噬菌体分离
部分菌株对应的噬菌体分离过程步骤：
1、噬菌体分离
(1) 以新鲜鸽粪4g 加入100ml 普通液体培养基内，放入37 ℃温箱培养24h。(2) 次日从中取出10ml70 ℃加热30min ,离心2000r/ 10min ,上清液用滤器过滤后保存于4 ℃冰箱备用。(3) 在普通琼脂平板底面分别注明1、2、3 号。(4)在1 号平板接种事先培养好的6h 幼龄菌乙型副伤寒杆菌一接种环；2 号平板接种幼龄菌福氏痢疾杆菌一接种环;3 号平板接种幼龄菌大肠杆菌一接种环,各平板的细菌密集涂布于琼脂平板表面。(5) 再用无菌接种环取鸽粪培养滤液一接种环,分别滴加于3 个已接种细菌的平板中央,放入37 ℃温箱孵育24h。
2、噬菌体的分离和鉴定
先后从农贸市场采集各类海产品158 份, 分别用15 株假单胞菌作指示菌, 共分离到27 株噬菌体, 分离率为1711%。检出的噬菌体经实验室反复增殖、裂解等鉴定试验, 从中精选出9 株裂解力较强, 生物学性状较典型的噬菌体, 分别用双层琼脂法作单斑纯化培养。这9 株噬菌体的噬菌斑圆形透明, 边缘有的整齐有的稍不整齐, 直径均在110～210 mm; 在电镜下的形态可见有头部和尾部, 均呈蝌蚪状;增殖液的效价均可达10829pfu?m l。
3、噬菌体的分离
在有指示菌的双层琼脂平板上逐格滴加备用的待检噬菌体液,进行交叉裂解试验,即每一株菌均被所有待检噬菌体液逐一滴加。待平皿干后,置37 ℃培养过夜。若有相应的噬菌体存在,即可在平皿上出现裂
解噬斑(即为阳性) ,不裂解者为阴性。对分离到的每一噬菌体均经单噬斑分离纯化3 次以上,增殖后置4 ℃冰箱保存。
4、大连近海河流弧菌Ⅱ噬菌体的分离与研究
4.1 材料与方法
4.2 菌株
噬菌体分离所用的指示菌为河流弧菌29301 , 用于宿主范围测定的菌株共8 株: 河流弧菌Ⅱ9302 , 9401 , 9402 , 9403 , 9404 , 9501 , 9502 及9503 均为本实验室保存。
4.3 培养基
培养河流弧菌及噬菌体分离所用的培养基为海水胰蛋白胨培养基。其中: 胰蛋白胨10g , 酵母膏5g , 陈海水1000mL , pH712～715 。制作底层培养基时, 加琼脂15g ; 制作上层培养基时, 加琼脂7g。
4.4 样品的采集和噬菌体的分离
1996、1997 年两个夏季, 从大连市水产养殖公司所属皱纹盘鲍养殖区的不同地点采集海水和海底淤积物, 每次采集10 个样品, 每个样品为同一地点采集的3 份不同水样或海底淤积物混合而成。为了分离噬菌体, 取海底淤积物100g , 加入等量海水, 充分振荡30min , 静置, 过滤, 取上清液100mL 加入50mL 3 倍浓缩的海水胰蛋白胨及2mL 浓度为1012个/ mL 的河流弧菌2 菌悬液, 30 ℃培养过夜, 以促进噬菌体的增殖。海水样品过滤后按上述方法直接富集。经富集后的培养液加入1/ 10 的氯仿, 30 ℃静止1h , 于4000r/ min 离心20min , 取上清液用于双层琼脂法分离噬菌体。为了纯化噬菌体, 挑
取单斑连续传代, 重复进行 5 次以上, 选择平板上所有噬菌斑形态和大小基本一致的材料,进行下一步研究。
使用混合宿主菌对污水样品进行初步的扩增，提高了分离到噬菌体的机会。
线粒体的分离
线粒体的分离
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实验三线粒体的分离、超活染色与观察 一、实验目的 1、学习差速离心法分离动、植物线粒体技术。 2、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。 3、学习细胞器的超活染色技术。 二、实验原理 利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，可用来研究生活状态下的细胞形态、结构和生理、病理状态。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以活体染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体的染色各有专一性。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 三、实验材料与方法 1、材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋葱鳞茎内表皮细胞。 2、主要试剂和仪器：Ringer 溶液，10%、1/3000中性红溶液，1%、1/5000詹纳斯绿B 溶液；分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，0.3mol/L 甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿B染液，生理盐水，0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，固定液，姬姆萨染液，1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）。温箱，冰箱，冷冻控温高速离心机（或普通高速离心机），高速离心机，显微镜，恒温水浴锅，解剖盘，玻璃匀浆器，剪刀、镊子，双面刀片，载玻片，凹面载玻片，盖玻片，漏斗，小烧杯，表面皿，吸管，牙签，吸水纸，纱布，瓷研钵，尼龙织物。 四、实验方法 （一）大鼠肝线粒体的分离 1、制备大鼠肝细胞匀浆。实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0－4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0－4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组
噬菌体的分离与纯化
