PPP项目公司十问十答

PPP项目公司十问十答
PPP项目公司十问十答

PPP项目公司十问十答

项目公司作为PPP项目的重要载体,在PPP项目建设和运营发挥着举足轻重的作用。为了对这一主体有更清晰地认识,下面将对PPP项目中的项目公司进行全面的解析。

1、PPP项目公司是个怎样的组织?

PPP项目公司是为实施PPP项目这一特殊目的而设立的公司,通常作为项目建设的实施者和运营者而存在,因此,也常常被称作“特别目的载体”(Special Purpose Vehicle,简称SPV)。

PPP项目公司是依法设立的自主运营、自负盈亏的具有独立法人资格的经营实体,作为PPP项目合同及项目其他相关合同的签约主体,负责项目的具体实施。项目投资人通过股东协议明确项目公司的设立和融资、经营范围、股东权利、股东承诺、股东的商业计划、股权转让等事宜。

2、PPP项目中的项目公司是否必需?

PPP项目公司的设立完全遵循自愿的原则,现有的政策法规并未对此进行强制性约束,参与PPP项目的政府和社会资本可自行协商是否成立项目公司。

在PPP上位法体系尚未建立的背景下,2015年六部委联合发布的《基础设施和公用事业特许经营管理办法》被视为PPP 的“基本法”,第十六条规定“实施机构应当在招标和谈判文件中载明是否要求成立特许经营项目公司”,表明开展特许经营类项目可根据项目实际自行选择是否成立项目公司。

2014年财政部印发的《政府和社会资本合作模式操作指南(试行)》第二十三条规定:“社会资本可依法设立项目公司。政府可指定相关机构依法参股项目公司。项目实施机构和财政部门(政府和社会资本合作中心)应监督社会资本按照采购文件和项目合同约定,按时足额出资设立项目公司。”表明财政部并未强行要求设立PPP项目公司,社会资本认为有需要可发起设立,但要依法合规;当社会资本认为没有必要时,亦可不设立。因此,SPV是个灵活的机制且可有可无。

3、为何大部分PPP项目会选择设立项目公司?

虽然,对于PPP项目公司的设立并未硬性规定,但是在实际操作中,绝大部分PPP项目都是通过设立SPV这一特殊目的载体,负责资本金投资、项目融资、建设、运营期的运营及维护、财务管理等事宜,保证PPP项目正常通行运营。原因有三:

一是表外融资。从政府角度看,推广PPP模式的一大动机是缓解地方财政压力,成立PPP项目公司后,政府并未控股或未实际控制该公司行为,因此,政府参股项目公司的投资直接显示为对外投资,后续PPP项目公司融通资金后,亦不需计入政府的资产负债表中,可使这部分的负债“脱表”,有效减轻政府负债,与尚未剥离的地方融资平台融资后直接计入负债项的会计核算方式不太相同。

二是有限追索,风险隔离。项目公司的设立一定程度上能实现项目风险的隔离,一旦出现风险,债权人只能向PPP项目公司进行有限追索而不会影响到投资人的资产(投资人为项目公司对外融资提供担保的除外)。

三是明确权责利。设立项目公司后,会对各参与方的出资责任、相关权利和义务进行合理的分配,权责利十分明晰。

4、谁是PPP项目公司的设立主体?

PPP项目公司虽非必需,但是却时常被采用,纵观现有的PPP项目公司,可分为两类:一是由社会资本(可以是一家企业,也可以是多家企业组成的联合体)按照市场化运作原则出资设立,负责项目的融资、建设、运营等事项;二是由

政府和社会资本共同出资成立,或者社会资本设立项目公司后由政府指定机构依法参股项目公司,政府和社会资本共同承担PPP项目的全生命周期的各项事宜,确保PPP项目顺利运作实施。

5、政府参与PPP项目公司组建时有哪些注意事项?

但是在上述第二种情况下,由政府或指定机构参与PPP项目公司时,必须注意的是,政府在项目公司中持有股权比例应当低于50%且不具有实际控制力及管理权。表明在PPP模式中,政府职能发生了转变,不再是传统的基础设施和公共服务的提供者,而是身兼“裁判员”和“运动员”的双重身份,政府不具有实际控制力及管理权凸显了PPP项目公司市场化运作理念。

6、PPP项目公司应为何种公司组织形式?有限责任公司还是股份有限责任公司?

目前尚未有文件明确规定项目公司的类型和组织形式,但是已成立的PPP项目公司多为有限责任公司,股东以其出资额为限对公司承担责任,公司以其全部资产对公司的债务承担责任。

这主要是考虑到在PPP项目中,虽然是项目公司作为项目的直接实施主体和项目合同的签署主体,但PPP项目的实施仍主要依赖于社会资本自身的资金和技术实力。项目公司自身或其母公司的股权结构发生变化,可能会导致不合适的主体成为PPP项目的投资人或实际控制人,进而有可能影响项目的实施。因此,在实践中,政府方往往会通过锁定期、股权受让方主体资格对社会资本股权变更进行限制。在锁定期内,未经政府批准,社会资本不得转让其直接或间接持有的项目公司的股权。即需要约定一个锁定期,在此期间社会资本的股权变更会受到限制。这与股份有限责任公司可以自由对外转让股权的特征不符,因此,在《公司法》的约束下,PPP项目公司多为有限责任公司。

7、PPP项目公司的注册资本和项目资本金有何区别?

注册资本和项目资本是两个不同的概念。如前所述,PPP项目公司多为有限责任公司,按照《公司法》第二十六条规定:“有限责任公司的注册资本为在公司登记机关登记的全体股东认缴的出资额。”即项目公司的注册资本实行认缴登记制,股东可自主约定认缴出资额、出资方式、出资期限等,并记载于公司章程。

同时,PPP项目常常伴随着大量的固定资产投资,必须满足固定投资项目资本金的要求,2015年9月,国务院重新修订发布的《关于调整和完善固定资产投资项目资本金制度的通知》规定了项目资本金的最低要求:城市轨道交通项目为20%,港口、沿海及内河航运、机场项目为25%,铁路、公路项目为20%,保障性住房和普通商品住房项目为20%,城市地下综合管廊、城市停车场项目,以及经国务院批准的核电站等重大建设项目,可以在规定最低资本金比例基础上适当降低。

值得注意的是,固定资产投资的PPP项目资本金只有实缴才能立项成立,这与《公司法》规定的公司注册资本认缴是有区别的。

8、PPP项目公司的股权结构应如何设计?

在项目公司的股权设置上,除了满足“政府在项目公司中的持股比例应当低于50%且不具有实际控制力及管理权”的要求外,政府和社会资本还应当结合项目收益预期、合作期限、融资方式和渠道等因素设置合理的股权比例,实现合作双方的互利共赢。

根据我院统计,按照出资比例可分为三类:一是对于相对比较成熟、易于监管的项目,有实力的社会资本全额出资设立项目公司,全资控股,避免参股复杂化;二是政府为了获得一票否决权和知情权,象征性地出资较小的比例,一般在5%左右;三是由政府和社会资本共同出资满足项目资金需求,这就需要考虑到地方政府财力、项目规模、项目自偿率等多种因素,做好财务方案的平衡设计,确定合适的股权比例。

9、PPP项目公司项目融资面临着什么困境?

