基因芯片综述

基因芯片综述

摘要：基因芯片是国际上20世纪90年代发展起来的一项顶尖技术，它是固体芯片表面构建微流体单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其它生物组分大信息的检测。高密度的基因芯片能够在同一时间内分析大量的基因，从而准确破译遗传密码。本文参阅了一些文献资料，对基因芯片的认识进行了综述。

关键词：基因芯片技术原理应用

基因芯片（gene chip）又称DNA芯片，是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过杂交信号的强弱判断靶分子的数量。用该技术可将大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可对大量核酸分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、效率低等不足。它能在同一时间内分析大量的基因，使人们准确高效地破译遗传密码。[1]

发展历史

俄罗斯科学院恩格尔哈德分子生物学研究所和美国阿贡国家实验室（ANL）的科学家们最早在文献中提出了用杂交法测定核酸序列（SBH）新技术的想法。当时用的是多聚寡核酸探针。几乎与此同时英国牛津大学生化系的Sourthern等也取得了在载体固定寡核苷酸及杂交法测序的国际专利。在这些技术储备的基础上，1994年在美国能源部防御研究计划署、俄罗斯科学院和俄罗斯人类基因组计划1000多万美元的资助下研制出了一种生物芯片，并用于检测尽地中海病人血样的基因突变，筛选了一百多个外地中海贫血已知的突变基因。这种生物芯片的基因译码速度比传统的Sanger 和MaxaxGilbert法快1000倍，是一种有希望的快速测序方法。抢先发展技术，尽快占领市场是市场经济竞争中取得胜利的信条。生物芯片目前正处于激烈的技术竞争状态中。Pac kard仪器公司发展的是诊断用的以凝胶为基础的中等密度的芯片。而Affymetrix公司则已成功地应用了光导向平板印刷技术直接在硅片上合成寡核苷酸点阵的高密度芯片而领先于芯片分析领域。该公司与惠普公司合作开发出专用的能扫描40万点点阵的基因芯片扫描仪，同时又开发出同时可平行通过几块芯片的流路工作站和计算机软件分析系统。组合成一套较完整的芯片制造、杂交、检测扫描和数据处理系统。不久GenralScanningInc与制造点样头的Telechem公司和制造机械手的Cartesian 公司研制的300型（两激光）4000型和5000型（四激光）激光共聚扫描仪和相应的分析软件，构成一套用户可任意点样制作芯片的工作系统。

欧洲各公司也不甘落后，纷纷投入竞争，例如GeneticCo．UK研制出QBot点样

器，Q-Pix克隆挑拣仪及Q－Fill制芯片设备。Sequenom则推出250位点的Spectrochip 并采用质谱法测读结果，而德国肿瘤研究所则用就位合成的肽核酸低密度（8cm×12cm 片上1000个点）的作表达谱及诊断用的探针芯片。如今，DNA芯片已经在基因序列分析、基因诊断、基因表达研究、基因组研究、发现新基因及各种病原体的诊断等生物医学领域表现出巨大的应用前景。

原理：分子生物学中的核酸分子原位杂交技术，即利用核酸分子碱基之间互补配对的原理，通过各种技术手段将核苷酸固定到固体支持物上，随后将处理好的样品与其进行杂交，以实现对所测样品基因的大规模检验。[2]

主要类型

目前已有多种方法可以将寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。这些方法总体上有两种，即原位合成（in situ synthesis ）与合成点样两种。支持物有多种如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等，但需经特殊处理。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基（视所要固定的分子为核酸或寡肽而定）并与保护基建立共价连接；作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等。

原位合成法主要为光引导聚合技术（Light-directed synthesis ），它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平板印刷技术（photolithography ）与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽阵列提供了一条快捷的途径。

以合成寡核苷酸探针为例，该技术主要步骤为：首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来。每次选取择适当的蔽光膜（mask ）使需要聚合的部位透光，其它部们不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。

该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。例如，合成48 （65536 ）个探针的8 聚体寡核苷酸序列仅需 4 × 8=32 步操作，8 小时就可以完成。而如果用传统方法合成然后点样，那么工作量的巨大将是不可思议的。同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达到106/c m2 。不过，尽管该方法看来比较简单，实际上并非如此。主要原因是，合成反应每步产率比较低，不到95% 。而通常固相合成反应每步的产率在99% 以上。因此，探针的长度受到了限制。而且由于每步去