大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化 【实验目的】 1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。 2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。 3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。 4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。 5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。 【实验原理】 1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。 2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是： （1）培养寄主细胞（大肠杆菌）； （2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）； （3）将样品内的细胞进行富集培养； （4）制备噬菌体裂解液； （5）检测噬菌体是否存在； （6）噬菌体的纯化及效价测定。 3.培养基的配制（配方）与灭菌 （1）3×牛肉膏蛋白胨培养液： 牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4. （2）牛肉膏蛋白胨培养液： 牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4. （3）牛肉膏蛋白胨固体培养基： 牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。 （4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基： 牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。 封好做好标记于121℃灭菌20min备用 【实验材料及器皿】 1.菌种：大肠埃希氏菌。 2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水 3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。 4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。 【实验方法步骤】 第一周：实验方案的讨论与完善 第二周：培养基的配制及相关实验器材的灭菌 牛肉膏蛋白胨固体培养基100ml，并取三个试管各加入3—4ml以搁斜面保留菌种 3X牛肉膏蛋白胨培养液50ml，装小三角瓶内 牛肉膏蛋白胨培养液100ml分装到5个大试管中，每管9ml，并依次标记10-5—10-1，剩余的装试管做好标记 离心管12个（包好） 无菌水2管（3—4ml每管）
噬菌体的分离与纯化优化版
噬菌体的分离与纯化实验用具及材料 1.菌种：大肠杆菌 2.试剂：氯仿 3.培养基： 1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6g， NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌； 2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g， NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭 菌； 3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入 1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌； 4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入 0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌 4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌 过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴 锅，离心机等 实验步骤 1.噬菌体的分离 （1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置 37℃培养过夜。/取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下 菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混 合后置37℃振荡培养12～24h。 （3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一 无菌离心管中。 （4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯 仿，稍作混合，备用。 （5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养 基表面上。待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上， 置37℃培养过夜。如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明 或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。 2.噬菌体的纯化 （1）取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀； （2）取上层琼脂培养基溶化并冷却至45℃（可预先溶化后置45～55℃水浴锅内保温备用），加入0.2mL上述噬菌体与细菌的 混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置37℃培 养12~24h； （3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）。此过程制备的裂解液中往往 有多种噬菌体，需进一步纯化； （4）纯化时，通常采用接种针在单个噬菌斑中刺一下，蘸取少许噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中，置37℃振荡培