融资难是掣肘PPP项目落地的主要因素。项目公司负责项目融资工作,包括开展融资方案设计、机构接洽、合同签订和融资交割等事宜。一般来说,国际上特别是发达国家PPP项目通行的PPP融资方式时项目融资,将项目本身的收入(使用者付费及政府补贴等)、资产和合同权益等通过合同安排来分担风险,借此充分发挥项目公司的风险隔离优势,如果项目失败,只是项目公司破产,社会资本的母公司不会受到牵连。

但是考虑到PPP项目周期长、投入大,且产权不明晰(一般项目公司只有经营权,没有产权),缺乏抵押和担保,国内金融机构对PPP项目较为审慎,与传统的信贷流程审核无异,要求社会资本尤其是民间资本的母公司提供完全担保,甚至要求政府提供相应的担保,导致项目融资在我国极为受限,认可度不高,成功率较低。

10、PPP项目股权投入有哪些退出渠道?

如何退出也是PPP项目参与方十分关注的问题,但是目前地方政府专注于力推PPP项目,重准入保障,轻退出安排。现有的退出方式大致可分为两类:一是无偿移交,大部分PPP项目属于特许经营类,待特许经营期结束后无偿移交给政府指定部门;二是由政府回购,在运营期的最后几年政府每年受让社会投资人持有的股权。但是考虑到第二种回购不太符合现行法规的要求,很多项目只能等到期满后无偿移交。

值得一提的是,除了项目结束的正常退出外,PPP项目公司的股权持有者更关注合作过程中的退出机制,2014年12月,发改委颁布的《关于开展政府和社会资本合作的指导意见》为此指明了方向,“依托各类产权、股权交易市场,为社会资本提供多元化、规范化、市场化的退出渠道。”表明在PPP项目运作过程中,股权投入可借助合法的产权交易市场完成股权的转让交易等,从而实现股权的有效退出。

2019扫黑除恶知识问答题目答案大全汇总

扫黑除恶知识问答 危害国家安全罪的概念? 危害国家安全罪是指危害国家主权、领土完整和安全,分裂国家、颠覆人民民主专政的政权和推翻社会主义制度的行为。 对组织、策划、实施分裂国家、破坏国家统一的分裂国家罪的法律后果是什么啊? 对组织、策划、实施分裂国家、破坏国家统一的分裂国家罪,对首要分子或者罪行重大的,处无期徒刑或者10年以上有期徒刑;对积极参加的,处3年以上10年以下有期徒刑;对其他参加的,处3年以下有期徒刑、拘役、管制或者剥夺政治权利。 具有哪些情形的组织,应当认定为“恶势力”? 经常纠集在一起,以暴力、威胁或者其他手段,在一定区域或者行业内多次实施违法犯罪活动,为非作恶,欺压百姓,扰乱经济、社会生活秩序,造成较为恶劣的社会影响,但尚未形成黑社会性质组织的违法犯罪组织。恶势力一般为三人以上,纠集者相对固定,违法犯罪活动主要为强迫交易、故意伤害、非法拘禁、敲诈勒索、故意毁坏财物、聚众斗殴、寻衅滋事等,同时还可能伴随实施开设赌场、组织卖淫、强迫卖淫、贩卖毒品、运输毒品、制造毒品、抢劫、抢夺、聚众扰乱社会秩序、聚众扰乱公共场所秩序、交通秩序以及聚众“打砸抢”等。 违犯《治安管理处罚法》具体表现及处罚? 扰乱机关、团体、企业、事业单位秩序,致使工作、生产、营业、医疗、教学、科研不能正常进行,尚未造成严重损失的;或者扰乱车站、港口、码头、机场、商场、公园、展览馆或者其他公共场所秩序的;或者扰乱公共汽车、电车、火车、船舶、航空器或者其他公共交通工具上的秩序的;或者非法拦截或者强登、扒乘机动车、船舶、航空器以及其他交通工具,影响交通工具正常行驶的;或者破坏依法进行的选举秩序的,根据《治安管理处罚法》第二十三条规定,处警告或者二百元以下罚款;情节较重的,处五日以上十日以下拘留,可以并处五百元以下罚款。盗窃、诈骗、哄抢、抢夺、敲诈勒索或者故意损毁公私财物的,根据《治安管理处罚法》第四十九条规定,处五日以上十日以下拘留,可以并处五百元以下罚款;对情节较重的,处十日以上十五日以下拘留,可以并处一千元以下罚款。 违犯《刑法》具体表现及处罚? 组织、领导和积极参加以暴力、威胁或者其他手段,有组织地进行违法犯罪活动,称霸一方,为非作恶,欺压、残害群众,严重破坏经济、社会生活秩序的黑社会性质的组织的,处三年以上十年以下有期徒刑;其他参加的,处三年以下有期徒刑、拘役、管制或者剥夺政治权利。 境外的黑社会组织的人员到中华人民共和国境内发展组织成员的,处三年以上十年以下有期徒刑。 犯前两款罪又有其他犯罪行为的,依照数罪并罚的规定处罚。 国家机关工作人员包庇黑社会性质的组织,或者纵容黑社会性质的组织进行违法犯罪活动的,处三年以下有期徒刑、拘役或者剥夺政治权利;情节严重的,处三年以上十年以下有期徒刑。 阻碍国家机关工作人员依法执行职务,或者强行冲闯公安机关设置的警戒带、警戒区行为的治安处罚? 王警官 阻碍国家机关工作人员依法执行职务,或者强行冲闯公安机关设置的警戒带、警戒区的,根据《治安管理处罚法》第五十条规定,处警告或者二百元以下罚款;情节严重的,处五日以上十日以下拘留,可以并处五百元以下罚款;阻碍人民警察依法执行职务的,从重处罚。 黑恶势力在征地、租地、拆迁、工程项目建设等过程中为谋取不法利益煽动闹事等行为的法律后果?

