细胞重组与克隆技术
第7章细胞重组与克隆技术
主要内容：7.1细胞重组7.2克隆技术
7.1 细胞重组
7.1.1 细胞重组的定义
细胞重组（Cell Reconstruction）,又称细胞拆合是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。
在探讨真核细胞的起源时。马吉利斯(MaRdls)曾于1972年提出了内共生学说：真核细胞起源于原核细胞，是几个原核细胞共生结合的结果。如蓝阴滴虫，细胞内含叶绿体，就是蓝藻在阴滴虫内共生的结果；绿草履虫体内的绿色物体，就是与之共生的一种小球藻。
这种不同细胞的结合过程类似于细胞的自然装配。
细胞的生长过程包含着细胞器的自我装配，但这是一种活体的自我装配，而细胞重组则是离体的装配过程。
7.1.2 细胞重组的意义
细胞重组技术是现代生物工程中的热点课题，细胞重组与细胞融合技术是细胞工程中的细胞或细胞器水平上主要构建手段，它与基因转移技术、干细胞技术等结合，可以人为地获得新物种或使细胞表达新的性状和新的产物。
7.1.3 细胞重组技术发展概况
7.1.4 几个重要概念
胞质体(Cytoplast)：是指除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。
微细胞(Microcell)：是指只有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。
核体(Karyoplast)：是指与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为核体。
7.1.5 细胞重组的方式
胞质体(Cytoplast)：与完整细胞重组形成胞质杂种(Cybrid)。
微细胞(Microcell)：与完整细胞重组形成微细胞异核体(Heterokaryon)。
胞质体与核体(Karyoplast)：重新组合形成重组细胞。
7.1.6 细胞重组技术
1、显微操纵术
一般是在显微解剖镜下，把细胞放入消毒的培养液中，同时放入冷却系统中以减慢细胞发育，然后借助一台专门的装置——显微操作仪，用细微玻璃针或用微细管、微电极、微热电偶等斜插入细胞中去，可以挑取细胞核，人工造就去核细胞；也可以进一步作移核实验与电生理实验。
用这种仪器能够进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各物质的注入、
测量微电位的变化等等。
意义:
1、实现细胞的拆合
2、为研究细胞内的基因表达与调控和改良动物品种提供了一种重要手段。
2、细胞分离技术
分离细胞主要是根据细胞本身的某些特殊性质来选择合适的分离技术来分离具有同一性状的细胞群、这些性质包括：细胞大小、密度、表面电荷、表面标志、细胞中一个或多个成分的荧光强弱、细胞对其他介质的吸附作用
经常采用的细胞分离方法如下：
（1）差速离心（differentialcentrifugation）
在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器
在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。（速度升高，样品按大小先后沉淀）
由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。
差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。
（2）梯度沉降分离法
主要是根据细胞大小不同分离细胞、细胞在单位重力作用下，通过密度介质、或在低离心力作用下通过梯度密度溶液沉降，由于细胞大小不同，沉降速度不同。细胞大，沉降快。
常采用适当的分离介质形成一定的梯度密度溶液．这此介质主要有：血清、蔗糖等：（3）等密度沉降分离法
主要是根据细胞密度差异来分离细胞。
细胞在连续密度梯度分离介质中、受强离心力的作用，最后到达与其密度相同的分离介质层面，并保持平衡。
如果是非连续密度梯度介质中，细胞主要集中在介于其自身密度的两种密度介质交界面上，从而达到分离的目的。
目前常采用的分离介质有蛋白等。密度分离剂应该具有无刺激，对细胞无吸附作用，产生的渗透压小等特点
（4）流式细胞仪分离法
这种方法是以免疫荧光法使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，然后用超声波处理使其分散成单个细胞，再将细胞悬浮液通过一个直径为50um的喷嘴变成极细小的微滴，每个微滴一般含有一个细胞，以l0m/s的速度喷出。经激光照射是细胞上所带荧光被激发而转换成脉冲．通过测定脉冲数就可以换算出各种不同细胞表面抗原的情况。同时由于悬浮微滴中的细胞带有不同程度的负电荷，这样在施加电场后。移行偏斜的程度不同，而不带电荷的细胞仍以直线流过、借此可以收集得到不带电荷或带电荷多少不同的各种细胞。
这种方法优点是分离速度快，分离得到的细胞仍能保持其功能；缺点是需要专门的设备。
3、细胞破碎方法
细胞器的分离需要将组织细胞破碎，常用的方法有：超声波破碎法；反复冻融法；化学裂解法；高速组织捣碎法。
（1）超声波破碎法
原理是：超声波发生器产生高强度超声信号，经换能器传送至与其接触的细胞溶液中，由声波冲击和振动产生的剪切力使细胞破碎。
缺点是破碎过程中会产热，应该注意冷却。有些生物大分子不宜采用。
（2）反复冻融法
使细胞溶液或组织细胞浆在超低温冰箱或液氮罐内冻结后，在37℃复温融化，重复3-4次操作使细胞壁破碎。
（3）化学裂解法
在细胞悬浮液中加入某些化学物质如十二烷基硫酸钠等使细胞膜裂解。在使用该方法的同时常要辅助以一些机械的方法才能使细胞在短时间内完全破碎；由于化学裂解剂会干扰分析，在细胞裂解后应注意清除化学裂解剂。
（4）高速组织捣碎法
主要借助高速组织捣碎机使细胞被高速旋转的叶片破碎。
由于也会发热，可能导致分离物的降解，因此不能时间过长．必要时可使用循环水冷却
4、细胞器分离方法
为了研究细胞内某种细胞器的生化组成、生理功能，或用于细胞重组，常需大量采集细胞的某些组分。常用的方法有：研磨、超声振荡和低渗等将组织制成匀浆，细胞中的一些亚组分就从细胞中释放出来。然后采用以上介绍的沉降分离法实现分级分离。
【实验】细胞器分离、制备与观察
【目的】（1）掌握分离制备动物细胞线粒体的方法。（2）对分离得到的线粒体进行活性鉴定。【原理】线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。
将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中用差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中(选用离心机的一定转速)，球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。
悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；
pH7.2的条件下；亚细胞组分不容易重新聚集成团，有利于分离。
整个操作过程样品要保持在0℃~4℃，避免酶失活。
细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
******************************************************************************* 举例：鼠肝线粒体的分离
1．制备肝细胞匀浆：
实验前将鼠空腹12小时，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝组织2g，剪碎；用预冷的0.25 mol／L蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加4.5 mL 预冷的0.25 mol／L蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在0~4℃冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，用双层纱布过滤。
2．差速离心：
将0.34 mol／L蔗糖溶液4.5mL放入离心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝匀浆覆盖于上层。用冷冻控温的高速离心按下图顺序进行差速离心。
分离细胞核：
活性鉴定：
(1) 细胞核：取核沉淀1滴涂于载玻片，加入Carnoy固定液（甲醇：冰乙酸3:1）15 min，晾干。Giemsa染液染10 min，蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水、用显微镜(40×)检查，细胞核呈紫红色，混杂的胞质为浅蓝色碎片。
(2) 线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上，勿太密。滴加1％詹钠斯绿溶液染液，10 min 后用光学显微镜观察，线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
