免疫组化方法总结中关键环节及其原理解述.doc
一、酶免疫组化的关键环节
1、标本固定：固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原- 抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物
易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。
2、脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净
和锋利。否则，容易裂片和脱片等。
3、脱蜡和水化：这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60 度 20min ，然后立即二甲苯1-3 分别10min，但当天制好的切片可以60 度3-4h 。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。
4、抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，
从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到
弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：
中性的、高pH 的等）。我们实验室一般用微波修复中火6min*4 次，效果不错。注意微波修复后自然冷却30min 左右（只要你觉得修复液的温度达室温即可）。
5、细胞通透：目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k 等通透液。如 Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞
核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（>10um 厚切片）和免疫细胞化学中一般用Triton X-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。
6、灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的ABC法和 SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物
3%过氧化氢灭活时间短点，可
酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一
般
以10min 左右，而0。 3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后 4 度避光保存。不过，现在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰，推荐使用。
7、血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是
和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温或 37 度 10-30min 。
8、一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵
育温度有几种： 4 度、室温、 37 度，其中 4 度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般 37 度 1-2h ，
而 4 度过夜和从冰箱拿出后37 度复温45min。具体条件还要摸索。二抗孵育条件：二抗一般室温或37 度30min-1h ，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先
把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。
9、抗体稀释液：其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS 即可，但专用的抗体稀释液中除PBS 成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA 稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。正因为这种原因，我一直用国产的专用
抗体稀释液，一段时间在更换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果（提示可能一抗没有结合），最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的PH 值偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终
而出现假阴性结果。
10、切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强
清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3 次，而一抗孵育后的清洗均为 5 次*5min 。
注意：（ 1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（ 4） PBS的 PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，
当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议 PH在浓度是。（中性及弱硷性条件（ PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则
有利于分解）
11、 DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB 孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要
由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB 显色时间很短（如几秒或
几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩
短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延
长封闭时间；DAB 显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵
育时间过短（最好一抗 4 度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。
12、复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒- 数分钟，胞浆蛋白可以适当
时间长一点，而胞核蛋白则要短。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；
染色浅则再置于苏木素中染色即可。
盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）
后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。
13、封片：为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封
片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到
液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。
二、免疫荧光方法中的重要环节
1、冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组
织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。
2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min ，尤其要较长时间保存的白片，一定
要及时固定和适当保存。
3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，
减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min 。
4、一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种： 4 度、室温、37 度，其中 4 度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37 度 1-2h ，而 4 度过夜和从冰箱拿出
后 37 度复温 45min。具体条件还要摸索。
5、二抗孵育条件：二抗一般室温或37 度 30min-1h ，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还
要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓
度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配
制时小包装和并进行适当的离心。
6、复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI 复染。
7、封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，
方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封
片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，
这样一般不会产生气泡。
8、切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多
次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3 次，而一抗孵育后的清洗均为 5 次 *5min 。注意（ 1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（ 2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（ 4） PBS的 PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的
抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议 PH在浓度是。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利
于分解）
9、拍照：有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用
荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防
止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1~2h 为宜，超过90min ，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min 后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，