2019河南天一大联考高一下段考(四)(A卷)生物试卷【含答案及解析】

2019河南天一大联考高一下段考(四)(A卷)生物 试卷【含答案及解析】 姓名_____________ 班级 ______________ 分数_____________ 1.已知豌豆的高茎(D)对矮茎(d)为显性,在某杂交实验中,后代有的25%勺矮 茎,其亲本的基因型是() A . DdX d d B . DDK Dd C. DdX Dd D . DDK dd 2.有的植物的一朵花中既有雄蕊也有雌蕊(这类植物的花称为两性花),但有的 植物的一朵花中只有雄蕊或只有雌蕊(这类植物的花称为单性花)。下列关于植物杂交实验的说法,错误的是() A .对两性花的植物进行杂交实验需要进行去雄 D .对单性花的植物进行杂交实验操作更为简单 C .对两性花和单性花的植物进行杂交实验都需要进行套袋 D .去雄和人工授粉必须同时进行 3.杂合的黄色圆粒豌豆YyRr自交,后代中不会出现的是() A. 黄色:绿色=3:1、圆粒:皱粒?3:1 ___________________________ B . 纯合子:杂 合子?3:1 C.黄色圆粒的基因型有4种 D .黄色圆粒:绿色皱粒?9: 1 4.下列关于生物遗传规律的说法,正确的是() A .基因自由组合定律是基因分离定律的基础 B .基因型为Aa的个体连续自交,后代中纯合子所占的比例逐渐增大 C.基因分离定律和基因自由组合定律都发生

在受精作用和个体发育中 D.两对或两对以上相对性状的遗传都遵循基因自由组合定律 5.某种观赏植物的花色受两对等位基因控制,遵循孟德尔遗传定律。纯合蓝花植 株与纯合红花植株杂交,F 1均为蓝花,F 1自交,F 2出现蓝花:红花=15:1。若将红花植株花粉授予F2中的蓝花植株,则后代表现型及比例是() A . 蓝花:红花=3:1 B . 蓝花:红花=2:1 C . 蓝花:红花=8: 1 D . 蓝花:红花=4:1 6. 初级卵母细胞和次级卵母细胞在分裂过程中都会出现() A . 非同源染色体的自由组合 B .染色体复制导致细胞核DNA含量 加倍 C . 着丝点分裂导致染色体数目如倍 D . 染色体不分离导致染色体数目变异 7. 果蝇是XY型性别决定的生物。下列与果蝇减数分裂和有丝分裂有关的说法中,错 误的是() A .减数第二次分裂中期的细胞染色体数目与有丝分裂时期的细跑染色体数目不同 B .初级卵母细胞和次级卵母细胞中含有的性染色体数目一定不同 C.一个基因型为AaBb的精原细胞通常只能产生两种基因型的精子 D.有丝分裂和减数分裂过程中都可能发生基因突变 8.下图为某二倍体生物卵细胞形成过程中,细胞核内染色体数(黑柱)和DNA分子数 (白柱)在甲、乙、丙、丁四个连续时期的统计数据。下列相关说法错误的是( ) A .细胞中含有2个染色体组的时期是甲、乙 B . 丁时期雌性动物产生的子细胞即为卵细胞 C .乙时期会发生同源染色体的分离 D .有染色单体的时期是乙和丙 9.下图是人类某种遗传病的家系图,该遗传病由一对等位基因B和b控制。已

扫黑除恶应知应会60问

扫黑除恶专项斗争应知应会六十问答 1.扫黑除恶专项斗争是什么时间开始的? 2018 年1 月,中共中央、国务院发出《关于开展扫黑除恶专项斗争的通知》,2018 年1 月23 日,中央政法委召开全国扫黑除恶专项斗争电视电话会议,全国扫黑除恶专项斗争开始。 2.全国扫黑除恶专项斗争为期多长时间? 为期三年(2018 年-2020 年)。 3.联合发布《关于依法严厉打击黑恶势力违法犯罪的通告》是哪几个部门? 最高法、最高检、公安部、司法部。 4.扫黑除恶专项斗争三年工作重点分别是哪些? 2018 年:严态势,营造人人喊打的氛围; 2019 年:攻案件,提升群众满意度; 2020 年:建机制,取得压倒性胜利。 5.中共中央、国务院部署扫黑除恶专项斗争的背景是什么? 为深入贯彻落实党的十九大部署和重要指示精神,保障人民安居乐业、社会安定有序、国家长治久安,进一步巩固党的执政基础,党中央、国务院决定,在全国开展扫黑除恶专项斗争。 6.扫黑除恶专项斗争的重大意义是什么? 专项斗争是党中央站在中国特色社会主义进入新时代、" 两个一百年" 奋斗目标进入历史交汇期的高度作出的一项重大决策部署,事关" 两个一百年" 奋斗目标和中华民族伟大复兴中国梦的实现,事关人心向背、治乱兴衰,事关全面建成小康社会,与国家治理体系和治理能力现代化、党和国家长治久安、人民群众获得感、幸福感、安全感密切相关。 7.扫黑除恶专项斗争的目标任务是什么? 通过3 年的不懈努力,黑恶势力违法犯罪特别是农村涉黑涉恶问题得到根本遏制,城乡结合部等涉黑涉恶治安乱点得到全面整治,重点行业、重点领域管理得到明显加强,人民群众安全感、满意度明显提升; 黑恶势力" 保护伞" 得以铲除,加强基层组织建设的环境明显优化; 基层社会治理能力明显提升,涉黑涉恶违法犯罪防范打击长效机制更加健全,扫黑除恶工作法治化、规范化、专业化水平进一步提高,做到" 黑恶必除、除恶务尽"。 8.扫黑除恶专项斗争基本原则是什么? 坚持党的领导、发挥政治优势; 坚持人民主体地位、紧紧依靠群众; 坚持综合治理、齐抓共管;