******************************************************************************* 5、胞质体、核体、微细胞的制备（细胞重组常用的几个原料，重点介绍）
（1）胞质体
方法：细胞松弛素B处理体外培养细胞能诱发其排核，结合高速离心得到了胞质体。
影响制取胞质体的因素：容器，有玻璃片、塑料片、离心管、培养皿、培养瓶等，需在灭菌恒温培养室中进行。适宜的温度、细胞松弛素B的剂量、培养液浓度及其血清含量、离心速度、细胞密度等。
特点：
植物细胞的胞质体内的细胞器与完整细胞相同，具有内质网系、线粒体、溶酶体、高尔基体和中心粒及微粒、微管等骨架系统，各细胞器仍占有固有的位置。线粒体的运动十分活跃，线粒体膜上各酶系的分布及氧化磷酸化过程都照样存在。
胞质体内线粒体内自主性的DNA复制尚能有限地进行着。蛋白质的合成在去核后的一段时间内持续进行。因此，去核细胞质体是深入研究细胞质作用的重要样品。
（2）核体
与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。
为了生产大量的核体，必须采用一系列的纯化技术，以防夹杂完整细胞和胞质体。可在去核处理后,从离心管底部收集样品,接种于培养皿内,温育1-2h，由于核体的贴壁率大大低于残留完整细胞的贴壁率，可从上清液中收集得到较纯净的核体。如此重复1-2次,可使核体的纯度高达99％。
（3）微细胞
秋水仙素及其衍生物和长春新碱等有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。
经体外培养，在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。这种微细胞仅含有一个或数个染色体的DNA，也是细胞拆合工程的一种有用材料。
（4）小结
用上述方法从活细胞中拆散出来的胞质体、核体、微细胞为材料，通过显微操纵术，在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新组合，加入病毒或化学物质如聚乙二醇等融合因子，经过一段时间的作用，可以把它们更新装配成新的活细胞。
胞质体、核体和微细胞的制备
6、细胞拆合的方法
（1）物理拆合法：
早期：使用的核、质分离方法是用紫外线或激光将核破坏，再用微玻璃针或微吸管将其他细胞核吸入
后期：将细胞融合技术与显微外科手术结合，作微吸管将细胞核连同周围少量细胞质吸出，再吸入等量的灭活的病毒悬液，一并注入已去核的细胞中，让其发生融合
（2）化学拆合法
①细胞松驰素效应：
干扰细胞质的分裂；
引起细胞表面形状的改变和排出细胞核；
抑制细胞的运动；
阻碍细胞的吞噬或胞饮；
减低细胞的粘着程度；
阻止神经细胞轴突的生长；
影响葡萄糖和核苷酸的摄取；
影响甲状腺素的分泌和生长激素的释放以及影响细胞质的流动；
高浓度的细胞松驰素能使离体或活体的多种细胞发生明显的表面形态的改变。其中之一是在细胞表面产生所谓的“疱疹”
②胞质体和核体的制备
将细胞培养在玻璃或塑料平板上，一般培养2天以上脱核。将经37℃预温的CB溶液（含CB10μg/mL和小牛血清5%）5mL加入50mL离心管内，把生长有细胞的塑胶板面朝下，水平放入CB溶液中，在圆板上压上一个圆形的栓，以防止圆板移动位置。盖好离心管后，放入经37℃预温过的转头内进行离心。多数细胞株在11000-15000r/min离心15-30min，有80%的细胞脱核
按上述去核过程，即可得到无核的胞质体和细胞核，但在被分离出的核中带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”
去核前作预离心，可去除贴壁不牢的完整细胞。
去核以后一般用贴壁法纯化，即可利用核体贴壁附着性弱、完整细胞附着性强的特点进行纯化。重复两次，可把大部分完整细胞除掉
③微核体的制备
秋水仙素及其衍生物和长春新碱等有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。动物细胞受秋水仙碱作用，形成了大小不同的多个微核，用CB使微核从细胞分离出来。
制备微核体的时候，用0.1μg/mL秋水仙碱长时间（48h以上）处理细胞，细胞分裂就被控制在分裂中期，此时染色体动力终止，在单个染色体或染色体群之周缘重现核膜，形成了大小不同的多数微核，此时的细胞就叫微核化细胞。一般用14000r/min离心20min 即可脱核80-90%。
7、细胞重组及细胞质杂交
（1）动物细胞重组及细胞质杂交
①进行细胞重组时，在融合环圆板上放入核体(0.2mL)和仙台病毒(HVJ)0.1mL以及缓冲液
0.5mL进行融合。
②进行细胞质杂交时，向圆板上加入完整细胞悬液0.5mL(一个圆板上约有细胞2-3×105个)，放置15min以便细胞质体和完整细胞接触，然后吸除悬液，再加PEG 0.25mL作用30s。
③细胞融合处理后，加培养液洗融合环内的圆培养液反复4次吸引洗净后，加入10%-15%小牛血清培养液1-2h。最后用0.1%胰酶使融合细胞从板上脱落，移入新平皿内培养。
④融合后重组细胞株的分离。
（2）植物的细胞重组
使胞质体与核悬浮并沉淀在硝酸钙溶液中，除去上清液，先把它们悬浮，然后以适当比例使核与胞质体在试管中混合，离心，随后加入PEG处理使它们凝集，再慢慢加入硝酸钙溶液，促使核的摄入，其后洗涤、培养，把异核的原生质体培养成新的植株。
（3）微生物的细胞核与原生质体融合
核体的分离：降低原生质体渗透压使质膜破裂，同时保护核体和核膜的稳定使细胞核分离出来，经过蔗糖梯度离心纯化可得到提纯的核样品
把核与营养缺陷互补的受体菌原生质体混合，在PEG的诱导作用下得到核与原生质体的融合产物
7.2 克隆技术
7.2.1 克隆的定义
克隆(Clone)原指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体，现在也指一种实现无性繁殖的操作。克隆是指一种实现无性繁殖的操作，而不是一般意义上的无性繁殖。
7.2.2 克隆的理论基础——细胞全能性。
克隆在植物界已有上千年的历史。理论的上的突破在20世纪。
1902年德国植物学家哈伯兰德提出，植物的体细胞具有母体全部的遗体信息，具有发育成为完整个体的潜能。因而每个植物细胞都可像胚胎细胞那样，经离体培养再生成为完整植株。这就是所谓的细胞全能性。
理论上，任何一个细胞都含有其生物体系基因组的全部基因，都可以被克隆。实际上，动植物细胞克隆结果差别很大。克隆现象在植物界普遍存在。既可以是自然的，也可以是人工的。
7.2.2 克隆的理论基础
与植物细胞不同，在动物发育过程中分化了的细胞不再产生完整的充分分化的个体，然而，动物胚胎的生长、分化和发育是否造成体细胞基因组的不可逆性修饰，即在发育过程中分化了的细胞是否具有与受精卵相同的核等价性或基因组连续性、一直是发育生物学要解决的问题
早在20世纪30年代，著名的胚胎学家斯佩尔曼就已经提出了分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育这样的设想。用两栖类动物进行的一些克隆实验表明，早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体。也就是说尚未分化的胚胎细胞具有全能性。基于这种认知、人们采用胚胎分割及胚胎细胞核移植技术成功克隆出了许多动物。
这种对动物细胞全能性的认识自1997年后得到改变，体细胞克隆动物“多利”羊的成功证明成熟的体细胞也具有全能性；后来，体细胞克隆小鼠、牛及山羊的成功，更充分证明高度分化的细胞核仍具有全能性。因此，人们对细胞全能性有了全新的认识。
7.2.3 克隆的技术方法
目前，克隆技术最成功的应用体现在克隆动物的培育上。下面主要介绍以细胞核移植为核心的无性繁殖技术。
（一）定义
细胞核移植技术（Cell nuclear transplantation technology)是指利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。
**细胞核移植技术
由于主要的遗传物质存在于细胞核中，因此，核移植的受体将具有与核移植供体完全相同的遗传基础，因此，细胞核移植技术在动物育种工作中具有十分重要的意义。
因为它像植物中的组织培养那样，可以利用一头优质的动物(例如高产的奶牛)复制出与它生得完全一样的成千上万的细胞核移植系动物。
细胞核移植技术是克隆技术的关键。
细胞核移植所得到的杂种称为核质杂种。
根据细胞核移植对象的不同可分为胚胎细胞核移植、体细胞核移植等。
开始时，进行细胞核移植主要是为了研究胚胎发育进程中细胞核和细胞质功能及两者之间的关系，探索有关遗传、发育和细胞分化等方面的理论问题。后来发现，这项技术可以实现不同细胞核和细胞质的组配，从而培育出新物种。
（二）发展历史
1、提出思想
第一个提出对动物进行细胞核移植实验的人是诺贝尔奖获得者德国胚胎学家汉斯?施佩曼博士，他构想了一个“奇异的实验”：把一个卵细胞的细胞核取出，然后把取自另一个发育到后期的胚胎的细胞核放入这个卵细胞中。
但由于技术等方面的原因使他没能找到将细胞核导入卵细胞的方法。
2、建立技术及低等动物试验
1952（美）罗伯特.布里格斯和T．J．金首先利用两栖类卵细胞建立了细胞核移植技术。3、高等动物试验