噬菌体分离
变形杆菌（大肠杆菌）噬菌体生理特性研究 1.变形杆菌、大肠杆菌的纯化 划线分离纯化 2. 变形杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体分离 器材： 菌种：变形杆菌、大肠杆菌 噬菌体样品：阴沟污水（100ml），土壤 培养基：3倍牛肉膏蛋白胨培养液（4瓶，每瓶50ml），牛肉膏培养液，牛肉膏蛋白胨半固体培养基（倒上层用），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（倒底层用） 仪器：离心机，细菌滤器，抽滤装置，恒温水浴锅，无菌涂布器，无菌吸管等 步骤： a.培养大肠杆菌至对数期600nm（OD值0.8左右） b.增殖噬菌体样品：取上述大肠杆菌培养液6ml于盛有50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，后加入污水样100ml（离心并过滤除菌），继续37℃摇床振荡培养12-14h，以增殖噬菌体。 c.制备裂解液：将以上培养液3000r/min离心30min，将上清液过滤除菌，取100ml 滤液及5ml大肠杆菌液加入50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃培养12-18h 进行噬菌体富集。 d.将以上富集液3000r/min离心30min后，取上清液10mL加入5mL 3×倍牛肉膏蛋白胨培养液及相应宿主菌液1mL，室温下放置1h，37℃ 120rpm振荡培养 3.5h。 e.收集噬菌体：将上述培养液于4℃下12,000g 离心30min，上清液再经微孔滤膜（0.22μm）过滤，滤液即为拟含有相应宿主菌噬菌体的原液。 f.验证噬菌体存在：在大肠杆菌平板上，滴加上述滤液5-7小滴,同时滴加生理盐水作为对照，进行标记，37℃培养18-20h，若出现噬菌斑，则证明滤液中存在噬菌体。 3. 变形杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体纯化 (1)用接种环取菌液一环接种于液体培养基内，再加人0.1ml大肠杆菌悬液，使混合均匀。 (2）取上层琼脂培养基，溶化并冷至48℃（可预先溶化、冷却，放48℃水溶箱内备用）,加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2ml，立即混匀，并立即倒人底层培养基上，混匀，置37℃培养12h。 (3）此时长出的分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，再用接种针在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内。于37℃
实验四 线粒体的分离与观察
实验八线粒体的分离与观察 实验目的 用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。 实验原理 线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的，使能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 I．鸡肝线粒体的分离 实验用品 一、材料 鸡肝脏 二、试剂 1. 生理盐水 2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 3. 0. 25 mol／L蔗糖+0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph7.4）：
DNS-氨基酸的制备和鉴定-
DNS-氨基酸的制备和鉴定 实验目的 1.了解并掌握DNS-氨基酸的制备和鉴定的原理 2.掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法 实验原理 荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-Cl)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-氨基酸再经酸水解可释放出DNS-氨基酸，其反应式如下： 图1：DNS-氨基酸生成反应机理图2：单项层析结果示意图DNS-Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB 法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。 DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，即： 图3：DNS-Cl在pH过高水解产生DNS-OH
在DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH 2 ，即： 图4：DNS-Cl过量产生DNS-NH 2 DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄绿色荧光，而DNS-OH和DNS-NH 2 产生蓝色荧光，可彼此区分开。 DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01ug(相当于10—10mol)。由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 聚酰胺是—类化学纤维原料，由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一C＝O及>NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类<如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。 实验器材 1.聚酰胺薄膜（7×7cm） 2.电吹风一个 3.紫外灯一台 4.点样管（4支） 5.吸管 6.量筒
噬菌体的分离与纯化优化版
