第3章菌种选育理论与技术

本章主讲内容

1. 概述

2. 微生物发酵工业用菌种

3. 育种技术

§3-1 概述

菌种选育是一门应用科学技术,其理论基础是微生物遗传学、生物化学等,而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良菌种,从而促进生产发展。

一、菌种选育的目的

(一)生产

1. 提高发酵产量

2. 改进菌种的性能

3. 产生新的发酵产物

4. 去除多余的组分

(二)科研

1. 了解菌种遗传背景

2. 提供分子遗传学研究材料

3. 获得带遗传标记的菌株

4. 生物合成途径的研究

5. 生物合成机制的研究

二、菌种选育的基本理论

1. 遗传与变异

2. 遗传与变异的物质基础

3. 基因突变的本质和遗传变异的类型

4. 突变的过程

5. 突变后的表型变化

6. 表型延迟

§3-2微生物发酵工业用菌种

一、微生物发酵工业用菌种的特点及要求

微生物发酵工业用菌种因不同的发酵对其要求各异，就是同一种产品的发酵生产，其菌种的特点和要求因不同的原料和生产设备的不同也有很大差异，例如：GA 的发酵：

以淀粉质为原料：要求V H-,

以糖蜜为原料：因为糖蜜本身含有非常丰富的V H……

但是作为工业微生物发酵使用的菌种，通常有下列特点：

1.具有稳定的遗传学特性

这对于工业化生产是很重要的，通常工业化生产整个周期很长，在一个发周期中，菌体至少应该增殖一次，在增殖过程中，菌体应该保证原菌的遗传学特征，（尽管菌体生长的环境改变了，压力、基质、溶氧等）

2.微生物生长和产物的合成对于基质没有严格的要求

换言之，可以广泛的使用各种原料作为生产用的底物，某些微生物对于底物有着严格的要求，对于碳源要求单一，这对于微生物的发酵工业提出了严格的要求，增加了生产成本。

3.生长条件易于满足

在微生物的工业化生产过程中，某些环境条件很难实现。氧的传递和供给就是一个很难完全满足的条件，特别是对于高粘度、高浓度的发酵体系。

对于微生物的生长往往存在一个“临界溶氧浓度”，低于这个溶氧浓度，氧就成了微生物生长的限制性因子，这个溶氧浓度越高，说明菌体生长条件越易满足，从另一种意义上讲，工业化的生产成本就越低。

pH值:中性偏酸性，偏碱性，强烈的pH值易改变产物和底物的状态。

4.对于细菌，希望具有抗Phage的能力。

5.具有较高的各种酶活力，可以在一定的范围内提高生长速率和反应速度，进而可

以缩短发酵周期，降低生产成本。

6.对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细胞

不易发生菌体自溶。

对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎；

对于基因工程菌，通常目的产物存在于包含体内，对于包含体，要求在细胞破碎是不易破碎，而在目的产物的分离提出时，则易破碎。

二、微生物发酵工业用菌种的种类

野生型

从菌种的遗传学特征上可以把菌种分为：

营养缺陷型

从微生物分类学的角度，分为

1.细菌类：短杆菌：GA,Gln,lys……

枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等

地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) α-Amylase

苏云金芽孢杆菌：BT生物农药……

梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等的发酵

2.酵母菌啤酒酵母：酿酒酵母、辅酶类物质的发酵

酒精酵母：

汉逊酵母：食品工业，用于乙酸乙酯的发酵

假丝酵母：scp生产，石油发酵

3.霉菌黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业（UV-11,UV-48）、酶制剂工业（糖化酶）

黄曲霉：酱油生产(3042)，面酱

青霉菌：青霉素的生产

红曲霉：红曲制造，用于南方红曲酒（女儿红）的生产；使用红色色

素的生产；豆腐乳的生产等

赤霉菌：赤霉素的生产，是一种植物生长激素

4.放线菌：各种抗生素，链、土、庆大等

§3-3 育种技术

目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种等方法，带有一定的盲目性，尚属于经典育种的范畴。随着微生物学、生化遗传学的发展，出现了转化、转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法。

