体载体构建时加了信号肽，蛋白一般都会释放到胞外，但如果目的蛋白本身属于包内蛋白，如细胞骨架蛋白、核蛋白、胞质蛋白等，即便添加了信号肽，蛋白也可能不会释放到胞外。因此病毒的释放和目的蛋白的释放是两个过程，蛋白可能会和病毒一起释放到胞外，也可能会留在胞内。

8、BIIC是什么意思，如何制备BIIC？

BIIC:Baculovirus Infected Insect Cell

该技术被开发用于杆状病毒的长期储存，并且消除了对病毒扩增和重新滴定检测的需要。同时提高产量并减少批次之间的差异。主要是通过液氮冻存含有病毒的细胞来用于下游表达，据介绍该保存方法可以稳定保存病毒60个月不影响表达。

9、目的基因是否是整合到昆虫细胞的基因中？

答：不是，外源基因一般不会轻易的整合到宿主基因组中，需要有特定的条件，昆虫体系中，杆状病毒携带目的基因进入宿主，利用宿主的环境进行自我复制和基因表达，目的基因并没有整合到宿主基因组中。

10、昆虫蛋白表达，目的蛋白大小是否有要求？

答：一般蛋白大小在10kd-100kd适合任何表达体系， 110-250KD的大蛋白首选昆虫表达系统。

11、通过添加助融剂得到的溶解蛋白与通过低温优化表达得

到的溶解性蛋白有什么区别？助溶剂会影响蛋白活性吗？

答：助溶剂是比较温和的表面活性剂，是将本身不溶的蛋白变成溶解

的蛋白。低温优化表达得到的溶解蛋白，是通过条件优化表达出溶解

的蛋白。

助溶剂理论上对蛋白的活性影响很小，但是不确定助溶剂对蛋白

的活性没有影响，主要看后续的实验是做什么，对蛋白的活性需求，

如果担心助溶剂对蛋白的影响，可以更换体系表达或者尝试条件优化。

事实上，蛋白活性影响因素本身就很多，从表达系统上说大肠活

性＜昆虫＜哺乳，大肠很多时候表达的蛋白都没活性，昆虫是不保证

活性，哺乳是大部分都是有活性的；从蛋白角度分析：有的蛋白本身

就是可溶性差的蛋白，亲水性比较差，在表达的时候就容易沉，沉淀

就基本上没有活性。有些蛋白表达出来本身就没有活性，不论加不加

助溶剂，蛋白都不会有活性，因此是否添加助溶剂与蛋白有没有活性，不成对等的关系，但如果需要有活性的蛋白，最好能表达出溶解的蛋白，并且不需要加助溶剂。

原核蛋白表达常见问题解析

原核蛋白表达常见问题解析 1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。 2、跨膜蛋白为什么很难表达？跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个原因：跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。 3、如何选择蛋白表达宿主菌？

4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶回收三类。 1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，亲和纯化的方便快捷。 2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。（1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去工具酶。此方法能快速得到蛋白。（2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。 3、如果需要获得蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方法获得蛋白纯度较高，进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应，灵敏度较高。 5、表达得到的蛋白是有活性的么？答：需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性的强弱有无，一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯化后得到的蛋白活性要好，我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白形成的折叠最接近活性状态，这也是我们擅长的。但是在实际实验条件下，我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种

蛋白Western blot电泳——试验中常见问题及解答

蛋白质电泳与western blot1 Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。（1）原理（2）分类 ①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色（3）主要试剂（4）主要程序（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题 3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题 9. 条件的摸索10. 方法的介绍 11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。（2）分类 ①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。（3）主要试剂 1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和 1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、，1mlH2O去离子水配制，室温保存。 3、分离胶缓冲液:1.5mmol/L Tris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C 保存。 4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05g Tris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。 5，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制. 6.1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。 7缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