经过大量低等动物实验之后，研究人员开始进行哺乳动物的移核试验。最早用来作移核试验的哺乳动物是小鼠。
1977（美）杰克逊实验室用“亚无性繁殖”的方式，培育出7只单亲小鼠。因为此种小鼠的体细胞中只有母体一方的染色体，故称之为单亲小鼠。
随着技术发展，哺乳动物的细胞核移核实验开始进入一个令人嘱目的新阶段。
1981，瑞士日内瓦大学的卡尔?伊尔门泽和美国杰克逊实验室的必得?霍普首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。他们将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，经培养移核卵发育到囊胚期、再将此胚胎植入同步孕小鼠的子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育的个体。
我国的细胞核移植技术工作开始于20世纪50年代，主要是在两栖类和鱼类上进行的。1961，童第周等以金鱼和鳑被鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细胞核在发育功能上的差异以及细胞质对细胞核的影响。
1980.4，中国科学院武汉水生生物研究所用鲫鱼做移核试验，成功培育出两尾无性繁殖的幼鱼。
1989，童第周、牛满江将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种，这个新品种的“鲤鲫核鱼”既具有鲫鱼的鲜美味道，又具有鲤鱼的生长快速。
细胞核移植技术
2008，鲤鲫移核鱼是采用无性杂交的细胞工程技术，将荷包红鲤的囊胚细胞核移植到鲫鱼的去核卵中而发育形成的后代。其鱼体呈红色，外形特征与鲤鱼相似，但也同时具有一些鲫鱼的特征，具有比较稳定的遗传性状。F1～F4代（1～4子代），基本性状趋于一致。其生长速度明显快于鲫鱼，并且比荷包红鲤快35％左右。
用鲤鲫移核鱼F2雄性与镜鲤杂交而获得的杂交一代被称为颖鲤。颖鲤具有明显的生长优势，其生长速度比双亲快42％左右。
4、限制条件
细胞核移植必须有一个前提，就是要尽量保证核供体和受体细胞处于同样的细胞周期，高等细胞发展到一定阶段时都要进行有丝分裂，而各种细胞的有丝分裂周期是各不相同的。在哺乳动物核移植实验中的核供体细胞和核受体细胞可能处在细胞周期的不同阶段上。现在可以通过采用“饥饿技术”来减慢细胞活动、迫使供体细胞处于某种休眠状态，以期获得与受体细胞同步的状态，便于两者的结合。
5、我国在细胞核移植技术选育鱼类新品种方面处于世界领先地位，以鱼类细胞核移植为例，详细介绍一下细胞核移植技术要点：
(1)供体和受体的准备
供体通常为鱼类的囊胚细胞或成体细胞。
受体为成熟的卵细胞。该受体卵一般可通过人工催产的方法得到。卵子在接受供体核之前要先激活来获得发育能力。
对于鱼卵而言，当它被挤入水中即可被激活。对于两栖类动物的卵可采用针刺方法。最关键的是供体和受体在发育时间上要配合好，保证在受体成熟卵刚产出时,供体受精卵发育至囊胚期。
(2)去卵膜和卵核
可用小镊子在解剖显微镜下仔细剥去卵膜，或用适当的胰蛋白酶溶液软化卵膜，经过轻轻晃动，使卵子从中脱出。
鱼卵----极细的玻璃微针借助第二极体标志(卵核位于极体下方)挑出细胞核。
两栖类----紫外线照射受体卵达到去核目的。
(3)供体细胞制备
将发育至囊胚期的胚胎或组织器官进行机械切割，置于胰蛋白酶溶液中处理几分钟，直至分离出单个细胞。也可将囊胚细胞或得到的离体细胞短期培养后用作供体。
(4)移核
由于细胞核极小，而且脆弱，因此需要极其小心，防止损伤细胞核或伤害到细胞质。
实际上核移植时，核周围的少量细胞质也一起注射进了去核后的受体细胞中了。30-40min 中内完成，温度：16-18℃
（三）克隆动物一般制备技术
克隆可以通过不同来源的细胞核移植来实现，如胚胎细胞、干细胞、成纤维细胞、体细胞等。其中以胚胎细胞克隆的应用比较普遍，以体细胞克隆的意义最大。
1、移植细胞核的来源不同分为
胚胎细胞核移植法胚胎干细胞核移植胎儿成纤维细胞核移植体细胞克隆技术
（1）胚胎细胞核移植法
将未着床的早期胚胎分散成单个的细胞，在电流的作用下，使单个细胞与去除染色体的未受精的卵母细胞融合。发育成胚胎后，移入受体妊娠产仔。
原则上，一枚早期胚胎有多少个细胞，通过这种方法就可以克隆出多少个个体。还可将细胞反复克隆出更多的胚胎，产生更多克隆动物。
哺乳动物的胚胎细胞在分裂成8细胞以前，所有的单卵裂球均为全能细胞，即每个卵裂球均能表达此个体的全部基因。理论上这时的每个卵裂球经过核移植，都能发育成遗传性状完全相同的个体。
这些工作为进一步研究细胞核和细胞质的相互关系建立了很好的模型。
（2）胚胎干细胞核移植
将胚胎或胎儿的原始生殖细胞经过抑制分代培养后，细胞数量增多，单细胞却不分化。因此，每个细胞仍然具有细胞全能性而发育成个体的能力，这样的细胞被称为胚胎干细胞系。
再利用细胞核移植技术，可以比胚胎核移植生产出更多的动物个体。
目前仅有小鼠分离克隆出其胚胎干细胞系并成功克隆出成体鼠。
（3）胎儿成纤维细胞核移植
从妊娠早期胎儿分离出胎儿成纤维细胞，采用细胞核移植方法克隆出胚胎，经移植受体后，妊娠产仔，克隆出动物个体。
（4）体细胞克隆技术
将动物体细胞经过抑制培养，使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，发育成胚胎后移植至受体，妊娠产仔，克隆出成体动物。
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克隆羊多利是由英国爱丁堡大学罗斯林学院(Edinburgh’s Roslin Institute)的胚胎学家伊恩·威尔马特(Ian Wilmut)领导的科研小组从一只成年绵羊的乳腺细胞克隆出来的。
1.取处于后三分之一妊娠期的6岁母绵羊的乳腺细胞作核供体细胞，用“饥饿法”时期进入休眠状态而使全部基因具有活性。
2.从苏格兰黑面母绵羊摘取卵细胞，通过手术去除其细胞核（DNA的载体）作为受体细胞。
3.把白羊的乳腺细胞放入黑羊的已去除细胞核的卵细胞中，以一种弗兰肯斯坦（Frankensfein）式的技巧，用电脉冲使这些细胞的膜不仅结合在一起，而且，两个细胞即刻合而为一。
4.将新的卵细胞植入羊的的结扎的输卵管内，6天后发育成桑椹期胚胎或囊胚，再移入假孕母羊子宫内。
5.产下多莉即为6岁母羊的复制品，也为白色。
**克隆动物成功与否的关键问题
首先是核移植过程中要分离得到供体细胞和作为受体细胞的卵细胞。
其次要取处在适当发育阶段及细胞周期的受体和供体细胞，受体细胞和供体细胞处于细胞周期中的同一时期，核移植成功的几率最大。
受体细胞在细胞周期中所处的时间对转核实验成功与否的影响要大于供体细胞所处的时间的影响，一般取G2期进行核移植的效果都较好。
另外，细胞诱导分裂成熟的因子（MPF）的活性有关。
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7.2.4 克隆技术的应用与意义
能使异种动物借腹妊娠、产仔，加快珍稀动物繁殖，抢救濒危动物(如大熊猫)；
建立重要疾病的基因模型，生产生物活性药物。
为了解细胞发育的潜能性、细胞核和细胞质之间相互关系、胚胎发生死亡及其调控研究提供了新视角，因此对揭示生命科学重大基础理论问题具有重要的科学价值。
动物克隆近几年取得的一些突破性进展，为动物发育过程中基因表达的调控及发育生物学、遗传学等相关学科的发展必将产生深远的影响。尽管目前这种方法尚不成熟，但它已显示出诱人的应用的前景。
1、检验动物细胞的全能性
在多莉羊诞生之前，普遍认为低等生物和高等植物的细胞具有全能性，而高等动物的体细胞没有全能性。
目前克隆技术取得的结果，为再生、修复、治疗组织器官缺损等奠定了理论基础，也增加了采用高度分化的体细胞克隆各种动物的信心。
2、加速动物繁殖、优良育种、保护珍贵动物
由于体细胞数量巨大和易于获得，因此动物克隆技术有助于加速动物育种的进程。
利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可以避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生育效率的限制，从而大大缩短育种年限，提高育种效率。（大熊猫交配的季节在春季三至五月份，通常不超过2－4天。）
也可以结合基因工程技术将具有特殊功能的基因(如具有一些经济性状、抗虫、抗病等)导入体细胞，然后用克隆技术培育出人们希望的动物新品种。
2001.4，一种具有极高科学价值的商品—利用克隆技术培育的金鱼由美国一家基因复制公司投放市场，这标志着克隆动物已经开始了商业化历程。
3、克隆濒危物种
2002年4月27日,中国农业大学成功克隆了第一头优质中国黄牛,这标志着中国在动物体细胞克隆领域取得了重要进展。这头名为“波娃”的体细胞克隆中国黄牛所使用的核供体细胞来源于一头不足六个月的冀南牛纯种小母牛的耳朵皮肤组织,而使用的卵母细胞取自于屠宰场宰杀后的母牛卵巢。“波娃”与其供体细胞的遗传物质完全相同,而与其代孕母亲———荷斯坦奶牛在遗传上分属不同来源。该次克隆成功属国际首次,此次克隆中国优质黄牛的成功使目前挽救濒临灭绝的优良黄牛品种成为可能。
4、克隆宠物