1. 自然选育

在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。

所谓自然突变: 是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。一般认为引起自然突变有两个原因：

多因素低剂量的诱变效应

互变异构效应

菌种的自然突变往往有两种可能性:

菌种衰退，生产性能下降;

代谢更加旺盛，生产性能提高。

2. 诱变育种

2.l 诱变育种的基本原理

诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而

产生的遗传性状的变异。

突变主要包括染色体畸变和基因突变二大类。

（1）染色体畸变是指染色体或DNA片断的缺失、易位、逆位、重复等。

（2）基因突变是指DNA分子结构中的某一部位发生变化（又称点突变）。

2.2 诱变剂处理过程中几个有关的问题

化学诱变剂使用过程的安全性

诱变剂量的选择

诱变剂的选择

出发菌株的选择

2.3 诱变育种的一般步骤

诱变育种一般包括诱变和筛选两个部分。

诱变部分成功的关键包括出发菌株的选择、诱变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法。

筛选部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能力。

诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到达到高产菌株。

2.4 杂交育种

发酵工业的优良菌种的选育主要采用诱变育种方法。但是，一个菌种长期使用诱

变剂处理之后，其生活能力一般要逐渐下降，例如生长周期延长，孢子量减少，代谢

减慢，产量增加缓慢，诱变因素对产量基因影响的有效性降低等。因此，有必要利用

杂交育种方法。

杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合，

从中分离和筛选具有新性状的菌株。

3. 原生质体融合技术

所谓原生质体融合就是把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状体（称原生质体）。

两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。在再生成细胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子。

4. 基因工程技术育种

如果将一种生物的 DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。

这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。

4.1 基因工程育种的优点

可以按照人们的需求改变物种，获得人想要的性状，比如，转基因棉花就是通过基因工程技术，讲抗虫的基因导入棉花中，获得抗虫性状的棉花转基因大豆获得高蛋白含量，这种技术可以跨越种属，原则上，只要找到相应性状的基因，就可以实行基因改造。

不过目前这个技术还不成熟，还存在许多问题，不如基因导入的不确定性，转基因食品安全的问题。

4.2 基因工程技术育种的设计

（一）提高产量

1.增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数

2.增加或降低调节基因的作用

3.增加抗性基因

（二）改善抗生素组分

1.破坏分支途径的生物合成基因

2.破坏次要组分的生物合成基因

3.改进抗生素生产工艺

本章小结

1．介绍发酵工业生产中常用的微生物菌种以及对这些微生物菌种的要求。

2．分离和选育发酵工业微生物菌种的方法。

3．防止工业微生物性能衰退和对于退化菌株复壮的方法。

4．掌握种子培养基的配制原则和应注意的问题。

5．掌握高效菌种的选育

本章复习思考题

1．工业用微生物的要求有哪些? 试举例说明微生物在工业中的应用。

2．常用工业微生物的种类有哪些? 每种列举出三个典型代表，并说明其主要的发酵产品。

3．工业生产中使用的微生物为什么会发生衰退? 菌种衰退表现在哪些方面?防止菌种衰退的措施有哪些?

4．简要说明诱变育种的操作步骤。诱变育种应注意哪些问题?

5．试比较诱变育种技术、原生质体融合技术、DNA重组技术三种育种方法的优缺点。6．简述种子培养基的配制原则和应注意的问题。

7. 什么是增殖培养？为什么要进行增殖培养？

8. 基因工程育种在菌种选育中有那些方面的应用?