昆虫sf9细胞培养

Sf9培养要点：温度：27-28摄氏度 pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加传代时间：72h（三天左右）细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。此细胞系适用于InsectSelect系统。这两株细（以上来自invitrogen）胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。细胞特点：规则的带有颗粒球形。贴壁紧。标准条件的定义：培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。形成单层细胞可以传代培养悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。 Sf9悬浮培养所需要的细胞数培养基：sf-900 ⅢSFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量）培养瓶与培养体积：冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。

1. 用细胞计数板计数细胞。需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。细胞可是悬浮或贴壁培养； 2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记； 3. 室温400-600×g离心10min。移除上清。 4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞； 5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中； 6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h； 7. 储存于液氮中。转染的细胞：需要的是对数期的细胞＞95%发育能力，可以完成成功的转染。载氧：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞要求被动的通氧。积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50% Sf900II和sf900Ⅲ的区别：一般推荐Sf900II来大量表达蛋白 Sf900II含有表面活性剂（剪切力保护剂（保护细胞在转瓶中培养时不会受到剪切力伤害））当设计纯化多聚组氨酸标签蛋白的计划时，注意无血清培养基不能直接用于螯合树脂，因为培养基的成分会除去树脂中的镍离子。

SDS-PAGE电泳常见问题

SDS-PAGE电泳问题总结蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散？回答:多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律，这种情况常发生在高浓度胶或凝固不一致的胶里，你可以加大阴极的缓冲液浓度，可能会有点改善胶凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED帮助自由基作用，是催化剂，对凝固速度影响不是太大，可以试试加大APS的量丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围 15 ％ 15～45 kDa 12.5％ 15～60 kDa 10 ％ 18～75 kDa 7.5％ 30～120kDa 5 ％ 60～212kDa 来源于《蛋白质技术手册》汪家政每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质，而是指在这个区间内，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电，用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液，一样跑得好，阴极就不一样了，需要提供离子强度和SDS环境，而在电泳过程中，阴极缓冲液的一些离子损失，而且与样品接触，不适合再次使用
至于有些时候跑太大浓度的胶，因为药品，BUFFER配制过程的一些问题，导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方，胶跑得难看情况比较多，一般来说，15%的胶已经能够跑出大约15KDa左右的蛋白，对于普通 SDS-PAGE已经几乎到了极限，还跑不出来的MARK带，就不必去追究商品的问题了 SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降低则反之。所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天脚的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。做SDS-PAGE的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，方便后面的比较，特别是WB。做法就是拿1X的上样缓冲补全要加的样做到体积一致，否则跑出来会有的宽有的窄，特别是上样体积相差较大的加入染色液后，先放入微波炉里加热5-10秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久，否则冰醋酸就挥发了）。然后放水平摇床上摇20分钟，最多半小时就染好了。脱色也很简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不

昆虫的血液

昆虫的血液由血细胞和血浆组成，除双翅目摇蚊幼虫等少数昆虫因含有血红素而呈红色外，大多数昆虫的血液为无色、黄色、绿色、蓝色或淡琥珀色，比重为1.01～1.05，多为微酸性。由于昆虫体内只有一种细胞外体液即血液循环于体内和浸浴着所有组织和器官，并兼具哺乳动物的血液和淋巴液的特点，故又称血淋巴。昆虫体内的血液量因昆虫种类、虫期及生理状态的不同而有很大差异。 1 血细胞（Hemocyte）是指在昆虫血淋巴中流动着的游离细胞，来源于中胚层，约占血液的2.5%。但当昆虫被外物侵入或变态脱皮时，血细胞即行大量裂殖，数量增多。昆虫血细胞的形状常因观察时间与处理方法的不同而有较大差异，命名也颇不统一。最常见的血细胞有下面6种类型。 1.1 原血细胞（Prohemocyte）是普遍存在的小圆形血细胞，大小均一，核大并位于细胞中央，胞质嗜强碱性，是形成其他血细胞的干细胞。 1.2 浆血细胞（Plasmatocyte）是形态多样的吞噬细胞，有圆形、卵圆形、纺锤形、星形和不规则形等，核大并位于细胞中央，嗜碱性的细胞质中富含核糖体、线粒体、液泡等。在很多昆虫中，浆细胞是优势的血细胞，在昆虫免疫中起重要作用。 1.3 粒血细胞（Granulocyte）有吞噬作用的血细胞，核较小且常位于细胞中央，细胞质含有嗜酸性颗粒和粗面内质网。 1.4 囊血细胞（Cystocyte）又叫凝血细胞（coagulocyte），有一个小而圆形的车轮状的细胞核，破裂后使

