基因工程常见问题梳理

基因工程常见问题梳理

1、什么是星星活性，产生的原因及解决方案？

星星活性是指在极端非标准条件下，限制性内切酶能切割与识别序列相似的序列，而造成误切的现象。

产生的原因：

1)甘油浓度过高，大于5%；

2)酶过量，>100U/ul；

3)Mg2+被其他的二价金属离子取代；

4)pH过高，>8.0；

5)添加了有机溶剂DMSO、乙醇等；

6)离子强度低，<25mmol/l。

2、限制性内切酶的发现、分类和各类的特点：

限制性内切酶的发现是20世纪60年代，噬菌体侵染大肠杆菌之后，DNA在感染宿主中会被降解，从而提出了限制酶切和限制酶的概念。1970年，H.Smith偶然发现了HindIII，揭开了限制酶的面纱。

主要分为三类：

I类、III类：限制作用需要A TP

II类：最常使用的一类限制酶，识别序列主要有4-6个核苷酸，回文结构，与甲基化的反应分开，限制作用不需要A TP。

3、不同条件的两种限制性内切酶，双酶切时应该采取什么措施？

1)同步双酶切：配置同时适合这两种限制酶的最佳缓冲体系，同时加入两种酶；

2)分步酶切：分开加酶时遵循先低盐后高盐原则，而且可以在加入第二种酶的时

候使第一种酶失活，避免产生星星活性。

3)使用配有特殊缓冲液的酶进行酶切：在大多数情况下采用标准缓冲液的酶也能

在这些特殊缓冲液中进行酶切，这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工

作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切时，反应速度会减慢，因此需要增

加酶量，延长反应时间。

4、差异杂交的基本原理和思路

差异杂交要拥有两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中的目的基因正常表达，在另一个细胞群体中的目的基因不表达。在这种情况下便可制备两种不同的mRNA提取物。其一是含有目的基因的mRNA的总mRNA，另外一种是不含有目的基因mRNA的总mRNA。因此，可以通过这两种mRNA的cDNA拷贝为探针，对由表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。

思路：

将来自一种细胞的mRNA反转录形成cDNA的第一链，用这种细胞的cDNA与另一种细胞过量表达的mRNA进行杂交。如果在第一种细胞中是特异表达的mRNA，则会产生特异的cDNA链，不会与第二种细胞的mRNA杂交。通过羟基磷灰石柱层析，洗脱未形成杂交体的cDNA，它代表第一种细胞中特异表达的基因。以该链为探针，第一种细胞的cDNA 文库的重复拷贝杂交，跟探针能够杂交克隆的是在组织细胞中特异表达的mRNA。再对这样的克隆进行测序比较，鉴定，就分离得到这种组织特异表达的基因，所有包含重组体的菌落，阳性反应在X射线上呈现黑色的点。比较这两种底片对照原平板。便可以挑选所有含有目的基因的菌落，供进一步研究使用。

5、如何检测外源基因

1)外源基因导入基因组中的检测：southern杂交、PCR扩增检测、报告基因检测；

2)外源基因在基因组中转录检测：northern杂交；

3)外源基因在基因组中翻译检测：western杂交；

4)筛选标记基因：如一些抗性基因表达后可在含抗生素的培养基上存活；

5)直接观察基因表达的特殊性状来检测目的基因是否表达。

6、目的基因重组后不表达的原因。

1)导入了特异启动子对该基因的表达无效；

2)启动子与目的基因的距离过长，表达效果降低；

3)由于密码子偏爱性，目的基因含有大量寄主细胞的稀有密码子而造成表达量降低

4)真核基因在原核表达系统中的表达方式不一致；

5)寄主细胞中内源蛋白造成外源蛋白降解，或因为修饰系统不同而使外源蛋白活性降

低或缺失。

7、蓝白斑筛选的原理：

某些质粒带有大肠杆菌lacZ突变体lacZ’基因，当其与另一个lacZ突变体lacZΔM连接时可实现α-互补，编码β-半乳糖苷酶。如果在lacZ’基因的上游插入一段小的DNA片段（如51bp的多克隆位点）则不影响其功能互补。但是再在该DNA片段上插入一段DNA片段，将使得其失去功能互补的特性，无法编码β-半乳糖苷酶。非重组体可以在IPTG的诱导下生成β-半乳糖苷酶，作用于X-gal，生成蓝色的菌斑。重组体则不能产生β-半乳糖苷酶，生成白色的菌斑。因此可以通过观察菌斑的颜色来快速鉴别重组体与非重组体。