9. 简述原生质体技术育种的过程。

工业微生物菌种的选育、保藏与培养

工业微生物菌种的选育、保藏与培养自然环境中的微生物是混杂生长的，要想得到生产某一目的产物的野生菌株，就需要采取一定的方法将它们分离出来。菌株分离（separation）就是将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离和筛选是获得目的菌种的两个重要环节。菌株的分离要根据生产实际需要、目的代谢产物的性质、可能产生所需目的产物的微生物种类、微生物的分布、理化特性及生活环境等，设计选择性高的分离方法，才能快速地从环境或混杂了多种微生物样品中获得所需菌种。筛选方法也很重要，在设计筛选方案时有两点必须注意，即所采用方法的选择性和灵敏度。微生物细胞内含物及其周围的培养基成分非常复杂，目标产物往往又含量极低。因此，需要建立灵敏度高、快速、专一性强的检测方法。菌种收集和筛选途径：（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。（3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。发酵工业对菌种的要求如下：①能在廉价原料制成的培养基上生长，且生成目的产物产量高、易于回收；②生长较快，发酵周期短；③培养条件易于控制；④抗噬菌体及杂菌污染的能力强；⑤菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定；⑥对放大设备的适应性强；⑦菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。菌种筛选主要步骤：调查研究及查阅充分的资料筛选 ↓↓ 设计实验方案初筛（1株1瓶）↓确定采集样品的生态环境↓ 采样复筛（1株3～5瓶） ↓确定特定的增殖条件↓结合初步工艺条件摸索增殖培养再复筛（1株3～5瓶）↓确定特殊的选择培养基及可能的↓ ↓定性或半定量快速检出法3～5株平板分离↓ ↓单株纯种分离原种斜面↓生产性能试验及毒性试验↓确定发酵培养基础条件菌种鉴定一、菌种的分离筛选一）样品采集与预处理总的原则是：样品的来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。特别是在一些极端的环境中，如高温、高压、高盐等极端环境中，可找到能适应苛刻环境压力的微生物类群。 1、从土壤中采样土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。

菌种传代与复苏修订稿

菌种传代与复苏 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-

菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。菌种代号国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 传代和接种菌种冻干粉复苏把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。菌种斜面传代操作

培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述操作打开棉塞，将接种环深入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。菌种的培养与保存大肠杆菌35-37摄氏度培养48小时金黄色葡萄球菌30-35摄氏度培养48小时枯草芽孢杆菌30-35摄氏度培养48小时白色念珠菌23-28摄氏度培养7天黑曲霉23-28摄氏度培养7天将培养物管自培养箱取出后放入冰箱（2-8摄氏度）保存，一般2个月转种一次。菌悬液的制备取上述培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后，用接种环取菌苔少许接种至营养肉汤中（10ml/支，已灭菌），将已接种毕的细菌管置35-37摄氏度培养18-24小时，取出备用。一般于冰箱中保存可用两周。

微生物菌种保藏及复壮

微生物菌种保藏及复壮 5.1. 微生物菌种保藏在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重要。微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。 5.1.1. 蒸馏水悬浮法这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。好气性细菌和酵母等可用此法保存。 5.1.2. 斜面传代保藏斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。

因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。 5.1.3. 矿物油中浸没保藏此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验，因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏，为了预防不测，一般保藏菌株 2~3 年也应做一次存活试验。 5.1.4. 干燥-载体保藏此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。是将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。以沙土保藏用得较多，制备方法为：将河砂经24目过筛后用10%~20%盐酸浸泡

微生物菌种保藏方法

菌种保藏（一）、菌种保藏的目的微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要. （二）、菌种保藏的原理无论采用何种保藏方法,首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏,最好保藏它们的休眠体,如分生孢子、芽孢等.其次,应根据微生物生理、生化特点,人为地创造环境条件,使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态.这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧,另外,避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果. （三）、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏,不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这一改进可使菌种的保藏期延长. 该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变异和被污染. 2、石蜡油封藏法此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上,石蜡油层高出斜面顶端lcm,使培养物与空气隔绝,加胶塞并用固体石蜡封口后,垂直放在室温或4℃冰箱内保藏.使用的液体石蜡要求优质无毒,化学纯规格,其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分. 由于液体石蜡阻隔了空气,使菌体处于缺氧状态下,而且又防止了水分挥发,使培养物不会干裂,因而能使保藏期达1～2年,或更长.这种方法操作简单,它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等,对霉菌和酵母菌的保藏效果较好,可保存几年,甚至长达10年.但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差,尤其不适用于某些能分解烃类的菌种. 3、砂土管保藏法这是一种常用的长期保藏菌种的方法,适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌,对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用. 其制作方法是,先将砂与土分别洗净、烘干、过筛(一般砂用60目筛,土用120目筛),按砂与土的比例为(1～2)：1混匀,分装于小试管中,砂土的高度约1cm,以121℃蒸汽灭菌1～1.5h,间歇灭菌3次.50℃烘干后经检查无误后备用.也有只用砂或土作载体进行保藏的.需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养,再以无菌水制成108～1010个/ml菌悬液或孢子悬液滴入