十问十答

关于当前中国宏观经济的十问十答 (于永定中国社会科学院世界经济与政治研究所) 中国经济连续5年保持了超过10%的经济增长速度,而通货膨胀率则保持在3%左右的水平。但是,最近几个月以来,通货膨胀率明显上升,应该说,中国经济正在进入一个新的阶段,一个比较微妙的阶段。在这个阶段中,我们需要做出调整,同时需要准备应付一些不测事件。最近一段时间以来,中国经济学家之间,中国经济学家和有关部门决策者之间的讨论涉及了许多问题。本文试图把这些问题加以总结、概括,凑成十大问题,以期引起更深入的讨论。这十个问题是: 1.中国的潜在经济增长速度,是否已经从8%—9%上升到了10%—11%? 直到2003年,公认的中国潜在经济增长速度是7%~8%。在“十一五”规划中,中国政府实际上有一个潜在的经济增长速度目标,这个目标低于8%。2004年政府还曾提出中国的经济增长速度应该保持在7%左右。 从2003年以来,中国经济增长出现了前所未有的势头:连续五年经济增长速度超过10%,且没有严重通货膨胀。人们自然会问:中国的潜在经济增长速度是否有了明显提高?我认为提高是有,但不相信有大幅度的跳跃,从7%~8%跳到10%~11%的可能性不大。最近一段时间,中国经济增长速度加快,在一定程度是周期变化的结果。在经过长达6~7年的通货收缩之后,2003~2004年经济出现投资推动的快速增长是自然的。2005年以后“瓶颈”的消除使2006年得以保持低通胀的高增长。经济增长既有趋势的变化也有周期性因素,必须把这两者加以分离,以确定中国的潜在经济增长速度。如果根据现在经济增长速度是11.5%,就断言中国潜在经济增长速度已经达到了10%~11%,是不够慎重的。通货膨胀不会随经济的高速增长立即出现,而会有一年甚至更长时间的滞后。如果以当期的经济增长速度为基础确定宏观经济政策目标,其后果很可能是经济的进一步过热。反通货膨胀政策不能等通货膨胀迹象明显时再出台。更何况,中国当前的通货膨胀率已经明显超过了年初的控制目标,且有进一步上升的危险。 2.中国当前的通货膨胀是孤立的,一次性的,还是普遍的,同时兼有需求拉动和成本推起性质的? 两个月之前,许多经济学家仍认为中国不存在通货膨胀的问题,CPI上涨很大程度是一次性的,是猪肉和粮食价格上涨造成的。外国因此将中国的通货膨胀戏称为“小猪周期”。我认为中国的通货膨胀实际上已经比较严重,其发展前景令人担心。这种担心是否是杞人忧天呢?不一定,理由如下: 第一,中国经济增长速度已经明显超过了潜在的经济增长速度,根据一般的经济理论,通货膨胀的发生一般都有一段时间的滞后,而中国高增长低通胀的情形已经有几年了。 第二,现在不是个别农产品的价格在上涨,而是农产品价格在普遍上涨。不仅是农产品价格在上涨,而且农产品生产的投入价格也在普遍上涨。农产品价格的上涨同耕地面积的减少、世界范围内农产品价格的上涨都不无联系。所以很难相信,通过增加生猪存栏数我们就可以解决当前农产品价格上涨的问题。现在PPI也开始上涨。所有这些指标都告诉我们,必须对通货膨胀的长期性、持续性保持高度警惕。 第三,更令人忧虑的是,在一般老百姓中已经形成了通货膨胀预期,对通货膨胀上涨的不安情绪正在弥散。即便这种情绪是建立在错误判断的基础上,但通货膨胀预期一经形成,就难以打掉。而预期的形成将改变公众的行为,使通货膨胀的恶化难于避免。 第四,近年来工资和薪酬的增长速度明显高于劳动生产率的增长速度。“通货膨胀——通货膨胀预期——工资和薪酬上涨——通货膨胀”的恶性循环正在形成之中,或者已经形成。 第五,中国存在严重的价格扭曲。所以还需要对相对价格进行调整。相对价格的调整

维真生物-稳转株的制备

稳转株的制备 实验原理: 利用哺乳动物系统生产蛋白的方式有两种:瞬时转染和稳转株筛选。通过稳定细胞系构建筛选稳定表达细胞株。针对瞬时转染,外源基因在短时间转录翻译得到的蛋白量较少,能够满足小量蛋白制备,大量生产成本很高。相对于此,稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上,随着细胞的生长分裂外源基因可以稳定转染表达,同时经过抗生素加压筛选,最终得到能够稳定转染表达蛋白的细胞株,稳转株生产蛋白稳定性更好,批次差异性更小。 稳定转染的应用

影响稳定转染的因素 1、外源基因整合的几率 决定了稳转株筛选的简易程度,有利于稳定转染细胞的获得; 2、插入外源基因片段的拷贝数 一般情况下,低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰; 3、整合位点转录活跃度 整合位点转录活跃度决定了稳转株筛选细胞后稳转株中外源基因片段的表达质量; 4、外源基因片段整合到细胞后的稳定性 不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性,有些区域易发生重组或者丢失,从而使稳转株筛选后出现丢失的现象。 制备稳转株的实验步骤

一.准备及预实验 1、确定细胞系相关信息:需包括如下内容 注:务必保证细胞无支原体污染,方可进行稳转株构建! 2、查阅慢病毒感染该细胞的MOI值 3、预实验确定筛选药物用量: (1)查阅Puromycin/Blastincidin在目的细胞中稳转株筛选的致死用量信息;参考查阅得到的数据,确定3个药物浓度梯度(如没有相关信息,则需将药物浓度梯度范围增大,数量增多至6个); (2)D0将细胞铺于6孔板中,使D1细胞融合度约90%;D1按(1)中设置的药物梯度,加入药物; (3)D4换液,并重新加入药物; (4)D7观察,找到致死率100%的孔,该孔使用的药物浓度,即为药物筛选浓度。 二.稳转株筛选及构建 注:以下实验参数,按1株稳转株为例描述,实验需考虑有无对照稳转株! 1、细胞铺板:D0将细胞接种于6孔板中(4个孔),使D1细胞融合度约70%

生物技术制药课后习题答案

第一章绪论 1生物技术是以生命科学为基础,利用生物体(或生物组织、细胞及其组分)的特性和功能,设计构建有预期性状的新物种或新品系,并与工程相结合,进行加工生产,为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。 2生物技术的主要内容:P1 基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程 蛋白质工程:运用基因工程全套技术改变蛋白质结构的技术。 染色体工程:探索基因在染色体上的定位,异源基因导入、染色体结构改变。 生化工程:生物反应器及产品的分离、提纯技术。 3生物技术制药采用现代生物技术人为创造条件,借助微生物、植物或动物来生产所需的医药品过程被称为 4生物技术药物采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物才能被称为 5生物药物生物技术药物与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为PPT复习题 第二章基因工程制药 1、简述基因工程制药的基本程序。P16 2、说明基因工程技术用于制药的三个重要意义。P15第一段第一行 3、采用哪两种方法来确定目的cDNA克隆?P18(7目的基因cDNA的分离和鉴定 )①核酸探针杂交法 用层析法或高分辨率电泳技术(蛋白质双向电泳技术或质谱技术)分离出确定为药物的蛋白质,氨基酸测序,按照密码子对应原则合成出单链寡聚核苷酸,用做探针,与cDNA文库中的每一个克隆杂交。这个方法的关键是分离目的蛋白, ②免疫反应鉴定法(酶联免疫吸附检测) 4、说明用大肠杆菌做宿主生产基因工程药物必须克服的6个困难。 ①原核基因表达产物多为胞内产物,必须破胞分离,受胞内其它蛋白的干扰,纯化困难; ②原核基因表达产物在细胞内多为不溶性(包含体, inclusion body),必须经过变性、复性处理以恢复药物蛋白的生物学活性,工艺复杂; ③没有翻译后的加工机制,如糖基化,应用上受到限制; ④产物的第一个氨基酸必然是甲酰甲硫氨酸,因无加工机制,常造成N-Met冗余,做为药物,容易引起免疫反应; ⑤细菌的内毒素不容易清除; ⑥细菌的蛋白酶常常把外源基因的表达产物消化; 5、用蓝藻做宿主生产基因工程药物有什么优越性? 蓝藻:很有前途的药物基因的宿主细胞 ①有内源质粒,美国Wolk实验室已构建1200种人工质粒,可用做基因载体。 ②载体转化蓝藻不需要诱发感受态就可以做到; ③外源基因产物不形成包含体,分离与纯化工艺可以大大被简化; ④可以直接食用,等于直接口服药物 6、结合pBG-2说明选择用于E. coli 细胞宿主中的载体的6项原则。 P23 与pBV220优点类似,原则P22 7、简述基因工程菌中质粒不稳定的两个指标?P32如何计算质粒的稳定性?P33质粒稳定