相应的受体菌有JM系列、TG1、XL1-Blue；

pUC系列的载体与外源基因的形成的重组体可以进蓝白斑筛选。

8、IPTG诱导的原理：

IPTG是一种乳糖衍生物，在体外进行乳糖操纵子的研究时，并不直接使用乳糖作为诱导物，而是使用其衍生物IPTG作为诱导物。IPTG可以与阻遏蛋白结合，使得其不能与lac操纵子结合，使得RNA聚合酶可以与操纵子结合，调控结构基因的表达，产生β-半乳糖苷酶。当无诱导物的时候，则阻遏蛋白与操纵子结合，抑制RNA聚合酶与lac 操纵子结合，则结构基因不表达。

9、蓝白斑筛选假阳性形成的原因

1)插入的小片段不是目的片段；

2)携带lacZΔM的质粒插入到了lacZ’基因的内部不形成α-互补；

3)β-半乳糖苷酶N端的α肽被修饰，失去了原有的活性；

4)插入的外源片段引起α肽的可读框的改变或者插入的片段在正确的可读框中含有

终止密码子；

5)IPTG和X-gal在平板上未涂布均匀。

10、PCR引物设计引入酶切位点时，为什么要在酶切位点后加上一些碱基？

作为保护碱基，保护PCR引物不被酶降解；

为限制酶酶切提供支点，提高酶切效率。

11、PCR的基本原理，试剂，预先必须知道的信息？

PCR是利用DNA半保留复制的原理在体外以模板DNA、引物和四种dNTP的存在

下，依赖于DNA聚合酶，按5’-3’反向合成双链DNA的多聚核苷酸酶促反应。主

要有三个程序：95℃，变性；50-60℃，退火；72℃，延伸，1kb/min。

试剂：DNA模板、上下游引物、含Mg2+的buffer、4种dNTP、DNA聚合酶（Taq）预先应该知道模板和配对的引物。

12、非特异性产物形成的原因：

1)引物的退火温度过低，适当提高退火温度或采用二温度点法；

2)引物的长度过短，特异性差，一般应在18-30bp；

3)引物设计的时候具有二聚体结构，导致形成非特异性产物；

4)循环次数增加，提高了非特异性产物的浓度，一般在35个循环足够；

5)Mg2+浓度过高，导致产物出错率提高；

6)模板浓度低，引物浓度过高，引物自身结合；

7)酶量过多；

8)可能是电泳体系存在问题。

13、质粒的特性：

1)不相容性：两个质粒在同一宿主细胞中不相容；

2)转移性：可以通过结合作用转移到细菌中，便于转化；

3)自主复制性：可以在宿主中自主复制；

4)标记基因：便于筛选；

5)拷贝数：具有一定的拷贝数，便于载体的制备。严谨型质粒具有低拷贝数，一

般为1-几个拷贝；松弛型质粒具有高拷贝数，一般可达到几百拷贝。

14、质粒的重要组成元件：

1)复制原点（ori）：保证在宿主中能自主复制；

2)MCS：使得有合适的酶切位点与目的片段相连；

3)标记基因：便于筛选。

4)用于表达的质粒载体还具有：

5)启动子：调控目的基因的转录和表达；

6)终止子：终止目的基因的转录和表达；

7)其他调控元件：增强子

8)Taq基因：检测、分离纯化目的基因产物

15、载体的特征：

载体可以是改造后的质粒，也可以是动植物病毒的DNA。

1)转移性：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性；

2)复制位点或整合位点：为外源基因提供复制能力和整合能力；

3)具有较高的DNA装载能力；

4)具有MCS，为外源基因提供酶切位点；

5)具有特殊标记的筛选基因。

载体可分为表达载体和克隆载体，表达载体是在克隆载体的基础上增加了一些调控表达的元件，如启动子、终止子、增强子、剪切信号、融合基因等

16、受体细胞的特点：

1)易于制备成感受态细胞，便于重组体的转入，并能在其中稳定存在；

2)安全，无致病性；

3)最好无密码子偏爱性；

4)具有与重组体相似的表达方式；

5)具有转录和翻译后修饰系统，有利于外源基因的表达；

6)内源蛋白含量低或无，防止外源蛋白被酶降解，促进外源蛋白的高效分泌表达；

7)有限制性缺陷型，如营养缺陷型，容易筛选；

8)具有较高的遗传稳定性，容易培养；

9)具有较高的理论和实践生产意义

常用的受体菌：

具有蓝白斑筛选特性：JM系列、TG1、XL1-Blue、DH5a

含有能表达T7噬菌体的RNA聚合酶的表达细胞：BL21(DE3)