菌种的选育

第一章菌种选育第一节工业常用微生物及要求一、常见微生物（一）细菌（bacteria）发酵工业中常用的细菌主要是杆菌,主要有：醋杆菌属（Acetobacter）乳杆菌属（Lactobacillus）杆菌属（Bacillus）:α-淀粉酶，蛋白酶，肌苷、鸟苷等核苷。其中最为重要的是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）短杆菌属（Brevibacterium）：谷氨酸棒杆菌属（Corynebacterium）：谷氨酸（二）放线菌（actinomyces）属原核微生物（有菌丝体，无横隔，不具完整的核。）最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibiotic）。链霉菌（Streptomyces）：红，金，土，氯，链霉素小单孢菌属（Micromonospora）：庆大霉素（三）霉菌（mould）亦称丝状真菌（不是分类学上的名词，凡在营养基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。） 1.曲霉属（Aspergillus）黑曲霉（A. niger）产蛋白酶，淀粉酶，果酸酶，变异菌株产柠檬酸米曲霉（A. oryzae）产淀粉酶，蛋白酶，酿酒的糖化曲和酱油曲黄曲霉（A. flavus）产黄曲霉毒素米曲霉和黄曲霉均为半知菌。 2.青霉属（Penicillum）：例如桔子上的绿色斑点桔青霉（P. citrinum）：产生5’－磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。 3.根霉属（Rhizopus）接合菌

米根霉（R. oryzae）华根霉（R. chinensis）酒药和酒曲中含有米根霉或华根霉。 4.红曲霉属（Monascus）淀粉酶，麦芽糖酶，蛋白酶，柠檬酸等。可生产食用红色素。（四）酵母（yeast）单细胞真核微生物，低等真菌。 ①酵母属（Saccharomyces）啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） ②假丝酵母属（Candida）产朊假丝酵母（Candida utilis）生产饲料酵母，其蛋白质和维生素含量都比啤酒酵母高。可利用糖蜜，土豆淀粉废液生产人畜可食用蛋白质。 ③毕赤酵母属（Pichia）产膜酵母，在液面形成白膜，是酿造物和酒类饮料的污染菌。（五）其它微生物 1.担子菌（basidiomycetes）即菇类（mushroom）担子菌资源的利用已经引起人们的重视。可用于多糖及抗癌药物开发。 2. 藻类（alga）是分布极广的一类自养微生物资源，许多国家把它用作人类保健食品和饲料。从蛋白质产率看，螺旋藻是大豆的 28倍，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20～35倍。（六）噬菌体（phage）凡用细菌和放线菌为生长菌株的发酵工业，均存在噬菌体的危害问题。噬菌体在自然界分布极为广泛。其三大特点是： ①体积比细菌小的多，可以通过细菌滤器。 ②没有细胞结构，由核酸的蛋白质构成。 ③营专性活物寄生，即只能在特异性寄主细胞中增殖。烈性噬菌体——引起寄主细胞迅速裂解。受感染的细菌称敏感性细菌。温和噬菌体——随寄主细胞的繁殖而繁殖。含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。