会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省
时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须
待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30 分钟后；标本染色后立
即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封
裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧
光镜油；电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及其对策
良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，
每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容
易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然
免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。
一、无色片
染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此
阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况：（1）切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。
出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行
染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不
可缺少的作用。（ 2）染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过
抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然
抗体失效在理论上是一个逐渐的过，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/ 或已超过有效期是主要
的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制
DAB 时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩
在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB 的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸
上不出现棕色反应，问题肯定在三抗或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的
原因。
解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试
剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如
果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照
包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋
巴结中存在T 和 B 细胞抗原， CD20或 CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或
细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选
择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中
不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或 Mart-1来检测，在正常的胃组织
中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确
定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织
之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同
的阳性对照，工作量会很大。为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织
切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，
比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上
皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。
设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。病理医生观察了HE 切片，了解切片中是否有
自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。抗
体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。
二、“杂音”染色片
免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音” 染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种。
1、全片着色
全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。
出现这种现象的原因有：
（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进
行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简
单的按说明书进行染色。
（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时
提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer ）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传
统的 1 小时，而是30 分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
（ 3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间
太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB 存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB 的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色
程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的
抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
（ 4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成
组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或 PAPPen在组织周围画圈，可以有效的避免液
体流失，也能提高操作速度。
（ 5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24 小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢
前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在 4 度冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。
（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买
的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
2、切片边缘着色
切片边缘着色也是一种常见的现象，这种现象称为边缘效应。产生的原因：（ 1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边
缘组织松脱漂浮在液体，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于 4 微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。（2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试
剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用 DAKO笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。
3、“阴阳脸”着色
指组织一半着色一半无着色，形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。其成因是试剂仅覆盖了部分组织而不
是全部。如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织上。通常应该在加完试剂后，仔细看一遍，是否有的组
织未被试剂完全覆盖，如有这种情况，建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引流开使之将组织全部覆盖。
另外，染片盒不平，切片倾斜，虽然开始试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边，部分组织未被试剂覆
盖。对于这种问题，只要留心或想到了很容易发现，也很容易解决。有时，用DAKO（或 PAP）笔在组织周围画圈时，划线太靠近或画到了组织上，由于笔油的力学原理，试剂不能达到靠近划线附近的组织。还有气泡也可
引起阴阳分明的着色，只是不着色区域是圆形，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此，气泡中心的组织不
着色。解决办法是滴加试剂时手法要轻，有气泡时用牙签捅破。
4、灶片状着色
切片中着色区东一块西一块，呈灶片状分布，出现这种问题的原因有：（1）裱片时水未排尽，在局部形成气泡
使组织突起，染色时试剂渗入后不易洗尽，显色过深所致。解决办法是，漂片盒里的气泡应去尽，晾片热台不
能平放，应有45 度左右的斜度，利于水流走和蒸发。（2）坏死组织灶，组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋
白游离、分解，复杂的肽链残段（如Fc 段）可能与一抗或/ 和二抗结合导致最终着色。解决办法是在选择染色