2004年8月6日美联社报道:美国加州“遗传储存与克隆”公司近日正式宣布,他们成功地培育出了世界上首对克隆宠物猫,今后,他们将在世界范围内推广宠物克隆业务,需要交纳5万美元的“克隆费”,你家的宠物就可以有个一模一样的伙伴了。
5、医药领域
由于克隆动物的遗传背景相同，因此它们是模拟疾病、基因治疗、器官移植等研究的良好实验材料，具有良好的稳定性和重复性。
利用克隆技术，可以用患者本人细胞培育出新组织，用来治疗糖尿病、帕金森氏症、神经损伤等多种疾病。用这种方法培育出的组织不会产生免疫排斥反应，具有与患者正常组织完全相同的基因构成。
随着人类胚胎干细胞培养技术的完善，科学家已开始研究利用克隆技术培育人胚胎，希望大批量生产治疗疾病的干细胞。
移植器官来源不足是各国存在的普遍问题，所以人们开始致力于异种器官移植和克隆器官移
植的研究。利用克隆动物的胚胎干细胞作异源移植，以解决人类移植器官供求矛盾。
目前我国的年器官移植数量已经位居世界第二，其种类和成功率也都达到或接近国际先进水平。
但还存在着基础研究薄弱、研究体系分散和社会捐献活体器官意识不强、数量较低以及相应立法不完备等问题。
未来人类器官移植治疗将集中在人对人的同体器官移植、动物对人的异体器官移植和克隆人体器官移植等方面。
其中克隆人体器官更具有光明的前景，将解决一系列移植方面的关键问题，不过目前其实际运用还为时过早，因为虽然现在可以复制具有机械功能的脏器，但如何还原其生化作用还有待于探索。
7.2.5 正确看待克隆技术
1、技术尚不成熟
现阶段克隆动物等技术尚不成熟，还处于探索阶段。目前所得到的克隆动物具有极大的偶然性和随机性。迄今为止，克隆试验的成功率始终很低。（在培育多莉的过程中，科学家共克隆出277个绵羊胚胎，最终成功使母羊受孕并生产的只有多莉一个。此外，克隆动物夭折率高，不少克隆动物天生患有疾病或体形过大。）
2、克隆动物的体细胞突变、寿命及其他遗传问题
基因突变与DNA复制次数紧密相关。分裂越多的体细胞发生突变的可能性就越大，这与通过克隆迅速获得大量动物个体的目的相矛盾，是克隆动物材料来源不可避免的问题。
同时，由于克隆是无性繁殖，克隆动物没有遗传物质的交流和互补，将会加剧一些遗传疾病的发生。
此外，出于体细胞分裂代数是有限的，因此克隆动物的寿命是否会受到体细胞分裂代数的影响，也尚不清楚。
2002年1月，“多莉”被诊断患有严重的关节炎，这是科学家对克隆生命的前景表示出担扰。绵羊的平均寿命为为13年，多莉5岁半就患关节炎显然过早。
在多莉诞生后的3年多时间内，已获得了许多成活的体细胞克隆动物。但是，在大多数研究中，都出现了高频率的出生体重增加，以及胎儿或新生儿的死亡。因此、就目前的研究来看，动物克隆技术要实现产业化是非常困难的。
3、是否是完全的“复制”
就遗传的角度而言。克隆动物的性状可能与其来源的亲本完全相同，但是至少以下一些因素会影响克隆动物的遗传性状：
(1)细胞突变
(2)受体卵细胞的细胞膜和细胞质差异
(3)受体遗传上或生理上的差异
(4)后期生长的环境与驯化
大多数人认为，克隆是复制的同义词，复制品与原件是完全一样的。DNA的复制结果就是如此，所以复制用于DNA的合成是一个非常确切的术语。
克隆则是一个过程，克隆产生的个体还需进行胚胎发育和胎后发育，克隆个体与原件之间有一段年龄差异。由于发育过程既受基因主宰又受环境调控，而克隆与其原本尽管基因相同，所处环境却绝不会相同，所以，克隆与其原本不可能像复制品与原件那样完全一样的。
再者，虽然克隆个体是由核移植产生的，但由于重建细胞的细胞质并非来自原本，而我们知道细胞质中也有遗传物质，它们必然会对个体产生影响，所以不能把克隆个体看成是原本的复制品。
尽管从遗传结构上看克隆个体和原本是姐妹(兄弟)关系，但从年龄上看它们却是亲子关系。
无性繁殖的生物仍然有”代”的概念，克隆个体也应有”代”的概念。
而且，克隆个体和原本是可以同时存在。因此，准确地说，克隆个体可以看成是原本的再生，但不是原本的复活。
4、克隆动物可应用型的思考
有性生殖是生物在长期进化过程中的自我选择、适应环境的结果，是一种有利于种族繁衍和生存的生殖方式。
从这个角度来讲，用克隆动物繁殖生物可能给生物的生存和自然界带来意想不到的后果，同时，最关键的是，这种繁殖方式会造成基因的丢失，不利于遗传物质和生物多样性的保护。于是，有学者认为，克隆动物是违反生物进化规律的，是一种倒退。
5、总之，克隆技术的低效率以及克隆动物后代出现的体重增加、体弱多病等事实，使得单独的克隆技术在近期内难以得到推广应用。在克隆技术还不成熟的今天，人类要克隆出健康的动物是相当困难的，克隆技术在实践中真正应用还有相当长的路要走。
**克隆人问题
克隆不能产生相同的人
人类克隆自己是不道德的
许多国家都立法禁止克隆人
“科学是一柄双刃剑”，如果有人利用克隆技术来克隆人，那会给人类带来无穷的灾难。
克隆技术简介
克隆技术介绍 张勋学号：160820216 摘要克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。 一、克隆技术实质 1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克 隆(Clone)”的术语。学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。早在1938年，德国胚胎学家Speman 最早提出克隆设想。1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。 克隆也可以理解为复制，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪70 年代初DNA 体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。 正向遗传学途径以待克隆的基因所表现的功能为基础，通过鉴定基因的表达产物或表型性状进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着DNA测序技术和生物信息学的发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。目前，在玉米，水稻、油菜、拟南芥、烟草、番茄等多种植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。现对在植物基因克隆过程中运用的主要技术进行综述，以把握植物基因克隆技术的发展历程，并对未来的发展趋势进行展望。
软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)
注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。 1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。 2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双抗。 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7% Argrose上胶，降温后 放入42℃水浴锅中保持。 4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3 个复孔。 5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每 孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml 1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。 6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞， 作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。 7、铺上胶：按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需 先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS）+2ml0.7% Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO2，37℃，培养2－3 周。 8、间隔2天补加200ul 10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。 9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数 视野中大于50个克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。
2020高考生物二轮复习基因工程与克隆技术学前诊断