设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术

设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术一．实验目的 1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。二.实验原理菌种的分离纯化从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1.涂布平板法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 2.平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。大肠菌群的培养鉴定大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。菌种保藏菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的三.实验器材 1.菌种：污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌 2、培养基：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基和马铃薯固体斜面培养基。 3.器材：接种环、安培瓶、干燥器、冰箱、产气管、试管、培养皿、无菌平皿、无菌玻璃涂棒移液管、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 4.试剂：革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三（95%乙醇）、革兰氏四（蕃红）；试剂：医用液体石腊（比重0.83～0.89）。四．试验方法及步骤 1.大肠菌群的分离纯化第一天 a．涂布平板法：将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。第二天 b．平板划线法：经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果

菌种保存方法-

菌种保存方法：一.菌种保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。常用的有甘油菌保存：取灭过菌的1.5ml EP管，按照60%—80%甘油的加入量，保存零下80度。例：取37°培养过夜的菌液2-4ml甘油6-8ml，充分混匀后分装于1.5ml EP管中，置于-80°冰箱即可。 6．冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。二.常用的器材所要保存的微生物；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。三.各操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 1．斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、

第二章生产菌种的扩大培养、选育与保藏[1]

第二章生产菌种的扩大培养、选育与保藏目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢；产孢子能力的大小；及对营养、温度、需氧等条件的要求均有所不同。因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件：（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；（2）生理形状稳定；（3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；（4）无杂菌污染；（5）保持稳定的生产能力。第一节种子的制备过程在发酵生产过程中，种子制备的过程大致可分为两个阶段：（1）实验室种子制备阶段（2）生产车间种子制备阶段一、实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用两种方式：对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液

体培养法。（一）孢子的制备 1，细菌孢子的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37℃。细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。 2，霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为25~28℃。培养时间一般为4~14天。 3，放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28℃。培养时间为5~14天。（二）液体种子制备 1，好氧培养对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S. Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。其过程如下：试管→三角瓶→摇床→种子罐 2，厌氧培养（略）二、生产车间种子制备实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。 1，种子罐的作用：主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。 2，种子罐级数的确定种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于：（1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；（2）所采用发酵罐的容积。比如：细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶→种子罐→发酵罐霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵孢子悬浮液→一级种子罐（27℃,40小时孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27℃，10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐

菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程

菌种管理制度 1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。 3、定义标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。 4、职责 4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。 4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 5、规程 5.1菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。 5.2菌种的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。 5.3菌种的保存 5.3.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而

常用菌种保藏方法

微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。素而设计的。一、保藏方法大致可分为以下几种： 1、传代培养保藏法 2、液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3、载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4、寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5、冷冻保藏法 6、冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。二、器材: 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。三、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1、斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保

菌种选育和发酵培养基如何配制

菌种选育和发酵培养基如何配制如何选育菌种? 自然界中微生物资源异常丰富,土壤、水、空气、腐败的动植物残骸,都是微生物的主要集居和生长繁衍的场所.其种类之多,至今仍然是一个难于估测的未知数.以其集居环境(包括特殊和极端环境)、营养类型、生存方式、生理类型、代谢途径、合成能力等比较,均居生物界之冠.因此,微生物资源的开发和应用是当今世界瞩目的重大课题. 菌种的分离,不仅是把混杂的各类微生物有效地分开,得到纯种,更重要的是依着生产实际的要求,有的放矢、快速、准确地将能产生所需产物,或具有某种生化反应性能的菌种,从大量的微生物中挑选出来.有时是设计一种在分离阶段便能识别所需菌种的方法,更多的是利用特定的方法分离,获得所需菌种后,再进行识别.为了使获得的菌种能满足工业生产的需要,须考虑各种性能指标.因此,菌种分离和筛选的方法和策略就十分重要. 一般的菌种分离纯化和筛选步骤可分为采样、增殖与分离、发酵与性能测定等几个步骤.步骤和方法如下图所示: 发酵培养基如何配制? 首先需了解微生物需要的营养物质. (1)微生物需要的营养物质营养物质应满足微生物的生长、繁殖和完成各种生理活动的需要.它们的作用可概括为形成结构(参与细胞组成)、提供能量和调节作用(构成酶的活性和物质运输系统). 微生物的营养物质有六大类要素,即水、碳源、氮源、无机盐、生长因子和能源.