保护不很彻底，致使杂交信号比较模糊，信噪比降低。为此有人将光引导合成技术与半异体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，使每步产率增加到98% 。原因是光敏抗蚀剂的解离对照度的依赖是非线性的，当照度达到特定的阈值以上保护剂就会解离。所以，该方法同时也解决了由于蔽光膜透光孔间距离缩小而引起的光衍射问题，有效地提高了聚合点阵的密度。另据报导，利用波长更短的物质波如电子射线去除保护可使点阵密度达到1010/cm2 。

除了光引导原位合成技术外，有的公司如美国Incyte Pharmaceutic als 等使用压电打印法(Piezoelectric printing) 进行原位合成。其装置与普通的彩色喷墨打印机并无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。做法是将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂所替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术。如此类推，可以合成出长度为40到50个碱基的探针，每步产率也较前述方法为高，可达到99% 以上。

尽管如此，通常原位合成方法仍然比较复杂，除了在基因芯片研究方面享有盛誉的Affymetrix 等公司使用该技术合成探针外，其它中小型公司大多使用合成点样法。

后一方法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的DNA 或多肽固相合成仪以完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷。现在已有比较成型的点样装置出售，如美国Biodot 公司的点膜产品以及Cartesian Tec hnologies 公司的PixSys NQ/PA 系列产品。前者产生的点阵密度可以达到400/cm2 ，后者则可达到2500/cm2 。

基因芯片具体的制作流程。

（1）芯片的设计与制备芯片制备方法主要包括两种类型: （1）点样法: 首先是探针库的制备, 根据基因芯片的分析目标从相关的基因数据库中选取特异的序列进行PCR扩增或直接人工合成寡核苷酸序列, 然后通过计算机控制的三坐标工作平台用特殊的针头和微喷头分别把不同的探针溶液逐点分配在玻璃、尼龙以及其它固相基片表面的不同位点上,通过物理和化学的方法使之固定。该方法各技术环节均较成熟,且灵活性大,适合于研究单位根据需要自行制备点阵规模适中的基因芯片。（2）原位合成法: 该法是在玻璃等硬质表面上直接合成寡核苷酸探针阵列,目前应用的主要有光去保护并行合成法、压电打印合成法等,其关键是高空间分辨率的模板定位技术和高合成产率的DNA化学合成技术,适合制作大规模DNA探针芯片,实现高密度芯片的标准化和规模化生产。

（2）靶基因的标记靶基因的制备和标记是基因芯片技术流程的一个重要环节, 靶基因在与芯片探针结合杂交之前必需进行分离、扩增及标记。标记方法根据样品来源、芯片类型和研究目的的不同而有所差异。通常是在待测样品的PCR扩增、逆转录或体外转录过程中实现对靶基因的标记。对于检测细胞内mRNA表达水平的芯片,一般需要从细胞和组织中

提取RNA, 进行逆转录,并加入耦联有标记物的d NTP,从而完成对靶基因的标记过程, 对于阵列密度较小的芯片可以用同位素, 所需仪器均为实验室常规使用设备,易于开展相关工作,但是在信号检测时,一些杂交信号强的点阵容易产生光晕,干扰周围信号的分析。高密度芯片的分析一般采用荧光素标记靶基因, 通过适当内参的设置及对荧光信号强度的标化可对细胞内mRNA的表达进行定量检测。近年来运用的多色荧光标记技术可更直观地比较不同来源样品的基因表达差异, 即把不同来源的靶基因用不同激发波长的荧光素标记, 并使它们同时与基因芯片杂交, 通过比较芯片上不同波长荧光的分布图获得不同样品间差异表达基因的图谱,常用的双色荧光试剂有Cy3 -dNTP和Cy5 -d NTP。对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光技术可以大大提高芯片的准确性和检测范围,例如用不同的荧光素分别标记靶序列及单碱基失配的参考序列,使它们同时与芯片杂交,通过不同荧光强弱的比较得出靶序列中碱基失配的信息。

（3）芯片杂交与杂交信号检测基因芯片与靶基因的杂交过程与一般的分子杂交过程基本相同,杂交反应的条件要根据探针的长度、GC碱基含量及芯片的类型来优化,如用于基因表达检测,杂交的严格性较低,而用于突变检测的芯片杂交温度高,杂交时间短, 条件相对严格。如果是用同位素标记靶基因,其后的信号检测即是放射自显影,若用荧光标记,则需要一套荧光扫描及分析系统,对相应探针阵列上的荧光强度进行分析比较, 从而得到待测样品的相应信息。由于基因芯片获取的信息量大, 对于基因芯片杂交数据的分析、处理、查询、比较等需要一个标准的数据格式。目前, 一个大型的基因芯片数据库正在构建中,将各实验室获得的基因芯片结果集中起来,以利于数据的交流及结果的评估与分析。[3]