切片时应避免选择坏死组织较多的切片。（ 3）制作APES 胶片时，胶的浓度太高，干燥后在玻片上留下白色小
点，显色时白色小点着色。解决办法是按照标准的制备方法进行，即5%盐酸酒精（ 5ml 盐酸 +95%酒精 95ml）浸
泡玻片 4 小时、热水冲洗玻片 1 小时、蒸馏水洗玻片 1 分钟、丙酮浸泡玻片 5 秒钟后空气干燥（室温）、2%APES （ 2ml APES+98ml丙酮）浸泡玻片 5 分钟、玻片过一下丙酮（1-2 秒钟）、玻片过一下蒸馏水（1-2 秒钟）、 37 度过夜干燥、室温储存备用。如果制片过程中，因丙酮逐渐挥发而胶变浓时可适当加入一些丙酮。
5、间质着色
着色部位主要在间质，间质着色的原因很多，如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性
的连接而着色，加一抗前的血清封闭这一步就是为了避免非特异型的结合。又如血清中的免疫球蛋白常常渗出
到组织间质，很容易与抗体结合，造成间质着色，特别是lambda 和 kappa 染色时。当甲状腺胶质外溢到组织
间质时，做甲状腺球蛋白染色也会出现间质着色。抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色，我们曾遇到CD20 抗体不纯，除了染上 B 细胞外还染上了间质。
6、细胞浆着色
胞浆着色是所有“杂音”染色中最具有欺骗性的着色，着色区局限在细胞内，间质无着色，看上去与真实的免
疫反应着色几乎一样，很难区别。胞浆里含有较多的蛋白质，因此，很多非特异性的染色除了见于间质也可以
出现在胞浆中。这种原因造成的着色，可以通过血清封闭解决。还有因内源酶造成的着色，如血红蛋白（红细
胞）、肌红蛋白（肌细胞）、细胞色素（粒细胞、单核细胞）、过氧化氢酶（肝、肾），这些可用过氧化氢进行封闭。巨噬细胞吞噬各种抗原物质或Fc 片断而出现胞浆着色，这种着色不易避免，但可以通过形态学辨认出巨
噬细胞而引起重视。内源性生物素的着色最具有欺骗性，因为它广泛的存在于组织细胞中，我们研究结果显示：
冰冻组织中存在内源性生物素，经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭，加热抗原修复后造成内源性生物素暴
露，内源性生物素暴露的强度在不同的组织有所不同，从弱阳性（+）到强阳性（ +++），内源性生物素在组织
中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中，内源性生物素广泛存在于上皮
源性组织，特别是腺上皮组织，亦存在部分非上皮组织，内源性生物素不仅存在人体组织也存在大鼠组织，内
源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增加依次为：柠檬酸、EDTA、 EGTA，热抗原修复暴露的内源性生
物素可被鸡蛋清封闭，非生物素检测系统Polymer 两步法（ EliVision 、 EnVision ）可避免生物素干扰。
7、细胞核着色
不适当的组织处理可以出现细胞核着色，如组织在二甲苯里浸泡时间太长（如从星期五浸泡到下星期一）、缓冲液中浸泡时间太长、组织变干、微波修复液的pH 值和修复时间不当或修复过程中修复液留下得太少，未没
过组织等。解决办法是严格按照操作常规进行工作。
免疫组化技术常见问题及其解答集锦
1、石蜡切片和冰冻切片的比较？
（1）要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是今天我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高
温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可
作冰冻切片。
（2）冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细
胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买
一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能
做。
（3）石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在
-80 度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片
可以切到 4 微米左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/ 形态都较冰冻切片好。
2、一抗的选择要点和技巧是什么？
（1）单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与
单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也
可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克
隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲
和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。
（ 2）应用范围的选择。有的一抗只能用于Western blotting ，或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表
明石蜡切片或冰冻切片。
）。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗
（ 3）种属反应性的选择（ species reactivity
体适合检测哪种种属动物体内的抗原。
（4）种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相
应的二抗。
（ 5）生产厂家的选择。如 santa Cruz 公司抗体一般1ml ，价格 2100 元左右；而 chemicon 公司一抗一般100ul ，价格 2800 元左右。这两个厂家的同一种抗体它的实际效价稳定是不同的，我一般用后者抗体做免疫组化效果
较好，而前者做 Western blotting 效果还可以。
3、在什么情况下使用Triton-X100
（ 1） Triton X-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学（>10um 厚切片）和免
疫细胞化学中一般用Triton X-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。
（2）其作用原理： Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进
入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
（3） Triton X-100 既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。
4、封闭血清的选择原则是什么？
（1）膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！
（2）封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生
结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。
（3）也可以用小牛血清、 BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
5、抗体孵育条件的比较？
（ 1）一抗孵育温度有几种： 4 度、室温、 37 度，其中 4 度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，
一般 37 度 1-2h ，而 4 度过夜和从冰箱拿出后37 度复温 45min。
（ 2）二抗一般室温或37 度 30min-1h ，具体时间需要摸索。
6、一抗 4 度孵育后为什么要进行37 度复温？
（ 1）一方面，防止切片从 4 度直接放入PBS易脱片；
（ 2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用， 4 度和 37 度时分子运
动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
（ 3）其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从 4 度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩！
7、 DAB显色时间如何把握？
（1） DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；
（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵
育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；
（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；
（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间
过短（最好一抗 4 度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。
8、免疫组化结果如何分析？
（ 1）阳性着色细胞计数法。在40* 光镜下，随机选择不重叠的10 个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每
组 3~6 张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。
（ 2）灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。
（ 3）评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4 分为 0~25%、 26~50%、 51~75%、 76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。
对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高
质量切片。
9、在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？
（1）由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失
去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。
（2）修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以
查阅相关资料，大量的：中性的、高pH 的等）。
（3）微波修复，我们一般用 6min*4 次，效果不错。
10、内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？
（ 1）一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min 左右；而0。 3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min 。