①水水是微生物的重要组成部分,在代谢中占有重要地位.水在细胞中有两种存在形式:结合水和游离水.结合水与溶质或其他分子结合在一起,很难加以利用.游离水(或称为非结合水)则可以被微生物利用. ②碳源碳在细胞的干物质中约占50%,所以微生物对碳的需求最大.凡是作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质,称为碳源. 作为微生物营养的碳源物质种类很多,从简单的无机物(CO2、碳酸盐)到复杂的有机含碳化合物(糖、糖的衍生物、脂类、醇类、有机酸、芳香化合物及各种含碳化合物等).但不同微生物利用碳源的能力不同,假单孢菌属可利用90种以上的碳源,甲烷氧化菌仅利用两种有机物:甲烷和甲醇,某些纤维素分解菌只能利用纤维素. 大多数微生物是异养型,以有机化合物为碳源.能够利用的碳源种类很多,其中糖类是最好的碳源. 异养微生物将碳源在体内经一系列复杂的化学反应,最终用于构成细胞物质,或为机体提供生理活动所需的能量.所以,碳源往往也是能源物质. 自养菌以CO2、碳酸盐为唯一或主要的碳源.CO2是被彻底氧化的物质,其转化成细胞成分是一个还原过程.因此,这类微生物同时需要从光或其他无机物氧化获得能量.这类微生物的碳源和能源分别属于不同物质. ③氮源凡是构成微生物细胞的物质或代谢产物中氮元素来源的营养物质,称为氮源.细胞干物质中氮的含量仅次于碳和氧.氮是组成核酸和蛋白质的重要元素,氮对微生物的生长发育有着重要作用.从分子态的N2到复杂的含氮化合物都能够被不同微生物所利用,而不同类型的微生物能够利用的氮源差异较大. 固氮微生物能利用分子态N2合成自己需要的氨基酸和蛋白质,也能利用无机氮和有机氮化物,但在这种情况下,它们便失去了固氮能力.此外,有些光合细菌、蓝藻和真菌也有固氮作用. 许多腐生细菌和动植物的病原菌不能固氮,一般利用铵盐或其他含氮盐作氮源.硝酸盐必须先还原为NH+4

第14章微生物的保存技术

第14章微生物的保存技术工业、农业、医学和科学研究的需要促进了微生物保存技术的发展。例如，当发现微生物就是某些传染性疾病的特殊病原时，为发展疫苗、抗生素和化学药品，人们需要分离、鉴定和保存微生物。农业上最明显的例子就是对固氮菌的研究，关于工业应用微生物的例子更是不胜枚举。微生物发酵还提供了大量的食品、饮料和药品。在分子生物学研究中，用先进的DNA重组技术可以修饰微生物（U.S.Congress 1981），微生物是基因工程的基础。微生物是重要的生物资源，保存微生物的目的，不仅使微生物菌株以活的生命状态保存下来，并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变。这也是保护微生物多样性的重要手段，还使后人能更好地应用先进技术开发和运用微生物，为人类造福。为此，世界各发达国家都设有专门的菌种保藏机构。如美国的典型菌种保藏中心（ATCC），英国的国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。我国也设有中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM）。微生物的保存方法很多，根据不同的微生物菌（毒）株或不同的实验要求，可选用不同的保存方法。这些保存方法的原理大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯种，再创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养等，使被保存的微生物减少代谢率及繁殖和利用营养的比率（Halliday，Baker 1985）。然而，所有减少代谢率的方法都会导致一定比率的活力下降。为了防止菌株的丢失，还需要开发出不仅能减少代谢率，而且能防止活力下降的方法。与保存技术有关、但较为费时的另一项关键性工作是档案记录（Halliday，Baker1985）。这一工作不仅包括菌种或毒株的培养史和诊断特征等方面的准确记录，还包括对保存物的定期复苏和培养记录，以确定其活力、验证其纯度及基因的稳定性。最常用的微生物保存法有冻干保存法和超低温冻存法（Gherna 1981；Halliday，Baker 1985；Malik 1990；Rudge 1991）。这两种方法均可保存相当长的时期（通常可长达30年）。其他保存微生物的方法还有：低温保存法、传代培养保存法、砂土保存法等（Gherna 1981）。 14.1 细菌的冻干保存法 14.1.1 一般概念冻干是目前最常用的微生物保存技术（Day，Mclellan 1995）。美国ATCC在1985年第16版《细菌、噬菌体和rDNA载体目录册》及1987年第17版《真菌／酵母目录册》中，记载有 11 000株细菌、噬菌体和rDNA载体及 21 000株真菌、酵母用冻干法保存（Gherna等本章作者：田保平，韦剑珊，俞乃胜