噬菌体的分离与纯化优 化版 集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
噬菌体的分离与纯化 实验用具及材料 1.菌种：大肠杆菌 2.试剂：氯仿 3.培养基： O至1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6 g，NaCl 1g，加H 2 200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌； O至2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏 0.9g，NaCl 1.5g，加H 2 100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌； 3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉， 121 ℃20min高压灭菌； 4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉， 121℃20min高压灭菌 4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌过滤器（孔径 0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴锅，离心机等 实验步骤 1.噬菌体的分离
（1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置37℃培养过夜。/取大肠杆菌斜面一支，加4ml 无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。 （2）增殖培养：在盛有10mL 3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混合后置37℃振荡培养12～24h。 （3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经 4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一无菌离心管中。 （4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯仿，稍作混合，备用。 （5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌 液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上。待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，置37℃培养过夜。如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。 2.噬菌体的纯化 （1）取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀； （2）取上层琼脂培养基溶化并冷却至45℃（可预先溶化后置45～55℃水浴锅内保温备用），加入0.2mL上述噬菌体与细菌的混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置37℃培养12~24h； （3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）。此过程制备的裂解液中往往有多种噬菌体，需进一步纯化；
核与线粒体分离提取方案
线虫细胞核和线粒体提取 N2同步化后，转移至培养皿，每皿大约4000条，2 day后到了mid-late L4，day5，day10，day15收集线虫（也有文献选择1、6、12、17day）。初步计划收集10个皿线虫。 1.细胞核分离 细胞核蛋白提取查阅的文献上都没提及是用哪个厂家的试剂盒，只简单说了自己采用的方法，也不是很具体。查到一份Protocol采用蔗糖分离法提取细胞核，此方法开始是用于肝组织(Widnell and Tata 1964)，后来被用于动物软组织(Rickwood et al. 1997)，后来成功用于肌细胞和培养的细胞。 方法如下： 1.在10cm细胞培养皿中培养的细胞系，直到它们达到90％汇合 2.分离当天，吸出培养基，然后用冰冷的PBS清洗细胞。吸出PBS。 3.将培养皿放在冰上，用1 mL PBS将细胞从板上刮掉。转移将细胞加入到冰上的1.5mL离心管中。 4.以10000rpm短暂离心5-10秒。 5.吸掉上清液，并将沉淀物重悬在9个填充细胞体积均质培养基中 6.用Potter-Elvehjem匀浆器将悬浮液均质化，冰上匀6次 7.用棉布过滤匀浆 8.在4℃下以600g离心滤液10分钟。丢弃上清液。用步骤5中一半体积的均匀培养基重悬沉淀。4℃ 600g 离心10分钟。丢弃上清液。 10.将9体积的高渗蔗糖缓冲液加入沉淀。在Potter-Elvehjem匀浆器（5或6冲程）或Dounce均化器在冰上。 11.在4℃下以60,000g-80,000g离心匀浆80分钟。 12.翻转管子去除蔗糖。从管壁擦去剩余的蔗糖，注意不要擦掉细胞核。 核在这个阶段保留其膜。要卸下膜，请执行步骤13。 13.为了除去核膜，将来自步骤12的沉淀重悬含有0.5％Triton X-100的匀浆介质。在4℃下以600g离心10分钟。重复该过程。最后，如果需要，用均质介质洗涤沉淀以除去剩余的TritonX-100。 14.将沉淀物重悬在选择的介质中用于随后的分析。 分离的细胞核可以尝试裂蛋白，再用BCA法检测蛋白浓度。 2.线粒体提取 查阅了文献，线粒体蛋白提取采用的是Qproteome Mitochondria Isolation Kit (Qiagen 37612)，流程如下： 1.将新鲜切除的组织放在冰上，取出适当的大小样品。用1ml 0.9％（w / v）氯化钠溶液洗涤样品。 2.将样品切成约2毫米3片，放入2毫升反应液中管，并加入500μl含蛋白酶抑制剂的裂解液。 3.使用TissueRuptor转子定子使样品均质化，均质器设最低速度转10s。 4.吸取1.5ml含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液加入管中并孵育在4℃摇床上10分钟。 5.在4℃下以1000xg离心匀浆10分钟。 6.小心地清除上清液 7.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中使用1毫升枪头吹打。细胞使用钝头针头和注射器进行破