17、cDNA文库与基因组文库：

cDNA文库是指以生物体的总mRNA为模板，逆转录成cDNA，与合适的载体连接转入到宿主细胞中，经过筛选得到的阳性克隆菌落。

基因组文库是指将生物体全部基因组DNA片段通过限制性酶酶切成一段段小的DNA片段，与载体连接，进行重组转化培养，得到的阳性克隆菌落。

CDNA文库含有全部的编码基因，基因组文库含有所有的基因。

18、杂交技术：

1)Southern杂交：DNA与DNA杂交。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性酶

切的DNA片段，将胶上的DNA变性（NaOH可使双链DNA变性为单链），

并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其它固相支持物上，经干烤或紫外

线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显

色，从而检测DNA分子。

2)Northern杂交：以DNA为探针，检测RNA。将提取的总RNA或mRNA用变

性凝胶电泳分离，则不同的RNA分子将按分子质量大小依次排布在凝胶上；

将它们原位转移到固定膜上，在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂

交，然后通过探针的标记性质检测杂交体的实验技术。

3)Western杂交：抗原-抗体杂交，将已用PAGE或其它凝胶电泳分离的蛋白质转

移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大

分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，类似southern杂交。

第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗（同位素或非同位素的酶）来检测蛋白质。

19、影响杂交的因素

1)核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复制性速度越快。探针长度一般控制

在50-300个碱基为好；

2)温度：温度过高不利于复性，温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解

离，最佳温度应该较TM值低25度；

3)离子强度：低离子强度，核酸杂交缓慢，随着离子强度增加，杂交反应率增加。

高离子强度有利于维持杂交体的稳定，所以进行序列不完全同源的核酸分子杂

交时必须维持杂交反应液中的盐浓度和洗膜液中的盐浓度。

4)杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸的TM值，使探针在低温下更稳定，能

更好地保留非共价结合的核酸。

5)核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同核酸的总长度，两个不同基

因组DNA变性后的相对杂交速率取决于样品浓度绝对一致时的相对复杂性。

20、基因工程及相关支撑技术、常用的酶：

基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术（基因重组、克隆和表达等重组DNA技术）和下游技术（基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程）

具体支撑技术：

核酸分子杂交技术（southern杂交、northern杂交、western杂交）、PCR技术、凝胶电泳技术、细菌转化转染技术、DNA序列分析技术、寡核苷酸合成技术、基因定点突变技术。

常用的酶：

限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶、核酸修饰酶

21、转基因动、植物的设计：

1)目的基因的获得：获取目的片段进行PCR扩增后选择合适的限制酶进行酶切；

2)构建重组子：选择合适的载体与目的片段连接形成重组子；

3)转化：有原生质体介导法、根癌农杆菌介导法、基因枪法等，植物细胞中常用

根癌农杆菌介导法转入外植体，动物细胞应选择全能细胞，如生殖细胞或胚胎

干细胞；

4)培养：培养转化的愈伤组织或受精卵，得到转基因植物/动物；

5)检测转基因动植物是否有目的基因的表达，如产生抗性蛋白。

22、目前常用的转基因方法：

1)原生质体介导法：使用PEG介导或电击法，将重组体导入原生质体中实现外

源基因的转化；

2)基因枪法：将外源基因包裹在金属颗粒中，在高压的作用下将金属颗粒导入宿

主细胞中，并使外源基因整合到宿主基因组进行表达；

3)根癌农杆菌介导法：直接通过细菌的侵染作用将外源DNA整合到宿主DNA

中；

4)显微注射法：将外源DNA在显微操作系统的辅助下直接整合到宿主细胞核中，

无需载体；

5)Ca2+处理受体细胞，促进受体细胞自主吸收外源DNA

23、感受态细胞的制备：

化学法Ca2+处理：细胞扩大培养，选择对数期的细胞，冰浴10min---加入CaCl2溶液，冰上处理15min---4℃离心去上清---将下层溶液悬浮在预冷的，含15%甘油的CaCl2buffer中---4℃下维持备用

保证培养物的密度不要超过108细胞/ml，大部分的操作都在冰上进行。

24、转化的流程：

化学转化：使用CaCl2制备感受态细胞---加入重组体与感受态细胞混合，冰浴

30min---快速转入42℃，2min（热激）---