（2）用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或 PBS 可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱
片。
（3）现用现配，配好后 4 度避光保存。
11、如何才能充分脱蜡？
（ 1）蜡不溶于水，如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均匀、阳性物时隐时现、真假难
辨、背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短；
（2）脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜谋面是在不同。如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，
则脱蜡时间不需很多， 3-5 分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，
10-20 分钟或更长。
（3）当天切的切片，烧烤2 小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好
烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温 10-20 分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果魁伟更好。
总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定，脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完
全地脱去切片上的蜡。
12、如何最大限度地降低组织非特异性染色？
（1）缩短一抗 / 二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。
（2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。
，需要通过延长灭活时间（ 3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组
织）和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
（4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强
封闭效果；
（5）缩短 DAB孵育时间或降低 DAB浓度 / 过氧化氢浓度等；
（6）适当增加 PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；
（7）防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。
13、苏木素复染时间的把握？
（ 1）苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒- 数分钟。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。
（2）盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定
动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。
（3）如果分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。
14、 PBS的清洗方式选择、次数和时间的选择？
（ 1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。
临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，
这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。
（ 2）温柔冲洗，防止切片的脱落。
冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。
（ 3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。
冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很
容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物
质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS，持续 2 分钟左右就完全足够了。
（ 4） PBS的 PH和离子强度的使用和要求。
中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复
合物的形成，而高离子强度则有利于分解。
（ 5）常用试剂的配制和使用。
在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加、换、切片的
冲洗， DAB 的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将
影响染色的结果。
15、脱片产生的原因和如何防止脱片？
（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补
做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。
（2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。
（3）组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。
（4）没烤好，时间短温度不够之类。
（5）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。
（ 6）修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100 度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进
去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从
另外的问题上着手。
（ 7）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS 的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方
面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。
16、背景染色较深的原因有哪些？
（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进
行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简
单的按说明书进行染色。
（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时
提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer ）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传
统的 1 小时，而是30 分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
（ 3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间
太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB 存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB 的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色
程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的
抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
（ 4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成
组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或 PAP Pen 在组织周围画圈，可以有效的避免
液体流失，也能提高操作速度。
（ 5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24 小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢
前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4？ C 冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。
（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买
的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
17、苏木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度多少、时间多长？
答：返蓝可以用碱性溶液（PBS/NA2HPO4/淡氨水）或45 度温水、冷水蓝化均可。一般蓝化5~10 min 。淡氨水有人用 50ml 自来水 +三四滴的氢氧化铵。
免疫组化方法
免疫组化技术及其注意事项 一、免疫组化染色前处理技术操作规范 1、取材：理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm，大多数实验室都认为组织在加热抗原修复过程中造成脱片的主要原因是取材过厚或脱水浸蜡处理不当所致。良好的取材、固定、脱水过程是免疫组化质控的前提，如果H&E切片都做不出满意的染色结果，那么免疫组化染色也将无从谈起,根本无法保证染色质量。 2、固定：在众多的组织固定液中（如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛等），不同的实验方法在使用上各有千秋。但在保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性以及试剂的价格上，福尔马林是最好、既经济又通用。而含酸或含汞的固定液对抗原保存均不理想。组织离体后固定一般不要超过30分钟，在常温条件下固定时间为8-24小时。同时还要注意避免福尔马林过度固定造成的组织抗原丢失，有研究发现新鲜组织经过福尔马林一周固定后组织抗原丢失严重，抗原几乎不能被检测，因为组织固定后会引起蛋白或蛋白分子之间形成交联，导致抗原位点遮盖，可以通过抗原修复方法来修正，若加抗体前不采用抗原修复，则免疫组化染色常不能到达理想结果或不成功。组织同样不能长时间放置在70%的乙醇中，酒精固定后的组织形态不如福尔马林固定的组织.脱钙液对抗原破坏较为严重，因此在组织脱钙前最好在福尔马林液中固定48小时，若组织没有固定透则酸会破坏抗原，脱钙液中酸的浓度与脱钙时间都必须尽量控制在最低的限度。 3、浸蜡：我们认为浸蜡温度应控制在58~60℃左右，浸蜡用的石蜡应经常更换，以减少石蜡中二甲苯的含量。高温下的二甲苯容易使组织发脆，细胞收缩，更容易掉片。 4、切片厚度：用于免疫组织化学染色的切片厚度为3-4微米。为防止在染色过程中脱片，需要使用硅化玻片裱片。 5、硅化玻片的制备：载玻片经酸洗冲洗干净后烤干；2%APES丙酮或无水酒精中浸泡1~2min；丙酮或无水酒精洗1~2分钟；蒸馏水浸洗1~2min；烤干备用。 6、烤片：切片在60℃~65℃烤箱中烤片30-60分钟左右。有些实验室采用烤片过夜。有报导烤片温度超过60℃时，烤片时间超过18小时的切片，免疫组化染色强度比烤4小时的切片要略弱。温度过高或时间过长均会影响抗原的活性，原因是在高温干燥条件下可以加速组织切片中抗原的氧化。 7、切片保存：一些实验室研究人员习惯将组织蜡块连续切片后长期保存在室温