【2019最新】精选高考生物二轮复习基因工程与克隆技术学前诊断 分子β肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题： (1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的__________序列发生改变。 (2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作________(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作________________________。 (3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的____________，以其作为模板，在______________酶的作用下反转录合成cDNA。cDNA与载体需在____________________酶的作用下，拼接构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。 (4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取________，用相应的抗体进行__________杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。 解析：(1)基因是具有遗传效应的DNA片段，遗传信息储存在基因碱基对的排列顺序中。(2)蛋白质工程是指通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，故题中所述不属于蛋白质工程。(3)利用逆转录法获取目的基因时，需先提取mRNA，在逆转录酶的作用下逆转录合成cDNA。cDNA与载体需要在限制酶和DNA连接酶的作用下拼接构建成基因表达载体，才可导入受体菌。(4)检测目的基因是否翻译成蛋白质，需要从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。 答案：(1)碱基对(2)不属于没有对现有的蛋白质进行改造(3)mRNA 逆转录限制酶和DNA连接(4)蛋白质抗原—抗体 2．下图是科学家利用大肠杆菌生产人胰岛素的部分过程。请结合相关知识回答
《克隆技术》教案
第二节克隆技术 一、【教材分析】 前面学习了动植物的生殖和生物的遗传和变异的特征。本课是以此为基础，在学生已有的认知和经验基础上，进一步引领学生感悟生命过程的复杂多样，讨论克隆技术给人类带来的影响，思考科学技术的双面性。 二、【教学目标】 （一）知识目标： 1、能通过讨论等方式探究克隆技术带来的影响；能将所收集的资料进行整理，设计成有条理的讲演 稿向其他人介绍；能有一定根据地提出自己的观点，并能对其他同学的观点进行评价。 2、能体会到科学技术的“双刃剑”含义。（难点） 3、能用自己的话解释克隆技术。 4、能从正反两个方面说出克隆技术给人类带来的影响。（重点） （二）能力目标： 1.学会收集资料，能通过各种方法和途径收集到有关克隆技术的发展的资料。 2.学会交流和汇报，能够将自己的收获展示给大家，并能够在交流活动中获得他人的信息。 （三）情感目标： 1.通过收集有关克隆人方面的信息，增强关注社会热点问题的意识； 2.通过分工合作，培养团结互助的协作精神； 3.激发对生物技术发展研究的兴趣和探究的欲望。 四、【教学准备】 教师准备： 收集相关的资料和图片作成多媒体课件； 学生准备： 1、准备“假设我会克隆”小作文；
2、收集有关克隆人方面的信息和资料，为“关于是否应该禁止克隆人的辩论”做准备。 五、【教学过程】 教学环 节及时间安排教师活动学生活动 设计意 图 一、创设情景，激发兴趣： （3分钟）1、【展示】孙悟空图片或视频： 2、【提问】你喜欢孙悟空吗？他有哪些本领？ 3、【过渡】孙悟空拔出一根毫毛能变出千万个一 样的自己来。这个神话引发人类复制自身的幻 想，用现代的眼光看就是“克隆”。今天我们学 习第二节克隆技术。 回答孙悟空会：①七 十二变；②腾云驾 雾；③有一双火眼金 睛，能看穿妖魔鬼怪 的伪装；④一个筋斗 能翻十万八千里；⑤ 拔一根毫毛变出一 样的自己等。 孙悟空 形象和故 事，家喻户 晓。易于激 发学生学 习兴趣。 二、知识回顾: （4分钟）1、【展示图片过渡】植物的“克隆”，老百姓可 能每天都在做。 扦插 嫁接 2、【提问】 植物的扦插、嫁接、压条、组织培养和用种子繁 殖相比，有什么特点？ 3、【过渡】无性生殖在生物学上就叫“克隆”。 植物的克隆我们每天都可以做，高等动物的克隆 看图片回顾植物的 扦插、嫁接、压条、 组织培养的知识。 思考回答：扦插、嫁 接、压条、组织培养 都是无性生殖，没有 两性生殖细胞的结 合而直接由母体产 生新个体。 学生对无 性生殖很 熟悉，但不 知道无性 生殖就是 克隆。教师 利用原有 的知识做 基础，引导 学生回顾、 复习。使课 堂能够顺 利过渡到 克隆技术。
细胞克隆形成实验
细胞xx形成实验 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。 每个克隆含有50以上的细胞，大小在之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大： 一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法： 平板集落形成实验、软xx集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 平板xx形成实验基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。 置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 软xx培养xx形成试验基本步骤： (1)取对数生长期细胞，用%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。 (2)用蒸馏水分别制备出%和%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。 (3)按1:1比例使%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。 (4)按1:1比例让%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入的细胞悬液，充分混匀，注入铺有%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。 待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。
克隆技术的发展与应用前景
克隆技术的发展及应用前景 克隆通常是一种人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（如植物）。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。克隆可以是自然克隆，例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体（就像同卵双生一样）。但是通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的复制。克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”，它已经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 目前，克隆技术发展十分迅速。各国政府有关人士、民间对克隆技术的评价褒贬不一。克隆技术已展示出广阔的应用前景，包括以下四个方面： （1）培育优良畜种和生产实验动物； （2）生产转基因动物； （3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法； （4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。 在不久的将来，克隆技术技术将可以用来治疗糖尿病、中风、癌症、爱滋病、心脏病以及诸如帕金森综合症等精神疾病，并极大改变现有的器官移植理论和治疗手段，给人类带来福音。 克隆技术会给人类带来极大的好处，例如，英国PPL公司已培育出羊奶中含有治疗肺气肿的a-1抗胰蛋白酶的母羊。这种羊奶的售价是6千美元一升。一只母羊就好比一座制药厂，用什么办法能最有效、最方便地使这种羊扩大繁殖呢？最好的办法就是“克隆”。同样，荷兰PHP公司培育出能分泌人乳铁蛋白的牛，以色列LAS公司育成了能生产血清白蛋白的羊，这些高附加值的牲畜如何有效地繁殖？答案当然还是“克隆”。母马配公驴可以得到杂种优势特别强的动物——骡，骡不能繁殖后代，那么，优良的骡如何扩大繁殖？最好的办法也是“克隆”，我国的大熊猫是国宝，但自然交配成功率低，因此已濒临绝种。如何挽救这类珍稀动物？“克隆”为人类提供了切实可行的途径。具体应用有以下几个方面： 转基因动物研究 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和
细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验 This manuscript was revised by the office on December 22, 2012