2018年扫黑除恶专项斗争应知应会知识题库及答案

2018年扫黑除恶专项斗争应知应会知识题库及答案一、全国扫黑除恶专项斗争什么时候开始? 2018年1月23日,中央政法委召开全国扫黑除恶专项斗争电视电话会议,全国扫黑除恶专项斗争开始。 二、扫黑除恶专项斗争的“总蓝图”是什么? 全国扫黑除恶专项斗争自2018年1月开始,至2020年底结束,为期3年。 2018年治标。启动,打掉一批涉黑涉恶组织,惩处一批黑恶势力“保护伞”,黑恶势力违法犯罪突出问题得到有效遏制。 2019年治根。攻坚,对已侦破的案件循线深挖、逐一见底,使人民群众安全感、满意度明显提升。 2020年治本。建立健全长效机制,取得扫黑除恶专项斗争压倒性胜利。 三、扫黑除恶专项斗争的基本原则是什么? 1.坚持党的领导、发挥政治优势 2.坚持人民主体地位、紧紧依靠群众 3.坚持综合治理、齐抓共管 4.坚持依法严惩、打早打小 5.坚持标本兼治、源头治理。 四、扫黑除恶专项斗争的重大意义是什么? 1.事关社会大局稳定和国家长治久安

2.事关人心向背和基层政权巩固 3.事关进行伟大斗争、建设伟大工程、推进伟大事业、实现伟大梦想 五、扫黑除恶专项斗争打击的重点是什么? 1.威胁政治安全特别是政权安全、制度安全以及向政治领域渗透的黑恶势力 2.把持基层政权、操纵破坏基层换届选举、垄断农村资源、侵吞集体资产的黑恶势力 3.利用家族、宗族势力横行乡里、称霸一方、欺压残害百姓的“村霸”等黑恶势力 4.在征地、租地、拆迁、工程项目建设等过程中煽动闹事的黑恶势力 5.在建筑工程、交通运输、矿产资源、渔业捕捞等行业、领域,强揽工程、恶意竞标、非法占地、滥开滥采的黑恶势力 6.在商贸集市、批发市场、车站码头、旅游景区等场所欺行霸市、强买强卖、收保护费的市霸、行霸等黑恶势力 7.操纵、经营“黄赌毒”等违法犯罪活动的黑恶势力 8.非法高利放贷、暴力讨债的黑恶势力 9.插手民间纠纷,充当“地下执法队”的黑恶势力 10.组织或雇佣网络“水军”在网上威胁、恐吓、侮辱、诽谤、滋扰的黑恶势力

南车株研所笔试题目及答案

2012春季招聘南车株洲所机械类笔试题目 1.装配方法:完全互换法装配;分组装配;修配法;调整法。 2.硬度测试法:塑料洛氏硬度测试,邵氏硬度测试,金属洛氏硬度,金属布式硬度,金属 维氏硬度,显微维氏硬度。 3.构件承载能力的衡量指标:强度,刚度,稳定性 4.滚动轴承内外的配合:外圈过盈配合,基轴制;内圈是过盈配合,基孔制。 5.带轮的张紧方法:定期张紧,自动张紧,采用张紧轮。 6.锻造时最高温度叫始锻温度停止锻造温度分别叫什么叫终锻温度 7.轴采用何种热处理方法:调质处理(淬火加高温回火,既有较高的强度极限和屈服极限, 又有较高的韧性,具有较好的综合性能) 8.几何形状误差的种类:形状误差分为,直线度,圆度,平面度,圆柱度,线轮廓度,面 轮廓度;几何误差:平行度,垂直度,位置度 9.丰田式生产管理的核心:精益生产:核心思想是把传统的推动生产转为拉动生产,从而 建立起具有高度灵活性、高效率的生产系统。 10.塞规测量的原理如果通规能够通过,则孔的尺寸大于最小极限尺寸,若止规不能通过, 则孔的尺寸小于最大极限尺寸。卡规的测量的原理:若通规能够通过,则轴径小于最大极限尺寸,若止规不能通过,则轴径大于最小极限尺寸。 11.回火的概念回火是将工件重新加热到AC1以下某一温度,保温一段时间,然后取出以 一定方式冷却下来目的:消除内应力获得较好的力学性能。 按照基准统一原则选用精基准的优点能用于多个表面的加工及多个工序的加工,可以减少因基准变换带来的误差,提高加工精度。此外,还可以减少夹具的类型,减少设计夹具的工作量。制图中如何选用设计基准首选大的基准面,重要的尺寸为设计基准 常见的铸造缺陷:气孔,粘砂,夹砂,冷隔和浇不足。 12.Homework has never been terribly popular with students and even many parents, but in recent years it has been particularly scorned. School districts across the country, most recently Los Angeles Unified, are revising their thinking on his educational ritual. Unfortunately, L.A. Unified has produced an inflexible policy which mandates that with the exception of some advanced courses, homework may no longer count for more than 10% of a student’s academic grade. 13.This rule is meant to address the difficulty that students from impoverished or chaotic homes might have in completing their homework. But the policy is unclear and contradictory. Certainly, no homework should be assigned that students cannot do without expensive equipment. But if the district is essentially giving a pass to students who do not do their homework because of complicated family lives, it is going riskily close to the implication that standards need to be lowered for poor children. 14.District administrators say that homework will still be a pat of schooling: teachers are allowed to assign as much of it as they want. But with homework counting for no more than 10% of their grades, students can easily skip half their homework and see vey little difference on their report cards. Some students might do well on state tests without completing their homework, but what about the students who performed well on the tests and did their homework? It is quite possible that the homework helped. Yet rather than empowering teachers to find what works best for their students, the policy imposes a flat, across-the-board rule.

稳定细胞株筛选

稳定株构建 FAQ 转自微博思路迪慢病毒包装 1,什么是瞬时转染和稳定转染? 答:瞬时转染:顾名思义,外源片段的表达时间短暂。这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低,所以以染色体外(episomal)形式存在,不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量,所以起初转染的质粒拷贝数极高。这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程,且无法在这个系统上实现可诱导表达。稳定转染:是相对瞬时转染而言,进入细胞的质粒整合入细胞基因组中,并能随细胞分裂稳定传递下去。在这个系统中,质粒表达稳定,拷贝数低,且能实现诱导表达。稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法,只是对瞬时转染的细胞进行筛选,得到稳定整合的细胞株。稳定整合的几率因基因传递的方法而异,跨度可以从10-8到10-1。因此,对于有的转染方法,比如化学试剂介导的转染,其整合几乎可以忽略不计。质粒载体整合的位点并不是完全随机分布,依据不同的基因传递方法,呈现不同的靶向倾向性,所以是一种半随机整合。不同基因传递方法对质粒稳定表达的影响见表XXXX。 2,设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些? ?答:稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有: ?1),外源插入片段的拷贝数。多数情况下,低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。 ?2),整合的几率,这不仅决定了稳定株筛选的难易程度,而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。 ?3),整合位点的转录活跃度,决定了稳定株中外源片段的表达质量。最理想的状况是单拷贝,但转录活性比较高。 ?4),整合后的稳定性。不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性,有些区域易发生重组或者丢失,从而导致稳定株再次丢失的情况。 ?5),最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因,所以实验时通过使用混合稳定株, 或者对多个单克隆稳定株进行比较,可以帮助研究人员获得更精确的实 验数据。 3,什么时候需要稳定细胞株? ?答:以下实验,构建稳定细胞株而不是瞬时转染更能满足实验要求:

社区扫黑除恶答题问卷及答案

2019社区扫黑除恶答题问卷及答案 01 “扫黑除恶”斗争是哪一级部署的? 是党中央部署的。 02 “扫黑除恶”斗争开展几年? 开展三年。2018、2019、2020共三年。 03 “扫黑除恶”斗争的目标是什么? 让人民群众安全感、满意度明显提升;让黑恶势力违法犯罪特别是农村涉黑涉恶问题得到根本遏制;让涉黑涉恶治安乱点得到全面整治,重点行业、重点领域管理得到明显加强;让社会基层组织建设水平明显提升;让黑恶势力“保护伞”得以铲除,社会环境明显净化,基层社会治理能力明显提升;让涉黑涉恶违法犯罪防范打击长效机制更加健全,扫黑除恶工作法治化、规范化、专业化水平进一步提高。 04 “扫黑”与“打黑”有什么区别? “打黑”更多是从社会治安角度出发,强调点对点打击黑恶势力犯罪。“扫黑”是从夯实党的执政根基、巩固执政基础、加强基层政权建设、维护国家长治久安的角度,在更大范围内,更全面、更深入的扫除黑恶势力,不但要打击犯罪,还要打击违法行为。“扫黑”更加重视综合治理、源头治理、齐抓共管。 05

“扫黑除恶”斗争主要打击哪几类“黑恶”势力? 重点打击12类“黑恶”势力:1、威胁政治安全特别是制度安全、政权 安全以及向政治领域渗透的黑恶势力;2、把持基层政权、操纵破坏基层换届选举、垄断农村资源、侵吞集体资产的黑恶势力;3、利用家族、 宗族势力横行乡里、称霸一方、欺压残害百姓的“村霸”等黑恶势力; 4、在征地、租地、拆迁、工程项目建设等过程中煽动闹事的黑恶势力; 5、在建筑工程、交通运输、矿产资源、渔业捕捞等行业、领域,强揽工程、恶意竞标、非法占地、滥开滥采的黑恶势力; 6、在商贸集市、批发市场、机场车站、旅游景区等场所欺行霸市、强买强卖、收保护费的市霸、 行霸等黑恶势力;7、操纵、经营“黄赌毒”等违法犯罪活动的黑恶势力; 8、非法高利放贷、暴力讨债的黑恶势力;9、盗掘古墓葬以及倒卖、走 私文物的黑恶势力;10、插手民间纠纷,充当“地下执法队”的黑恶势力;11、境外黑社会入境发展渗透以及跨国跨境的黑恶势力;12、黑 恶势力“保护伞”。 06 什么样的组织是黑社会性质的犯罪组织? 黑社会性质的组织有四个方面的特征:①形成较稳定的犯罪组织,人数 较多,有明确的组织者、领导者,骨干成员基本固定;②有组织地通过 违法犯罪活动或者其他手段获取经济利益,具有一定的经济实力,以支持 该组织的活动;③以暴力、威胁或者其他手段,有组织地多次进行违法犯 罪活动,为非作恶,欺压、残害群众;④通过实施违法犯罪活动,或者 利用国家工作人员的包庇或者纵容,称霸一方,在一定区域或者行业内, 形成非法控制或者重大影响,严重破坏经济、社会生活秩序。 07 什么是“恶势力”? 《刑法》这样解释:经常纠集在一起,以暴力、威胁或者其他手段,在一 定区域或者行业内多次实施违法犯罪活动,为非作恶,欺压百姓,扰乱经济、社会生活秩序,造成较为恶劣的社会影响,但尚未形成黑社会性质组

稳定转染步骤

稳定转染细胞株的制备 带质粒的大肠杆菌的激活和扩增 (1)取-80℃冻存的带有质粒的大肠杆菌在室温解冻,或者放置37℃恒温水中约2min,待冰完全融解即可使用。 (2)LB培养基的制备按照如下配方配制 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L 酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 氯化钠(NaCl) 10g/L 用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4,高温高压灭菌后室温保存,使用时加入氨苄青霉素(浓度为0.1mg/ml) (3)LB固体培养基的制备到200mlLB液体培养基加入3g琼脂混匀后高温高压灭菌,待冷却至约55℃时在无菌条件下加入氨苄青霉素摇匀,分别倒入6-7个培养皿中,用封口膜封边,并倒置放于4℃保存。 (4)扩增用接种环按照四线法将解冻后的工程菌涂布接种到LB固体培养基上,待凉干后,用封口膜将培养皿封闭,然后倒置于37℃恒温箱中培养过夜(不能摇晃),根据情况可适当延长培养时间。观察培养基上的单克隆工程菌,待长出后,用接种环将一个单克隆工程菌转移接种到10mlLB液体培养基中,放入掁荡培养箱中37℃摇荡培养过夜,第二天观察,待LB液体培养基变浑浊后,4℃冰箱保存,以待进行下一步质粒的提取。 质粒的提取 准备质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液 (1)取75ml扩增变浑浊的LB液体培养基置于试管中。 (2)5,000×g离心10分钟,弃去上清液,将试管倒置在滤纸上空干。 (3)取出质粒提取盒,用3ml细胞重悬浮液对试管中的细胞进行重悬浮。 (4)加入3ml细胞裂解液,轻轻摇晃试管混匀,室温下孵育3分钟,产生白色絮状沉淀,然后加入5ml中和液混匀 (5)将Clearing Column(兰色)放入一新的50ml离心管,将上述试管中裂解后的液体倒入兰管,孵育2分钟,1500×g离心5分钟,效果不佳的话可再离心一次,离心液待用。

销售话术十问十答

销售话术“十问十答” 接触环节 一、接触话术 先生您好!请问有什么可以帮到您?我行目前正代理一款非常好的产品,在整个广州市场月销量上亿,很多客户都购买了,耽误您三分钟时间,我给你简单介绍一下吧! 二、客户:“没空”“没兴趣”“没钱“ 其实多了解一些产品,多了解一份投资手段的资讯,对您也是有好处的,您说是吗?况且这款产品来自目前国内最热门的投资区域,享受国家多项优惠政策,又不耽误您太多时间,听一听没损失的!说明以及拒绝处理环节 三、一句话讲海利 购买这款产品无需任何费用,每月复利结算一次,自去年12月份起至目前,结算利率一直保持在5.05%的高位水平,选择持有时间可长可短,3-10年自主规划,领取灵活方便,而且还有意外保障功能。 四、客户:“与其它产品比较有何优势?” 海利年年免四费:初始费用、保单管理费、风险保障费、满三年后的退保/部分领取手续费。账户公开透明,每月复利结算,近五个月结算利率都保持在5.05%的高位水平。拥有疾病及意外保障功能,自然灾害不免除。还拥有多数产品没有的持续奖励功能:持有时间越长,获利越大,从第6保单年度开始,每年奖励账户价值的0.5%,一直奖励到第十个保单年度,且第十年末再奖励账户价值的2%,所有奖