周围体液发生沉积，起着凝结或愈伤作用。 1.5 珠血细胞（Spherulocyte）是一种小圆形或椭圆形的血细胞，核小且常偏离细胞中央，细胞质含嗜酸性内含物和许多液泡，在脂肪形成和中间代谢中起作用。 1.6 类绛色细胞（Oenocytoide）是一类形状和大小多变的血细胞，核小且偏离细胞中央，细胞质内含有酪氨酸酶、糖蛋白和中性黏多糖等，主要功能是参与物质代谢和分泌作用。 2 血浆（Plasma）是指体腔内浸浴着所有组织和器官的稍带粘滞性的循环液体，是胚胎时就充满体腔内的一种组织液，约占血液总量97.5%，比重在1.012～1.070之间。血浆的化学组成因昆虫的种类和龄期而有差异，但主要含有水分、无机盐、氨基酸、蛋白质、脂肪和糖类等物质，另外还有少许的气体、有机酸和激素。 2.1 水分约占血淋巴量85%左右。但因昆虫种类和发育期而有不同。例如，胃蝇Gastrophillus sp.幼虫血淋巴含水84%，牙甲Hydrophilus sp.幼虫含水92%。 2.2 无机盐类血浆中含有钠、钾、钙、镁、锰、铁、铜等以氟化物、硫酸盐、硝酸盐以及磷酸盐等形式组成的无机盐类，阳离子与阴离子常保持一定的离子平衡。一般来说，低等昆虫的渗透压主要由Na+和Cl－构成；有翅亚纲全变态的脉翅目、毛翅目、长翅目和双翅目血淋巴的渗透压有一半由无机离子构成，且以Na+为主，Cl－的作用很小，而全变态的鞘翅目、鳞翅目和膜翅目血淋巴的Na+含量低，而K+和Mg2+含量很高。另外，血淋巴中无机离子的含量和组配比率似与昆虫食性有一定的相关性。一般植食性昆虫血淋巴内含有较高浓度的K+和Mg2+，Na+/K+比率常小于1；肉食性昆虫常含有较高浓度的Na+，Na+/K+比率大于1；杂食性昆虫的Na+/K+ 比率常介于两者之间。昆虫血浆中无机盐离子的主要作用是参与物质运输，调节神经活动、酶活力、pH值和渗透压。 2.3 含氮化合物可分为蛋白质、氨基酸、尿酸、尿囊素、尿囊酸、尿素和氨等。昆虫血浆中蛋白质的含量，除少数昆虫外，普遍比脊椎动物血浆中的含量低，但一般比其他无脊椎动物血浆中的蛋白质的含量高。例如，膜翅目昆虫血浆中蛋白质的平均含量为5g/100ml，鞘翅目为3～4g/100ml，鳞翅目为2g/100ml，直翅目为1g/100ml，而人血浆中蛋白质含量为7.2g/100ml，甲壳动物为2～3g/100ml。昆虫血浆中的蛋白质主要是以酶的形式存在，如蛋白酶、淀粉酶、转化酶、酪氨酸酶和酯酶等，参与着物质的新陈代谢。

细胞培养基本方法

1.操作台基本要求： 2.随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20℃或-80℃冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染：（1）细菌污染