细胞克隆形成实验 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法： 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 平板克隆形成实验基本步骤：
1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。 3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：
2019届高考生物二轮复习克隆技术教案(浙江专用)
列叙述正确的是() A．三者都涉及基因工程技术 B．三者都是在细胞或细胞器水平上的操作 C．克隆动物属于无性生殖范畴 D．人工种子的胚状体是由受精卵发育而成的 【解析】乳腺生物反应器采用了基因工程技术，人工种子和克隆动物都采用了细胞工程技术，克隆动物是由重组细胞发育成完整的个体，该个体并非由受精卵发育而来，因此克隆动物属于无性生殖的范畴，人工种子的胚状体是由植物组织培养获得的，并非由受精卵发育而来。 【答案】 C 关于哺乳动物细胞体外培养的难易程度，下列表述正确的是()
A．乳腺癌细胞易于乳腺细胞；胚胎细胞易于脂肪细胞 B．乳腺细胞易于乳腺癌细胞；胚胎细胞易于脂肪细胞 C．乳腺细胞易于乳腺癌细胞；脂肪细胞易于胚胎细胞 D．乳腺癌细胞易于乳腺细胞；脂肪细胞易于胚胎细胞 【解析】哺乳动物的乳腺细胞和脂肪细胞都是高度分化的细胞，体外培养难度大，乳腺癌细胞能够恶性增殖，容易进行体外培养，胚胎细胞具有很强的分裂增殖能力，容易进行体外培养，A正确。 【答案】 A 1. (1)均能打破物种之间的生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍。 (2)均能按照人的意愿定向改良生物性状。 2．不同点 (1)原理不同：细胞工程是细胞(或细胞核)的全能性，细胞膜的流动性及细胞增殖；基因工程是DNA分子组成、结构和遗传密码的统一性。 (2)操作水平不同：细胞工程是细胞或细胞器水平；基因工程是分子水平。 (3)工具酶不同：细胞工程用到纤维素酶和果胶酶(植物体细胞杂交)或胰蛋白酶(动物细胞培养)；基因工程用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶。 (4)目的不同：细胞工程是为了改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品；基因工程是创造出人们需要的新的生物类型和生物产品。 3．联系 (1)转基因植物的获得离不开植物组织培养。 (2)转基因动物的培育离不开动物细胞培养。 下列生物工程技术中，不属于细胞工程的是() A．通过试管动物大量繁殖优良动物 B．利用含有人胰岛素基因的大肠杆菌生产胰岛素 C．通过体细胞克隆技术培养出克隆羊 D．将某人的肝癌细胞在实验室中繁殖成一个细胞系
克隆技术发展简介
克隆技术简介 克隆技术，是由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一个生物完全一样。克隆可以是自然克隆，例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体（例如同卵双生一样）。但是我们通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的复制。 “克隆”的来源及发展 克隆技术，已经经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 克隆技术的设想是由德国胚胎学家于1938年首次提出的，1952年，科学家首先用青蛙开展克隆实验，之后不断有人利用各种动物进行克隆技术研究。由于该项技术几乎没有取得进展，研究工作在80年代初期一度进入低谷。后来，有人用哺乳动物胚胎细胞进行克隆取得成功。1996年7月5日，英国科学家伊恩·维尔穆特博士用成年羊体细胞克隆出一只活产羊(多莉)，给克隆技术研究带来了重大突破，它突破了以往只能用胚胎细胞进行动物克隆的技术难关，首次实现了用体细胞进行动物克隆的目标，实现了更高意义上的动物复制。 多莉与那头6岁母羊具有完全相同的基因，可谓是它母亲的复制品。具体有四个步骤如下 ①从一只六岁雌性的芬兰多塞特(Finn Dorset)白面绵羊（称之为A）的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为供体细胞。 ②从一头苏格兰黑面母绵羊（称之为B）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞。 ③利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成融合细胞。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞。 ④将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（称之为C）的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊多莉。 换言之，多莉有三个母亲：它的“基因母亲”是芬兰多塞特白面母绵羊（A）；科学家取这头绵羊的乳腺细胞，将其细胞核移植到第二个“借卵母亲”——一个剔除细胞核的苏格兰黑脸羊（B）的卵子中，使之融合、
4重组表达质粒的构建——基因的克隆
重组表达质粒的构建——基因的克隆 长片段基因在大肠杆菌中表达往往比较困难，作为抗原使用的重组蛋白可以考虑选择抗原性好的区段原核表达，前文已作阐述。对整个蛋白结构研究，必须全长表达该蛋白，此时最好考虑真核表达系统，特别是含有跨膜区的蛋白。 选定要克隆的区段，需先富集纯化之后才方便插入载体，常用的富集方法是PCR或者质粒繁殖复制。为了防止在PCR扩增过程中引入碱基错误或者碱基缺失，PCR扩增基因时候必须使用高保真Taq酶。为了满足科研工作者不同实验需求，福因德生物将高保真Taq酶优化为即用型Mix，使用时直接加引物和模板就可以扩增。除此之外，福因德生物还开发出LA Taq、S-Taq Mix以及SYBR荧光定量PCR Mix(需要更高品质的可选用SYBR PCR SuperMix)。 原核重组表达常用克隆技术主要有以下几种： 1）酶切连接 这个是目前应用最为广泛的的克隆技术，主要优点是技术稳定；缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的成败。如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，比如，批量克隆基因到某个载体上，可一次性大量双酶切将载体线性化后保存备用，每次构建载体只需酶切外源基因片段，载体可直接取用，不必每次都酶切，省时省力（此处需特别留意的是基因内部不能有与上述所用冲突的酶切位点）。 2）TA克隆 TA克隆必须使用商业的线性化载体，线性载体3′末端有一个T碱基，与PCR扩增产物3′末端A正好匹配。这种克隆策略最大的优点是载体使用方便，扩增产物可以直接克隆到载体上，不需要酶切位点等冗余序列；缺点是：必须依赖商业化载体，载体选择受限；扩增外源片段所使用的Taq酶也必须是可以在3′末端加A，这种Taq酶的保真度不高；外源片段插入之后还必须鉴定方向。目前，这种构建表达载体的策略已经逐渐被淘汰。 3）TOPO克隆 TOPO克隆载体利用DNA拓扑异构酶I识别序列中的CCCTT松弛双螺旋并重新连接，同时兼具限制性内切酶和连接酶的功能。主要原理是在T载体的T碱基上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，其克隆效率提高数倍，并且操作极其简单，整个反应体系不需要在添加连接酶成分。如果在线性化平端载体上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，平端连接将不再是难题，如果再配合一个致死基因ccdB （Control of cell death）使用，凡是没有插入外源核酸序列的空载体自连，转入大肠杆菌可以正常表达ccdB蛋白，破坏细菌DNA gyrase(促旋酶)，造成细菌染色体降解而死亡；而插入外源核酸序列的会干扰ccdB蛋白的正常表达，细菌可以正常存活，平端克隆高背景问题这样得以完美解决。 4）Gateway技术 该技术所依赖的基础是lambda噬菌体的位点特异性重组反应。需要限制酶切回收、T4 Ligase连接；该方法一步就可以完成，只需要将基因克隆到入门载体（Entry Vector）,依赖载体上的特定的重组序列和重组酶，将外源基因克隆到具有相同重组序列的载体上；入门载体一般包含两个attL1和attL2,中间夹杂一个ccdB自杀基因，自连的空载体在转入大肠杆菌中都不会存活。入门载体构建成功之后，就可以轻松地将入门载体和目的载体质粒混合加入重组酶即可发生重组，生成所需要的融合质粒，当然还有一个副产品质粒。这种克隆方法适合于将一个基因批量化构建到不同载体系列中进行功能测试。这种技术也适合于大批量的文库构建，具体细节在此就不做赘述。 该技术主要的缺点是：该技术系统使用的酶非常昂贵，而且酶非常不稳定；其次，适合于gateway技术的载体非常少，只有一个厂家生产而且昂贵，来源受限；对于大片度（>10Kb）的效率很低，与传统的酶切-T4连接技术相比没有优势。 5）Infusion技术 这个是目前比较流行的克隆技术，可以任意载体任意基因片段快速实现多片段、长片段定点定向克隆，