实验七 氨基酸的分离鉴定
实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。 惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。 展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。 分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 当用滤纸进行分配层析时，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。 不同的氨基酸在一定的条件下，有其一定的Rf值，故可根据Rf值定性鉴定氨基酸，但通常用已知的标准氨基酸层析作对照，本实验就是如此。 ●纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 ●层析溶剂由有机溶剂和水组成 ●物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值） 来表示的： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因
素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、材料与方法 （1）、材料：层析缸；毛细管；喷雾器；培养皿；层析滤纸；正丁醇；冰醋酸；分液漏斗；烧杯；培养皿；赖氨酸；脯氨酸；氨酸；苯丙氨酸；亮氨酸；茚三酮 （2）操作步骤 1. 配置层析液置于密闭的层析缸中。 2．准备滤纸：取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。 3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。干后再点一次。 4．扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20 mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1 cm)。待溶剂上升15―20 cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 5．显色用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。 6．计算各种氨基酸的Rf值。 四、结果与分析
噬菌体的检测
噬菌体的检测 双层琼脂平板法测定噬菌体操作： 器材以及药品： 1.器材：试管及试管塞（已灭菌）、移液枪（200ul以及5ml）以及相应的无菌枪头、90mm 平板（已灭菌）、250ml三角瓶、酒精灯、琼脂粉、分离提纯的噬菌体液以及敏感菌（已经活化好的）。 方法及步骤： 1.配制培养基：LB液体培养基（1000ml水：10g蛋白胨：5g酵母粉：5g氯化钠）、1.5%的固体培养基、0.7%的半固体培养基； 2.倒平板：将1.5%的固体培养基熔化，每个平板倒10-15ml的1.5%固体培养基，然后静置至平板上没有水珠为好，平板数根据实际需要而定； 3.分装0.7%的半固体培养基：将0.7%的半固体培养基加热熔化，然后用5ml的移液枪向每个试管（已灭菌）加入5ml的半固体培养基；试管的数量和上一步平板数是相同的。如果试管很多，防止培养基凝固，可将已分装好的试管放入水浴温度为55℃左右的水浴锅中保温； 4.等到试管中培养基温度降至45 ℃-50 ℃之间（不烫手）时，迅速向试管中加入100ul 敏感菌和100ul的噬菌体液（噬菌体浓度要适当，这样才能看到明显的噬菌斑），摇匀； 5.将摇匀好的该培养基迅速倒入之前已倒有1.5%固体培养基平板中，晃动平板，使其铺满平板，静置； 6.待所有平板倒好后（最好静置2h左右），将其放入30 ℃恒温箱中培养12h左右，即可观察有无噬菌斑。 注：所有操作在酒精灯旁进行！ 噬菌斑效果图
培养噬菌体的方法： 一. 液体培养法 1. 将指定之寄主细菌以液体培养法于适当温度下培养，一般培养16~24小时。 2. 将噬菌体原液100 μl 与寄主细菌悬浮液300 μl均匀混合，静置15分钟使其感染。 3. 将混合液接种至含10 ml新鲜液体培养基的试管中，于适当温度下振荡培养约8~24小 时，培养时间依噬菌体之不同而异。 4. 将培养液移入离心管中，以10,000 rpm (5,000 g)离心10分钟，以沉淀寄主细菌。 5. 将上清液移至新管中，以0.22μm孔径之过滤器(filter)去除残余菌体，即得不含寄 主细菌之噬菌体原液。但因噬菌体原液呈透明状，无法以肉眼直接判断其增殖效果，故应测定其效价以确认增殖培养之成效。 二. 双层琼脂培养法 1. 将指定之寄主细菌以液体培养法于适当温度下培养，一般培养16~24小时。 2. 将噬菌体原液100 μl 与寄主细菌悬浮液300 μl均匀混合，静置15分钟使其感染。 3. 将混合液加入5 ml 冷却至45℃的0.7﹪琼脂培养基中，均匀混合后立即平铺在已倒 好的1.8﹪琼脂培养基平板上。 4. 待平板凝固后移至适当温度之培养箱中，一般培养8~24小时，培养时间依噬菌体之 不同而异。 5. 以上述相同之步骤制作另一不含噬菌体之对照组。 6. 将培养好的平板与对照组比较其澄清度，一般含噬菌体之平板呈澄清状，而仅含寄主 细菌之对照组则呈混浊状。 7. 将含有噬菌体之平板置于-20℃下4~5小时后，取出置于室温下解冻。 8. 将解冻后产生的液体移入离心管中，以10,000 rpm (5,000 g)离心10分钟以沉淀寄主 细菌。 9. 将上清液移至新管中，以0.22 μm孔径之过滤器(filter)去除残余菌体，即得不含寄 主细菌之噬菌体原液。 三. 表面琼脂培养法 1. 将指定之寄主细菌以液体培养法于适当温度下培养，一般培养16~24小时。 2. 将寄主细菌悬浮液3 ml均匀平铺于1.8﹪琼脂培养基平板上，静置2小时。 3. 将多余的寄主细菌悬浮液吸出，再将噬菌体原液0.3 ml均匀涂抹于平板上。 4. 于适当温度下培养约16~24小时，培养时间依噬菌体之不同而异。 5. 取5 ml 新鲜液体培养基加入平板中，以L 形玻棒刮洗下平板表面之菌体。 6. 将刮洗下之液体移入离心管中，以10,000 rpm (5,000 g)离心10分钟以沉淀寄主细菌。 7. 将上清液移至新管中，以0.22 μm孔径之过滤器(filter)去除残余菌体，即得不含寄 主细菌之噬菌体原液。