（2）酵母污染（3）霉菌污染初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。（4）病毒污染一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。（5）支原体污染唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE、PCR、免疫染色、放射自显影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5．适合贴壁的细胞和悬浮的细胞

6.基础培养基，减血清培养基，无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4；成纤维细胞系适合轻度偏碱（pH7.4-7.7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36℃至37℃最佳昆虫细胞在27℃为最佳禽类细胞在38.5℃最佳冷血动物（15℃-26℃） 9.动物细胞形态划分： ●成纤维细胞，贴附生长 ●上皮样细胞呈多角形，贴附 ●淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附 ●特殊形态： ?I型有长突触 ?Ⅱ型没有轴突 10.细胞增长模式

11.何时传代？ ●哺乳动物：生长的PH值通常表示乳酸储积，且有毒性，当PH迅速降低（） 0.1-0.2PH单位），同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。 ●昆虫细胞PH值会上升但不超过6.4 12．贴壁细胞的解离

昆虫免疫

昆虫免疫与信号传导摘要对于无脊椎动物抵御外来物质和病原体来说，先天免疫是迅速和唯一的免疫反应。昆虫依靠体液和细胞通过识别受体和激活免疫通路发挥免疫效应。脂肪体和血细胞产生以及分泌抗菌因子，但是在昆虫里血细胞才参与细胞免疫。近年来，研究集中在微生物识别机理以及对抗外来物质时细胞内信号分子的激活。这篇综述总结了昆虫先天免疫的机理，结合信号通路和它们的交叉反应涉及到了细胞免疫与体液免疫的潜在关联。关键字：昆虫先天免疫信号通路 Abstract The innate immunity is the immediate and sole response of invertebrates for the protection against foreign substances and pathogens. In insects, it relies on both humoral and cellular responses that are mediated via certain recognizing receptors and activation of several signalling pathways. Fat body and hemocytes are the origins for the production and secretion of antimicrobial agents and activators/regulators of cellular response, while cell mediated immunity in insects is performed by hemocytes. In the last years, research has focused on the mechanisms of microbial recognition and activation of intracellular signalling molecules in response to invaders. In this review, I summarize the mechanisms of the innate immunity in insects and refer to potential interactions between humoral and cellular responses, combined with the involving signalling pathways and their cross talk. Key Words: insects innate immunity signalling pathways

蛋白表达步骤

1．培养基的配制原理 wenku.baidu./link?url=B2SX0TUS5KB2ovXQcKyds9MS9OnW7y5Yn204CH3vg44FsT WICJAnwePCb013a9T-vzmX5g9oCbv6GSuPahN6jfA9hVhQXCd3QCMZ_NTscu7 步骤 LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。 LB培养基的配制：成分胰蛋白胨(tryptone) 10g 酵母提取物(yeast extract) 5g

氯化钠(NaCl) 10g 固体培养基另加琼脂粉15-20g 加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌30min 配制方法（1）称量分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl，置于烧杯中。（2）溶化加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。（3）调pH 用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。（4）定容将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。（5）加琼脂加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。（6）分装、加塞、包扎。（7）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。

2、大肠杆菌菌种活化原理菌种的活化就是将处于保藏状态的菌种放入合适的培养基中进行培养，逐级增大培养是为了得到纯而壮的培养物，可以理解为就是为了获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物进行培养。菌种发酵一般情况下需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化的情况就首选需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国际和国常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。对于不同的保存方式活化的方式也不同： 1 定期移植法的菌种复较简单，直接转接即可； 2 液体石蜡法保存的菌种在复时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次；

昆虫细胞表达系统

昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。杆状病毒是一类闭合环状双链病毒，病毒粒子呈杆状，以昆虫为主要宿主。杆状病毒还是一种出芽型分泌性病毒粒子，在感染细胞后能迅速在培养细胞中水平传播而保持细胞在相当长的时间内不裂解，从而最大限度地保持了外源蛋白的稳定，昆虫细胞表达系统又被称为昆虫杆状病毒系统。昆虫细胞表达系统本身是一个蛋白裂解性系统，在杆状病毒感染昆虫细胞的过程中，杆状病毒可以编码一些蛋白酶如木瓜蛋白酶等导致蛋白的降解。因此，收集细胞后，在裂解细胞之前要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白的降解。昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。而昆虫细胞表达系统具有很多优点： (1)具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统； (2)正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构； (3)具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；