应用

基因芯片技术以一种全新、系统的科研思维方式研究生物体，使揭示早期发育、分化、衰老、癌变等一系列复杂生命现象成为可能。基因芯片在生命科学研究领域中的应用几乎是全方位的，已经广泛应用于DNA测序、基因表达分析、检测基因突变和基因组的多态性、基因诊断、药学研究和环境保护及其他领域。

（１）DNA测序基因芯片的思想是在基因测序的早期提出来的，主要是因为当时传统的Sanger－Coulson及Maxam－Gilbert测序速度不够快，不足以解决人类基因组的大量工作。因此，基因芯片早期主要用来研究基因结构，适应于这种目的的主要是寡核苷酸芯片。参照已知基因的序列，在载体上设计、合成成千上万种寡核苷酸探针，与生物样品的靶序列进行分子杂交，从而产生杂交图谱，并排列出靶DNA的序列。将已经荧光标记的待测DNA样品与设计在基因芯片上的成千上万已知序列片段杂交，若二者完全配对，则杂交信号较强；若有单个或多个碱基不配对，则信号较弱。目前基因芯片主要用于已知序列的重测序（resequencing）。重测序是指人类基因组计划中的基因测序完成后，由于个体基因组的序列之间存在差异，需要对个别群体或个人进行再测序。由于序列已知，由基因芯片进行重测序将大大提高效率。

（２）基因表达分析基因表达分析是目前基因芯片应用最多的一个方面，自动化和快速

是它的主要优势。基因表达是根据基因的DNA模板进行mRNA和蛋白质合成的过程，基因表达分析直接涉及基因的功能。自Stanford大学的Schena M等8首次发表了用DNA微阵列研究基因表达的论文后，基因芯片用于研究基因表达已成为近年来研究的热门课题。在人类基因组中只有大约5%的序列表达，通过直接测序等手段来了解功能基因相当费时、费力，而应用基因芯片进行的基因表达水平检测，可自动、快速地检测出成千上万种基因的表达状况，大大提高了基因表达研究的效率，为疾病的诊断和治疗提供了有益的保障。在利用基因芯片技术检测表达水平的时候看家基因的选择极其重要，是否选择了一个突变率低表达稳定的基因作为看家基因将决定试验的成败。基因芯片检测表达水平一般采用平行对比的方法，至今已在细菌、酵母菌、植物、哺乳动物等方面进行了研究。现在这种方法已经成功地被用于进化研究、药物、毒物或各种因素对机体的影响等方面的研究。在HGP完成之后，用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片已为期不远。（３）检测基因突变和基因组的多态性有关实验结果已经表明DNA芯片技术可快速、准确地研究大量患者样品中特定基因所有可能的杂合变异。Hacia等用含96000个寡核苷酸探针的基因芯片来检测遗传性乳腺癌和卵巢癌基因BRCA1第11个外显子3.45kb长度内的所有可能的杂合性突变（LOH），其准确率达99%。Kurg等11以寡核苷酸阵列为基础，将地中海贫血病人的DNA的５ˊ端固定在玻片上经PCR扩增，加入四种荧光素标记的双脱氧核苷酸，通过颜色的改变检测突变取得成功，并提出该法可以高可信度检测杂交突变，用于ＤＮＡ的突变分析和多态性分析。田振军等应用cDNA基因芯片对安静对照组和运动性心肌肥大组小鼠心肌组织的基因表达差异进行筛选，结果证明具有显著性表达差异的基因有71条，其中上调表达的基因有3条，下调表达的基因有34条，证实了运动性心肌肥大相关基因的多样性。林嘉颖等以10例肺腺癌组织标本为材料，与含有13824个寡核苷酸探针的基因芯片进行杂交，发现了119条与肺腺癌发生发展有关的基因，这些基因可作为肺腺癌分子靶的候选基因。随着遗传病与癌症相关基因发现数量的增加，检测基因突变和基因组的多态性对于疾病的早期发现与防治具有重要意义。

（４）基因诊断从正常人的基因组中分离DNA并与DNA芯片上的方阵杂交，就可得到标准图谱，从病人基因组中分离出DNA并与方阵杂交就可得到病变图谱。比较、分析这两种图谱就能得出病变的DNA信息并进行治疗。以往诊断疾病主要依据患者的临床表现和既往史，但这不能区分一些重要的亚型，利用基因芯片的特点，检测病变组织中特征性基因的变化，为疾病的早期诊断和分型开辟了一个新的领域。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济平行化、自动化等特点，将成为现代化的诊断新技术。例如膀胱癌，就缺乏一种理想的免疫组织学或分子标志物来区分亚型。丹麦的Dyrskjot等用基因芯片检测了４０例膀胱癌组织将其分为三期：Ta期、T1期和T2~4期。并选出32个基因可以明确地区分良性膀胱癌和肌肉侵入性膀胱癌，和病理学分期密切相关。美国Affymetrix公司生产的检测逆转录酶基因的HIV芯片，可以判断被检查者是否携带艾滋病毒，还有诊断有无药物代谢缺乏症的细胞色素p450芯片，以及检测核磷蛋白基因（p53）是否突变来判断癌症的芯片。