励部分均进入账户,继续每月复利生息。 五、客户:“是哪家公司的产品”“没听过前海”“新公司不可靠” 前海人寿总部设在深圳前海特区,是连接香港与内地的“绿色通道”,是国家重点建设区域。习近平主席上任离京考察第一站就来到前海,非常重视前海的发展,政府特别给到了前海一系列的优惠政策。目前许多大型企业、世界500强都争相入驻前海特区,前海人寿就是第一家进入前海特区的金融机构。而前海的开业巨献产品海利年年上市不到半年时间,就获得中国保险协会颁发的“最具投资价值产品奖”。 六、客户:“公司的投资能力如何”“公司投资效益怎样” 国务院批准了一系列优惠政策发展前海特区,其中就包括:第一、对符合准入条件的企业按15%的税率征税,您知道内地的企业所得税是在25%-33%的;第二、支持人民币跨境双向贷款,前海特区毗邻香港,而香港是以简单低税闻名世界,是全球经济中心之一。贷款利率低,税收又有优惠,大大降低了资金运作成本,所以有足够的空间保证客户的利率。目前前海还拿到了股权和不动产投资双牌照,这是平安、国寿等大型保险公司引以为豪的优势,可前海人寿作为一家新成立的公司也能成功拿下,这足以证明公司的实力。 前海人寿成立一年,初始注册资本金为10亿元,马上将启动新一轮增资,至20亿元,3年内将注资至100亿。目前我司在深圳稳占市场第一的位置,而在整个广东目前的业绩也居于三甲之列。公司去年的投资收益率高达6.32%,在整个保险行业中处于领先水平。刚刚发生的雅安大地震,前海向灾区人民捐赠了300万元人民币,对于

十问十答

1.什么是收缩压和舒张压 心室收缩,血液从心室流入动脉,此时血液对动脉的压力最高,称为收缩压(SBP)。心室舒张,动脉血管弹性回缩,血液仍慢慢继续向前流动,但血压下降,此时的压力称为舒张压(DBP)。也就是说,心脏泵出血液的时候形成的血压就是收缩压,也叫高压。在血液流回心脏的过程中产生舒张压,也叫做低压。 2.引起脉压差过大或减小的常见疾病有哪些 (1)、引起脉压差过大的常见疾病:主动脉瓣关闭不全、主动脉硬化、甲状腺机能亢进、严重贫血、风湿性心脏病、梅毒性心脏病、部分先天性心脏病与高血压心脏病、细菌性心内膜炎等。例如:老年人由于主动脉及其他大动脉粥样硬化、动脉壁的弹性和伸展性降低,出现单纯性收缩期高血压,舒张压正常,脉压差增大。 (2)、引起脉压差减小的常见疾病:心包大量积液、缩窄性心包炎、严重的二尖瓣狭窄、主动脉瓣狭窄、重度心力衰竭、末梢循环衰竭、休克以及由于肥胖、血液粘稠度增高或合并糖尿病、高脂血症等。 3.正常人的血压是如何变化的 血压的高低不仅与心脏功能、血管阻力和血容量密切相关,而且还受到神经、体液等因素的影响,年龄、季节、气候和职业的不同,血压值也会有所不同,运动、吃饭、情绪变化、大便等均会导致血压的升高,而休息、睡眠则会使血压下降。 一般正常人每日血压波动在20~30mmHg范围内,在无降压药的影响下睡眠能导致血压下降20%左右(女性更明显),血压最高点一般在上午9~10时及下午4时至晚上8时,血压最低点在午夜1~3时。老年高血压患者在血压最高点和最低点持续的时间较长,形成平台。 精神刺激、情绪变化如兴奋、恐惧等常可导致收缩压的明显上升,运动也可使收缩压明显增加,特别是剧烈运动常使收缩压上升达180~200mmHg,运动停止后血压可下降。环境温度升高如洗温水浴等可使舒张压降低,而温度降低如冬天洗冷水浴等可使收缩压升高。 4.怎样检查才知道是不是患冠心病? 如果怀疑冠心病那么就应该做64排CT,无创性的,做一个筛选,如果有问题那么就应该考虑做冠脉造影,冠脉造影可以直接的显示整个冠脉,清楚的看到冠脉病变的血管支数、狭窄程度和长度及病变特征,可以直观冠脉的全部情况,为进一步制定最佳的方案、选择治疗的方法(手术、介入、药物)提供最科学的依据并可评估风险。冠脉造影检查是目前唯一能直接观察冠状动脉形态的方法,号称冠心病诊断的“金标准”。 5.什么是冠心病? 冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞,造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病,常常被称为“冠心病”。 6.冠心病分几个类型? 无症状心肌缺血(隐匿性冠心病)、心绞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭(缺血性心脏病)和猝死5种临床类型。临床中常常分为稳定性冠心病和急性冠状动脉综合征。 7.冠心病病人为什么要防止便秘? 便秘时.由于大便变干,粪块阻塞,可以造成腹胀、腹痛、烦躁不安等,这些均可增加心脏耗氧量,加重心脏的负担,持别是由于大便秘结、排便过度用力.可使心肌耗氧量急剧升高,极易诱发心绞痛.甚至导致心肌梗塞、动脉瘤和室壁瘤的破裂。有些病人可诱发严重的心律失常。冠心病人因排便造成症状复发甚至心肌梗塞屡见不鲜。因此,冠心病人,尤其是心肌梗塞病人.要特别注意预防便秘。预防便秘,要注意如下几点:(1)平常应多饮水;(2)养成定时排便的习惯;(3)多吃水果、蔬菜,特别是香蕉;适当进食粗粮亦有利于通便;(4)在急性心肌梗塞的一个月内,可每日使用泻药,以利大便。