蛋白质组学常见问题

HPLC 篇 1 ． HPLC 灵敏度不够的主要原因及解决办法样品量不足：解决办法为增加样品量样品未从柱子中流出：可根据样品的化学性质改变流动相或柱子样品与检测器不匹配：根据样品化学性质调整波长或改换检测器检测器衰减太多：调整衰减即可。检测器时间常数太大：解决办法为降低时间参数检测器池窗污染：解决办法为清洗池窗。检测池中有气泡：解决办法为排气。记录仪测压范围不当：调整电压范围即可。流动相流量不合适：调整流速即可。检测器与记录仪超出校正曲线：解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。 2 ．做 HPLC 分析时，柱压不稳定，原因何在? 如何解决? 原因可能有： ? 泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；比例阀失效，更换比例阀即可。泵密封垫损坏，更换密封垫即可。溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；系统检漏，找出漏点，密封即可。梯度洗脱，这时压力波动是正常的。 3 ．我购买的 HPLC 柱验收测试时柱压过高，请问为什么? 柱压过高是 HPLC 柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。

拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查。将柱子的进出口反过来接在仪器上，用 10 倍柱体积的流动相冲洗柱子， ( 此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动性 ) 。这时，如果柱压仍不下降，再检查；更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题， SGE 提供的Rheodyne 7315 型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。 4 ．液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么? 筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。存在干扰峰，解决办法为使用较长柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子。双向电泳篇 1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑 2D 的一向吗？一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完 1D 和 2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。 2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？这是因为BioRad的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（ 80 ％满）的矿物油。 3. 跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。

His蛋白纯化原理、方法和问题分析

组氨酸(His)标签蛋白的纯化 His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）纯化。 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。 Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。挂完之后，按理想来讲，你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数在烧杯里，留下来了，当然肯定有少量杂蛋白也挂上了，这时候你要梯度洗脱，拿咪唑和你的buffer配，一般从0 20mM 40mM。。。。100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度。咪唑加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋白，会在不同的浓度被洗脱下来，洗完之后，你可以用400mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡几次，是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~过的蛋白用不同的管子收下，然后SDS-page检测在哪个管子里。市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：一、组氨酸(His)标签蛋白的纯化步骤：大肠杆菌的破碎方法： 1）收集培养发酵液，4度7000-8000g离心10分钟，收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放-70度冷冻，但是最好能保存成小块或者薄片，这样好用。) 2）取1-2克菌体加10ml破碎缓冲液（pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，0.5mg/ml溶菌酶，1mM PMSF，1mM MgCl2，1.7units/ml Benzonase,其中的菌酶，1mM PMSF，1.7units/ml Benzonase现加）在冰上混合45分钟，如果pH不在7-8，需要用0.5M NaOH一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶10mg/ml混合时间可以缩短到

细胞培养与病毒培养实验步骤..

实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。二、常用细胞的种类 BHK-21：仓鼠肾传代细胞 PK-15：猪肾传代细胞 IBRS-2：猪肾传代细胞 Hela：人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 Marc-145：来源于Vero细胞 TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞 Sf9：昆虫细胞三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM

5、伪狂犬病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3×105个/ml 2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28-30℃ 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。六、营养液 1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理

SDS-PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法

SDS－PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论： Q：SDS－PAGE电泳的基本原理 A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响 A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是，分离胶；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导

电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 Q：样品如何处理 A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1、还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作