细胞克隆形成实验
机密提醒：这份文件及其传真件、复印件所包含的机密或法律保护信息是只提供给这份文件上所指定的个人或机构。如果您不是预定接受者，我们提醒您严禁以披露、拷贝、散发或任何形式利用这份文件及其传真件、复印件的内容。如果您错误的接收到这份文件及其传真件、复印件，请立即通知我们以便我们可以安排文件及其传真件、复印件返还并不会让您负担任何费用。 第 1 页 共 1 页 细胞克隆形成实验 一、 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。[晶莱生物] 二、实验方法 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 三、注意事项 (a)琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。因此高压灭菌后应进行分装； (b)细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响； (c)软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞； (d)接种时细胞密度适度，不可过高。 细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%，甚至无法形成单个克隆。因此，为了提高克隆形成率，有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。 四、周期 1-2个月
2017届高考生物二轮复习基因工程与克隆技术学前诊断
“基因工程与克隆技术”学前诊断 考点一基因工程与蛋白质工程 β肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题： (1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的__________序列发生改变。 (2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作________(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作________________________。 (3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的____________，以其作为模板，在______________酶的作用下反转录合成cDNA。cDNA与载体需在____________________酶的作用下，拼接构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。 (4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取________，用相应的抗体进行__________杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。 解析：(1)基因是具有遗传效应的DNA片段，遗传信息储存在基因碱基对的排列顺序中。 (2)蛋白质工程是指通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，故题中所述不属于蛋白质工程。(3)利用逆转录法获取目的基因时，需先提取mRNA，在逆转录酶的作用下逆转录合成cDNA。cDNA与载体需要在限制酶和DNA连接酶的作用下拼接构建成基因表达载体，才可导入受体菌。(4)检测目的基因是否翻译成蛋白质，需要从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。 答案：(1)碱基对(2)不属于没有对现有的蛋白质进行改造(3)mRNA 逆转录限制酶和DNA连接(4)蛋白质抗原—抗体 2．下图是科学家利用大肠杆菌生产人胰岛素的部分过程。请结合相关知识回答问题： (1)除图示方法获得目的基因(人胰岛素基因)外，还可通过__________的方法获得目的基因。 (2)图示所获得的人胰岛素基因在大肠杆菌中不能表达，需要质粒为其提供________________等调控因子；质粒含有一个或多个__________切割位点，供目的基因插入
第四节克隆技术的应用和难题
第四节克隆技术的应用和难题 一、克隆技术的应用领域 克隆技术已展示出广阔的应用前景和有价值的应用，概括起来大致有以下五个方面： （一）生产转基因动物 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100％的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因），3只带有标记基因，目的外源基因整合率高达50％。Cibelli（Science，1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。 目前，克隆技术在英国又有了新的进展，他们把这一技术应用于人类造血事业。英国的PPL公司是克隆技术的经济后台，它的主管罗思詹姆斯博士说：“从研究“多莉”中我们知道，我们可以用一个细胞制造出一只转基因动物。我们现
第8章 细胞重组与克隆技术
第8章细胞重组与克隆技术 8.1细胞重组 8.1.1细胞重组定义 指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。 8.1.2细胞重组的特点与意义 8.1.3细胞重组方式 细胞重组的方式基本分为以下三种： （1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种。 （2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体。 （3）胞质体与核体重新组合形成重组细胞。 8.1.4细胞重组材料的获得 8.1.4.1 胞质体（cytoplast)的获得 定义：是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。 制备方法：用细胞松弛素B处理体外培养细胞能诱发其排核。借助细胞松驰素的这种作用，结合高速离心可以得到胞质体。 制取容器及条件 结构特点：植物细胞的胞质体内的细胞器与完整细胞相同，具有内质网系、线粒体、溶酶体、高尔基体和中心粒及微粒、微管等骨架系统，各细胞器仍占有固有的位置。 8.1.4.2 核体的获得 定义：与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。 制备方法： 8.1.4.3 微细胞(microcell)的获得 定义：又可被称为微核体，是只含有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。 制备方法：秋水仙素及其衍生物和长春花碱等有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。经体外培养，在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。 将从活细胞中拆散出来的胞质体、核体、微细胞作为材料，通过显微操作技术，在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新归合，加入病毒或化学物质如聚乙二醇（PEG）等融合因子，经过一段时间的作用，可以把它们重新装配成新的活细胞。 8.1.5 显微操作技术 借助显微操作仪进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各种物质的注入、测量微电位的变化等等操作。 8.2克隆技术 植物界——吊兰 动物界——孙悟空 8.2.1 克隆(clone)的定义 本意——是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。目前——指一种实现无性繁殖的操作，而不是一般意义上的无性繁殖（或无性繁殖操作）。关键技术——核移植。 克隆的三个层面 分子克隆：分子水平上的克隆。如基因克隆。 细胞克隆：细胞水平上的克隆。如制备单克隆抗体的杂交瘤细胞的克隆。 动物克隆或植物克隆：个体水平上的克隆。如利用营养繁殖和组织培养技术生产的植物。8.2.2 克隆的理论基础 细胞全能性。 细胞的分化。 植物界 *克隆现象在植物界普遍存在，既可以是自然的，也可以是人工的。