噬菌体的分离与纯化优化版
噬菌体的分离与纯化优化 版 This manuscript was revised on November 28, 2020
噬菌体的分离与纯化 实验用具及材料 1.菌种：大肠杆菌 2.试剂：氯仿 3.培养基： 1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6g， NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌； 2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g， NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭 菌； 3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入 1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌； 4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入 0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌 4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌 过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴 锅，离心机等 实验步骤 1.噬菌体的分离 （1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置 37℃培养过夜。/取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下 菌苔，制成菌悬液。 （2）增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混 合后置37℃振荡培养12～24h。 （3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一 无菌离心管中。
（4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯 仿，稍作混合，备用。 （5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养 基表面上。待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上， 置37℃培养过夜。如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明 或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。 2.噬菌体的纯化 （1）取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀； （2）取上层琼脂培养基溶化并冷却至45℃（可预先溶化后置45～55℃水浴锅内保温备用），加入0.2mL上述噬菌体与细菌的 混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置37℃培 养12~24h； （3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）。此过程制备的裂解液中往往 有多种噬菌体，需进一步纯化； （4）纯化时，通常采用接种针在单个噬菌斑中刺一下，蘸取少许噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中，置37℃振荡培 养，直至试管中菌悬液由浑浊变清；培养物经离心后取上清 液，再重复步骤⑵、⑶直到出现的噬菌斑形态一致为止 注意事项 1.使用仪器要保证是灭菌的； 2.注意琼脂的浓度； 3.氯仿是易燃品，应远离火焰 一、生物测定法 1、双层琼脂平板法 1）倒下层琼脂 融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。 2）倒上层琼脂
组织线粒体分离试剂盒
组织线粒体分离试剂盒 简介： 线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低俗出去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。 Leagene 组织线粒体分离试剂盒(Tissue Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离动物组织中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。该试剂盒可用于从动物软组织(如脑、肝脏)和硬组织(心肌、骨骼肌)中提取线粒体，对于采用该试剂盒提取硬组织线粒体效果不佳者，建议采用Leagene 硬组织线粒体分离试剂盒。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 低温离心机、匀浆器 2、 PBS 操作步骤(仅供参考)： 1、清洗：取新鲜组织(不宜采用冻存的组织)，迅速称重，用预冷的PBS 清洗1次，冰上剪成3mm 2大小的组织碎片。 2、匀浆裂解：加入Mitochondria Lysis buffer(如需获得细胞浆蛋白，应提前加入PMSF ，至PMSF 浓度为1×)，置于冰浴上Dounce 匀浆器中，匀浆10～20次。 不同组织或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 3、离心以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。注：如需获得纯度更高的线粒体，可 编号 名称 CS0010 50T Storage 试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃ 试剂(B): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(C): Protein Stock buffer (5×) 10ml RT 试剂(D): PMSF(100×) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份