昆虫天然免疫的研究进展

昆虫天然免疫的研究进展摘要：昆虫是目前地球陆地上最繁盛的物种类群，是人类取之不尽的资源宝库。近年来，昆虫的免疫在其基础和应用研究方面受到极大关注，通过实验来研究与昆虫免疫相关的机制、信号等问题，对害虫防治、益虫防病、开发利用抗菌物、研究人类免疫机制等有着非常重要的现实意义。关键词: 昆虫；天然免疫；体液免疫；细胞免疫 Abstract：At present, insect is the most blooming species on the earth. And it is also a treasure-house of kinds of resources for humanity. For the past few years, the fundamental researches and application researches of insect immunity have been paid close attention to. Many scientific researchers study the mechanism and signal that related to insect’s immunity by doing experiments. It is of significance for pest control, preventing disease of beneficial insect, developing and using antibacterial material, studying humanity immunity and so on. Key words: Insect；Innate immunity；Humeral immunity；Cellular immunity 昆虫作为生物界分布最广、数量众多的一类群体, 在长期的进化过程中具备了高度的适应能力和独特的免疫体系。虽然昆虫没有像人一样的获得性免疫反应能力，但是昆虫拥有高效的先天性免疫反应系统。昆虫的先天性免疫系统包括体液免疫和细胞免疫两部分, 它们协同作用吞噬和清除血淋巴中的外源入侵物。[冯从经，陆剑锋，黄建华，等，2009]本文主要基于目前对昆虫天然免疫的研究进展做一简介。 1．体液免疫 1.1抗菌肽抗菌肽（AMPs），具有广谱抗菌活性和高效杀菌性，一直以来都承载着人类的一个梦想——取代抗生素。人类已经发现多种抗菌肽，测定出其结构，并获得抗菌肽基因，如Mdatta2基因[柳峰松，孙玲玲，唐婷，等，2011]、MdDpt基因[柳峰松，王丽娜，唐婷，等，2009]。根据氨基酸组成和结构特征, 一般可以把昆虫抗细菌肽分为 4类：即形成两性分子α-螺旋的抗细菌肽类、有分子内二硫桥的抗细菌肽类、富含脯氨酸的抗细菌肽类及富含甘氨酸的抗细菌多肽类。[柳峰松，王丽娜，唐婷，李伟，2009]昆虫抗菌肽中除绝大多数对细菌具有广谱高效的抑杀作用外, 近 10 年来也陆续发现了10多种抗真菌肽。昆虫抗真菌肽可分成两类: 昆虫组成性抗真菌肽、经免疫诱导在血淋巴中产生的抗真菌肽, 即昆虫免疫诱导型抗真菌肽[谢咸升，董建臻，李静，等，2011]。 AMPs 的产生主要由以下两个不同信号转导途径的活化而产生的: Toll途径和Imd途径，这两种途径通过激活不同的转录因子来调控不同AMPs 的基因表达。[王英，黄复生，2008]昆虫抗菌肽既具有种的差异性,又具有一定的同源性,抗菌物质在昆虫中普遍存在,可能是昆虫—植物—病原菌长期协同进化在免疫学上的体现,可以作为抗性资源利用[谢咸升，李静，董建臻，等，2009]。但是目前对抗菌肽作用机制仍需进一步研究，面对病原菌抗药性的升级, 抗菌肽及其基

蛋白质组学常见问题及解答

蛋白质组学常见问题及解答作者：未知来源：华大中生科技公司点击：129 时间：2006-9-12 Q: 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑2D 的一向吗？ A: 一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完1D 和2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。 Q: 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？ A: 这是因为BioRad 的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（ 80 ％满）的矿物油。 Q: 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？ A: 刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的pH 区域移动。Q: 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？ A: 蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是pH 指示剂，当它移动到酸性区时（pH4 ），颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。 Q: 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？ A: 当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。Q: 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？ A: 当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。 Q: 跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？ A: 等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的pI 值区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。 Q: 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？A: 硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。 Q: 怎样估计2D 胶上蛋白质点的分子量和pI 值？ A: 可以用BioRad 生产的2D 胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。