稳定株构建 FAQ

稳定株构建FAQ(慢病毒包装) 1,什么是瞬时转染和稳定转染? 答:瞬时转染:顾名思义,外源片段的表达时间短暂。这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低,所以以染色体外(episomal)形式存在,不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量,所以起初转染的质粒拷贝数极高。这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程,且无法在这个系统上实现可诱导表达。稳定转染:是相对瞬时转染而言,进入细胞的质粒整合入细胞基因组中,并能随细胞分裂稳定传递下去。在这个系统中,质粒表达稳定,拷贝数低,且能实现诱导表达。稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法,只是对瞬时转染的细胞进行筛选,得到稳定整合的细胞株。稳定整合的几率因基因传递的方法而异,跨度可以从10-8到10-1。因此,对于有的转染方法,比如化学试剂介导的转染,其整合几乎可以忽略不计。质粒载体整合的位点并不是完全随机分布,依据不同的基因传递方法,呈现不同的靶向倾向性,所以是一种半随机整合。不同基因传递方法对质粒稳定表达的影响见表XXXX。 2,设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些? 答:稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有: 1),外源插入片段的拷贝数。多数情况下,低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。 2),整合的几率,这不仅决定了稳定株筛选的难易程度,而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。 3),整合位点的转录活跃度,决定了稳定株中外源片段的表达质量。最理想的状况是单拷贝,但转录活性比较高。 4),整合后的稳定性。不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性,有些区域易发生重组或者丢失,从而导致稳定株再次丢失的情况。 5),最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因,所以实验时通过使用混合稳定株,或者对多个单克隆稳定株进行比较,可以帮助研究人员获得更精确的实验数据。

缺失株构建关键步骤

培养基配制: 1)LB 肉汤:0.5% NaCl,0.5%酵母粉,1%胰蛋白胨 2)LB 琼脂固体培养基:0.5% NaCl,0.5%酵母粉,1%胰蛋白胨,1.5%琼脂粉(氨苄平板、庆大氨苄双抗平板) 3)10%蔗糖LB 琼脂固体培养基:0.5%酵母粉,1%胰蛋白胨,1.5%琼脂粉,10% 蔗糖溶液(注:此培养基中不能加入NaCl; 300ml 培养基中加入225ml 水,高压后加入75ml 40%蔗糖,倒平板) 本步骤可用15%蔗糖筛选,放30度过夜。 缓冲液配制: X-gal:母液20mg/ml,终浓度20μg/ml 此步构建PWM91菌株时可通过蓝白斑初步筛选。选取白色菌落作PCR 接合转移 1)将鉴定阳性的重组克隆菌SM10λpir(供体菌)、霍乱弧菌株(受体菌) 分别接种于5ml 的LB 肉汤中,37°培养过夜,次日以1:50 的比例接种至另一新鲜LB 中,37°振荡培养3h。 2)供体菌和受体菌各取0.5ml 菌液混合,6000rpm 离心5min,弃上清。取1mlLB 悬菌后再次离心,弃上清。用100μl LB 悬菌。 3)将菌液点到经紫外线照射灭菌并平贴于LB 平板上的0.45μm 的微孔滤膜上,菌液吸收后在37°温箱中培养6h。 4)用LB 冲洗滤膜,收集洗液,离心后沉淀重悬于200μl LB 中,涂庆大/氨苄双抗培养基中,37 度培养过夜。 5)在平板上长出的菌落转接一次庆大/氨苄双抗培养基中,37 度培养过夜。进 行 ●本试验所用抗生素为氯霉素5ug/ml;氨苄200ug/ml;庆大霉素0.5U/ml 由于 菌落长的较慢,需要48小时才能长出。 ●如果用庆大霉素基础培养基、氯霉素5ug/ml;氨苄200ug/ml 菌落也需要48 小时才能长出,并且此培养基对大肠杆菌有很好的抑制生长作用。只是涂平板时要多涂一些菌。 ●摸索后经验,1mlLB洗膜后,取10ul直接涂板,能得到单克隆。 再次筛选。 蔗糖筛选 挑取至少10 个转导成功的转化子混合接种于无抗LB 肉汤(或无抗得LA平板划线,此步骤不能省略,因为二次重组在此步骤发生)中,37℃,200rpm 培养至对数中期,将菌液稀释1000 倍后取150μl涂布于含10﹪蔗糖的LB 平板上,30℃ 培养至出现单菌落。挑取单克隆菌落分别涂布于阴性和氨苄抗性的LB 平板上,30℃培养,挑选能在阴性LB 平板生长但不能在氨苄抗性LB 平板上生长的单克隆菌进行PCR 鉴定,引物cpxR-D-F1/ cpxR-D-R2。

稳定转染细胞系的一般建立方法

转染克隆的G418筛选和分离 对于需要建立某些基因已经整合到染色体DNA(通过稳定或永久转染)的细胞系来说,理想的是使用选择标记,通常也是必要的。虽然有许多标记可利用,但G418(氨基糖苷类抗生素)为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。G418是一种氨基糖苷类似物,在结构上与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似,它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。因此在哺乳动物细胞中表达细菌APH(氨基糖苷类磷酸转移酶)基因将产生G418的解毒作用。 这一程序提供了建立G418选择条件的一般性指导,特殊条件由研究者个人决定。1.建立死亡曲线,确定最佳筛选浓度(参考建立方法见附录); 2.细胞铺板:转染后24小时将贴壁的细胞传代(传代时,注意通过在显微镜下观察,控 制细胞密度,不能使细胞太密集,应该少于生长表面的50%,参考为20%-30%)至15cm 培养皿,加入15~20ml培养基(DMEM,含血清)进行培养; 3.用最佳筛选浓度的G418对细胞进行筛选:铺板完成后,再过24小时,抗性表达,用最 佳筛选浓度的G418进行筛选(对于Hela细胞,一般筛选终浓度为800ug/ml)。具体操作是去除旧的培养基,用PBS洗一次,将含有浓度为800ug/ml(以Hela为例)的培养基15~20ml加入培养皿内即可; 4.换液:每日及时观察细胞,根据培养基的颜色和细胞生长情况,及时更换相同浓度 (800ug/ml)的培养基,大概持续筛选一周左右,直至空白对照组(未转染组)细胞死亡大部分(至少30%以上); 5.撤药维持阶段:待空白组细胞大部分死亡后,将实验组(转染组)进行换液,此时所用 培养基含G418的终浓度为200ug/ml(维持浓度),维持生长(若细胞仍有死亡,需要继续降低药的浓度,参考为50-100ug/ml),直至筛选克隆可见为止(大约2~3天); 6.分离克隆以获得最大数量细胞(提高克隆成活可能性),减少单个克隆受其他细胞污染 的机会。具体操作是:a.用PBS洗含有克隆的培养物,圈出欲分离的克隆。从培养皿中除去液体,准备24孔板收集克隆;b.从培养皿中用牙签或者棉棒(经过高压)挑取已分离出的克隆(具体操作是先用棉棒蘸一下胰酶,再蘸一下克隆);c.在24孔板的一个孔中(事先已加入完全培养基,不含G418)剧烈摇动牙签,使细胞沉于孔中,继续挑取下一个克隆; 7.CO2孵箱,温育细胞约两小时; 8.两小时后,镜检培养皿,确定细胞是否附着。如果已经附着,用新鲜完全培养基(含 50ug/ml G418)更换24孔板培养基,除去残留的胰蛋白酶,继续培养直到培养物长满; 9.一旦小量培养物长满,转接到大的培养皿(通常先是6孔板),用50ug/ml的新鲜完全 培养基维持培养,然后与同样类型的其他细胞一样处理即可。

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