噬菌体的分离与纯化
噬菌体的分离纯化及一步生长曲线的绘制 前言 噬菌体是以细菌为寄主的一类非细胞微生物。目前对于噬菌体的研究大多数集中在人和动物传染性疾病的防治方面，在环境的治理方面的研究报道较少，因此我们试图分离纯化污水中的噬菌体，掌握其生物学性质，应用所得噬菌体处理、净化生活污水，减少生活污水中病原性细菌的危害。本研究以从小鹅中提取的大肠杆菌为宿主菌，从污水中分离噬菌体并进行纯化，最后绘制一步生长曲线。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌种及样品 菌种：从小鹅中提取的大肠杆菌，由老师提供。 污水来源：主要来自于农大出水口。 1.1.2试剂 1mmol/L CaCl2溶液 1.1.3试剂的配制 (1) 液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨5g，牛肉膏1.5 g，NaCl 2.5g，加H2O至500mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌。 (2) 3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，NaCl 1.5g，加H2O 至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌。 (3) 固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌。
(4) 半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌。 1.1.4主要仪器 电热恒温培养箱（SHEL·LAB）、 电热恒温水温箱（HHW21·Cu600，XMTD）、 恒温摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）、 通风柜（M·TFG-A）、医用净化工作台（苏净集团安泰公司）、 台式离心机（eppendorf）、 台式高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER）、 超低温冰箱（Forma Scientific）、 YM50全自动不锈钢立式电热蒸汽消毒器、 针头式细菌过滤器、0.22μm微孔滤膜（上海市新亚净化器件厂）、 微量移液器（GILSON）、UVette(Eppendorf)。 1.2方法 1.2.1噬菌体的分离 1.2.1.1摇菌 老师提供的大肠杆菌液加入5mL1×牛肉膏液体培养基，混合后，37℃振荡（120rpm）14h，此时大肠杆菌达到了对数生长期，取出4℃保存。 1.2.1.2噬菌体分离 从农大出水口采集未经消毒处理的污水样本一瓶，经双层滤纸粗滤后取用50mL，加入氯化钙母液（终浓度为1mmol/L），再用0.22微米微孔滤膜过滤除菌。取10mL滤后液加入5mL3×牛肉膏培养液，再加
氨基酸的分离鉴定(纸层析法)
氨基酸的分离（纸层析法） 一、实验原理 1、层析法又称色谱法，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。 操作方式：纸层析、薄层层析、柱层析等 分离机理：分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等 2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂（流动相）沿纸流动经过层析点时，层析法上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。 物质被分离后在滤纸上的移动速率用值表示： 只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，值是常数，故可根据值作定 性依据。 氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 二、实验器材 标准氨基酸溶液、滤纸、层析缸、保鲜膜、剪刀、毛细管、电吹风。 三、实验试剂 1、酸相溶剂：V[正丁醇（A.R）]：V[88%甲酸]：V[水]=15：3：2 2、显色贮备液：V（0.4mol/L茚三酮-异丙醇）：V（甲酸）：V（水）=20：1：5 四、实验操作 1、点样 量取30mL层析溶剂、1mL显色贮备液于层析缸中，混匀密闭，静置。 戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸，将其剪彩为18cm*14cm。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。 用毛细管将标准氨基酸和未知样品分别点在点样点上，每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次，点样点直径不超过5mm。 2、层析与显色
氨基酸的分离与鉴定