细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验 当单个细胞在体外增殖6 代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50 以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大： 一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法： 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 平板克隆形成实验基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DME培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37°C预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37C 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2?3周。 3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用 PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10?30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)X100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
gateway重组技术
河南农业大学牧医工程学院 1 Gateway 基因克隆 Gateway 基因克隆是由Invitrogen 公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。该技术利用专有的重组序列使得DNA 片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA 转移成为可能。 这一技术在插入的目的DNA 片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone ）。据Invitrogen 宣称Gateway 技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA 保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA 片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology ）。 一、Gateway 基因克隆的原理及机制 Gateway 被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector ）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector ，目的载体）上。 Gateway 的原理是建立在噬菌体DNA 定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF 、Int ）的作用下，lambda 的attP 位点和大肠杆菌基因组的 attB 位点可以发生定点重组，lambda 噬菌体DNA 整合到大肠杆菌的基因组DNA 中，两侧产生两个新位点：attL 和attR 。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis 和IHF 、Int 的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB 和attP 位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
肿瘤细胞软琼脂克隆形成实验
Soft Agar Colony Formation Assay Darren Carpizo, M.D. Overview: This assay is designed to assay a cell's ability to grow unattached to a surface and therefore suspended in agar. The assays are done in 6cm plates. A bottom layer of enriched media + agar is poured first (2.5ml), after solidifying this is followed by a layer containing a lower amount of agar and containing a specified number of cells (cell layer = 5ml), after solidifying a top layer is poured. The plates are placed in the incubator and after two weeks or so, colonies are counted by naked eye. 1)Make sol'ns of 2X Iscove's Media (Gibco BRL, dissolve one 1L packet in 500ml of water) and filter sterilize, make about 100 ml of 1X by diluting the 2X, separate from this 100ml make 100 ml of 1X Iscove's containing 10% FBS 2)Make Noble Agar (Difco) at 1.3% and place in 55° C water bath to keep in liquid phase 3)Determine the number of sample pairs you will be making (a sample pair consists of one plate control and one plate experimental. I usually made 4 sample pairs or an n of 4. Add one to this, so n of 4 +1 = 5 4)The bottom and top layer solutions are made as one and divided in half. The cell layer solution is made separately. 5)Determine the volume of reagents that make up each of the above solutions according to the following formula: Bottom/Top layer - 2X Iscove's 5ml X n sample pairs (5) = 25 ml FBS - 1ml X n sample pairs (5) = 5ml 100X Glutamine .1 ml X n sample pairs = 0.5 ml 1.3% Noble Agar - 5ml X n sample pairs = 25ml pour these volumes into a 50 ml conical and separate the total volume in 1/2 into one tube for the bottom and the other for the top **Do Not add the Agar until you are just ready to pour, so separate the total (without the agar) into a bottom and top tubes (the volume of agar that will be added to each will be 12.5ml) Cell Layer media - 2X Iscove's 2 X n = 10ml 1X Iscove's 4 X n = 20ml FBS 1 X n = 5ml 100X glutamine 0.08 x n = .4 ml Noble agar 2 X n = 10ml (again do not add this until ready to pour) 6)Pour 12.5 ml of 1.3% Noble agar to the bottom layer tube, mix thoroughly and pipette 2.5 ml to each of 8 plates, place in 37° C incubator 7)Trypsinize cells, collect disattached cells and spin down, rususpend pellet in 5ml of 1X Iscove's + 10% FBS for counting. Determine the conc of cells in cells/ml and then calculate