许多疾病（传染病、遗传病、肿瘤、心血管疾病等）都与基因突变有关，利用基因芯片，可以快速检测这些突变，从而实现对疾病快速、简便、高效的诊断。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断现已成为基因芯片中最具有商业价值的领域。

（５）药学研究基因芯片所具有的高集成度与组合化学相结合，使得其在药学研究中具有重大意义，其作用主要表现在以下几个方面：１）寻找药物作用靶位点：基因芯片技术可对生物体整个基因组的基因表达进行测定，有助于识别药物相应的靶序列，分析整个基因组药物作用，监视药物治疗反应中的基因表达改变，并检查药效，从而在蛋白质或核酸中找出最佳的药物作用靶点。２）进行药物作用机制的研究：用于药理学研究。药物与细胞相互作用，将引起细胞外部形态及内部正常代谢过程的一系列变化。其内部生理活动的变化可集中表现在其基因表达的变化上，基因芯片能够确定靶组织的基因表达模式，可将药物作用的所有靶基因全部显示出来，从而提供了在全基因组的基础上了解药物作用机制的线索。由基因芯片所获得的大量信息也可以用来阐述直接药效下的药物反应个体差异，从基因组的高度在分子水平上解释药物作用的原理。３）药物筛选与新药设计：传统的新药研究是以体外培养的人体细胞及动物模型为对象，但两者均不同于正常人体内条件，利用基因芯片技术可以了解组织细胞在正常状态和病理情况下的基因表达变化。用基因芯片大规模平行分析基因表达情况，从而进行新药的研究与开发可以节省大量的动物试验甚至临床试验，而且还可以进一步分析药物对靶细胞及非靶细胞的毒性作用，确定药物临床应用的可行性及最佳的用药剂量，从而为新药的开发提供一种高速度，高灵敏度的安全指标，降低了用药风险。

（６）环境保护及其他领域在环境保护方面，基因芯片也有广泛的用途。一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，同时也可以采用毒物检测芯片对环境中众多的化学物质对人类基因的潜在毒性进行筛选，探查毒物开启或关闭那些基因，制备防治危害的基因工程药品，或寻找到能够治理污染源的基因产品。此外，基因芯片技术在病毒检测、劳动卫生学、食品卫生学研究以及农、林、畜、牧业等领域也正发挥着越来越大的作用。

问题与展望

基因芯片技术充分利用了生物学、信息学等当今前沿科技成果，发展至今，在诸多领域已呈现出广阔的应用前景。当然，作为一项新诞生的技术，它也同样有许多问题需要解决有学者也指出，基因芯片技术作为一种预测手段还不稳定，应慎重选择。首先该技术需要大量的已测知的、准确的DNA、cDNA片段的信息，充分利用这些信息才能使芯片技术成为大规模、集成化、整体获取生物信息的有效手段，现在尚缺乏公开可得的、经证实准确的基因序列。其次是目前研究芯片技术的费用还比较高昂，尽管芯片或微阵列可以重复多次使用但每次杂交反应后，其敏感性都要降低。此外，样品制备和标记还比较复杂，各研究机构中仍没有一个统一的质量控制标准，各实验室不能分享数据和资料库等。但相信随着功能基因组学和蛋白组学研究的深入和芯片技术的完善这些问题最终将会得到很好的解决，基因芯片技

术的建立得益于人类基因组计划的实施。在进入后基因时代的如今，基因芯片技术必将得到更广阔的发展空间。[4]

参考文献：

[1] 耿明杰郑翠芝. 基因芯片及其研究进展[J] 黑龙江畜牧兽医职业学院学报第1卷第1期2002年8月

[2] 张骞盛军. 基因芯片技术的发展和应用[J]中国医学科学院学报V ol.30 No.3 2008年6月

[3] 刘秀珍张如意栾海云李淑翠基因芯片技术及应用[J]滨州医学院学报2007年2月第30卷第1期

[4] 陈岩潘龙. 基因芯片技术研究进展[J] Journal of Qiqihar University of Medicine 2011,V ol.32,No.17