实验一氨基酸的分离与鉴定——滤纸层析法 目的要求 （1）通过实验，了解氨基酸滤纸层析法的原理。 （2）掌握氨基酸滤纸层析的操作方法。 原理 滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析（它也并存着吸附和离子交换作用）。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动称为下行层析，自下而上流动称为上行层析。流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。 溶质在滤纸上的移动速率用R f值表示： 溶质结构、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等因素都会影响R f 值。此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。 无色物质的纸层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定。氨基酸纸层析图谱常用的显色剂为茚三酮或吲哚醌，本实验采用茚三酮为显色剂。 本实验用单向上行层析法作标准氨基酸的标准曲线，用双向上行纸层析法作几种已知氨基酸的层析图谱。然后将其中的谷氨酸和天冬氨酸加以定量测定。 试剂和器材 一、试剂 （1）8×10-3mol/L谷氨酸和8×10-3mol/L天冬氨酸混合液。 （2）谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和丙氨酸混合液（已知氨基酸混合液）。将以上氨基酸分别配制成8×10-3mol/L的浓度，然后混合之。 （3）茚三酮重结晶方法：茚三酮有时由于包装不好或放置不当常带微红色，需重结晶方可使用。5g茚三酮溶于15mL热水，加入0.25g活性炭轻轻搅动，若溶液太浓不易操作，可酌量加5—10mL热水，加热30min后趁热过滤（用热滤漏斗，以免茚三酮遇冷结晶而损失），滤液置冰箱内过夜，次日晨即见黄白色结晶出现，过滤，再以1mL冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色瓶内保存。 （4）0.1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）：75%乙醇=2 ：38 硫酸铜难溶于乙醇，将硫酸铜直接用75%乙醇溶解不能得到澄清溶液，如将硫酸铜溶液和乙醇混合后，放置过久则会有沉淀析出，因此，必须在临用前按比例混合。 正丁醇（需重蒸），95%乙醇，88%甲酸，12%氨水（因氨易挥发，稀释前需测出毕重）。 0.5%茚三酮丙酮溶液。 二、器材 新华中速薄层析滤纸，层析缸（高约430mm，直径约290mm，具有磨口盖子），鼓风恒温箱，国产72型分光光度计，水浴锅，喷雾器，电吹风机，点样架，点样管，加溶剂的漏斗，针、线和尺子，橡皮（或线）手套，结晶皿。
细胞线粒体分离试剂盒
细胞线粒体分离试剂盒 简介： 线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低俗出去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。 Leagene 细胞线粒体分离试剂盒(Cell Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离培养细胞中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。本试剂盒提供台盼蓝染色液和PMSF ，可以分别判断线粒体质量和提取细胞浆蛋白。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 胰蛋白酶 2、 低温离心机、匀浆器 3、 PBS 操作步骤(仅供参考)： 1、清洗：用预冷的PBS 清洗细胞，离心，其上清。 2、裂解：沉淀用预冷的Mitochondria Lysis buffer 重悬细胞，冰浴放置，可用相差显微镜检测膨胀的程度。 3、匀浆：把细胞悬液转移至Dounce 匀浆器中，匀浆。不同细胞或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 编号 名称 CS0201 50T Storage 试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃ 试剂(B): Trypan Blue Stain 10ml 4℃ 避光 试剂(C): Wash buffer 100ml -20℃ 试剂(D): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(E): Protein Stock buffer(5×) 20ml RT 试剂(F): PMSF(100×) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份
纸层析法分离氨基酸实验报告
纸层析法分离氨基酸 一、前言 纸层析法 纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离(Rf值)与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量(如光度法、比色法等)。 纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。
在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。 做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液(石油醚)混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。 纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢;含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。 氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占61,，在饮料工业占30,，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。 氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用: （1）在食品行业的应用 （2）在医药工业的应用