菌种传代与保藏作业指导书

菌种传代与保藏作业指导书 1.标准菌的来源标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。 2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备 3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮. 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、

余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。 i．储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。 3.4菌种确认用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。然后在30～35℃下培养2～3天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23～28℃下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。 3.5污染处理假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备储备菌种管 3.6菌种的传代与保藏

菌种保藏方法

菌种保藏方法 (来源:微生物保藏管理中心) 定期移植法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2 接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。 2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。

菌种选育与培养

第三章菌种选育与培养教学目的：1、熟悉工业发酵常用微生物种类；2、掌握菌种分离、筛选和选育的方法；3、掌握种子扩大培养方法和质量控制方法；4、掌握常规的菌种保藏方法。教学方法：讲授教学手段：使用多媒体课件教学内容：第一节重要工业微生物的分离及菌种要求 1、微生物资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中最多。 2、有的微生物从自然界中分离出来就能被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。 3、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选育转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 4、由于生物工业本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步变为工业生产用的微生物。一、工业生产常用的微生物 1、细菌（bacteria）：枯草芽胞杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等； 2、酵母菌（yeast）：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等； 3、霉菌（mould）：根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉、青霉等，用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等； 4、放线菌（actinomycetes）：链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等，常用菌种来自链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等； 5、担子菌（basidiomycetes）：通常所说菇类（mushroom）微生物，用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发； 6、藻类（algae）：用作人类保健食品和饲料，如螺旋藻、栅列藻；可通过藻类将CO2转变为石油，或获取氢能。二、微生物工业对菌种的要求目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种有下列要求： 1、原料廉价、生产迅速、目的产物产量高； 2、易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短； 3、抗杂菌和噬菌体的能力强； 4、菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。三、重要工业微生物的分离分离是指从含微生物的样品（如土壤、水等）中获得纯的或混合的培养物，是筛选具有潜在工业应用价值的微生物的第一个阶段，接着才能从以上分离物中筛选出那些能产生所需产物或具有某种生化反应的菌种。

(生物科技行业类)菌种保存和微生物常识

菌种保存和微生物常识 1、常用培养基的制备、灭菌与消毒营养：从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，满足生长和繁殖需要的一种生理过程。是生命活动的物质基础，是生命活动的起点。营养物：具有营养功能的物质。也包括光能。提供生物的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料。要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。 2、选用和设计培养基的原则、方法及制备过程原则：目的明确、营养协调、经济节约物理化学条件适宜方法：生态模拟、查阅文献精心设计、试验比较步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查培养基种类：一、按成分的不同分天然培养基、合成培养基、半合成培养基二、按培养基的物理状态分固体培养基、液体培养基、半固体培养基三、按培养基用途基础培养基、选择培养基、加富培养基鉴别培养基

消毒与灭菌：消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。方法：一、物理的方法：加热、过滤、辐射二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。加热法：（1）干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。 1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。 3、注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在<180°； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70°时才开箱门。（2）湿热法：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。高压蒸汽灭菌法： 1、设备：高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。

第3章 菌种选育理论与技术