免疫组化技术全程原理
免疫组化技术全程原理 一、概念和常用方法介绍 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法
免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
免疫组化技术 原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 分类（常用） 1、免疫荧光方法 最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。 2、免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）、SP 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）、即用型二步法（聚合物链接）等。 3、免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法 标本 1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
免疫组化操作流程 试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤 1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。 2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。 3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。 4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。 5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。PBS洗三次，每次5分钟。 6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。 7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。 8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。 9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。 10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min 11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。 12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。 稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。 淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化) 另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。我没用淡氨水溶液。若为悬浮细胞则需涂片，20μl即可。
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理及步骤 免疫组化操作规程 一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。 二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。 三、试剂配制 1. 0.01 M PBS（pH 7.34 ）：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml ； 1000 ml 0.2M PB （pH 7.4）＝5.93 g NaH 2 PO 4 2·H 2 O ＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B （A. 0.2 M NaH 2 PO 4 2·H 2 O ：15.6 g in 500 ml ddH 2 O ； B. 0.2 M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O ：71.632 g in 1000 ml dH 2 O ）。 2. Citrate Buffered Saline （0.01 M 柠檬酸缓冲液， PH6.0 ）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O （A.Citrate acid
（柠檬酸）：10.5 g
加双蒸水至 1000 ml ； B.Citrate sodium （柠檬酸钠）： 29.41 g 加 双蒸水至 1000 ml ）。 3. 细胞通透液：由终浓度分别为 0.3% 双氧水和 0.5%Triton X-100 混合而成。配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS ，再接着 加 120 ul TritonX-100, 并加热一儿，冷却至临用前加 0.4 ml 30 ％ H 2 O 2 。 4. 5％羊血清或封闭血清，用 PBS 稀释。 5. 含 0.03 ％ H 2 O 2 的 0.05 ％DAB （避光） ：用 20×DAB （1％， 10 mg/ml ）5 ul ＋0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS 。 6. 一抗、二抗均用 PBS 稀释。 7. Xylene 、梯度 Ethanol （100 ％×2、95％、80％、70％、50％）、 双蒸水、中性树胶（封裱剂）。 8. 苏木精染液： 四、操作步骤 1 、脱蜡、水化 60 ℃× 20 min →Xylene 2 × 10 minut ；es 80% ethanol 2 minutes ； 70% ethanol 2 minutes ； distilled water:5 min ； PBS 洗 3 次×3 min 。 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 100% absolute ethanol ：2 ×5 minutes ； 95% ethanol 2 minutes ；
免疫组化操作方法原理步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较
免疫组化方法(冰冻切片)
免疫组化方法（冰冻切片） A. 所需溶液和试剂 1.二甲苯 2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级） 3.苏木精（可选） 4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。 a.10%中性福尔马林 b.丙酮 c.甲醇 d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。 5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。 6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。 7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。 8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。 9.配制时，将500 μl山羊血清和30 μl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。 10.检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。 11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。 B. 切片 1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切 片时样品断裂。 2.将样品切成大约6-8 μm厚，铺在带正电性的玻片上。 3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片） C. 固定 注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂 1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。 a.10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。 b.冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。 c.甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。 d.3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。
免疫组化常用方法介绍及个人经验总结
免疫组化常用方法介绍及个人经验总结 1 、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2 、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3 、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP 法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4 、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60 年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。 本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。 免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有ABC 法、SP 三步法、即用型二步法检测系统等。
免疫组化与免疫荧光的区别
免疫组化与免疫荧光 一、两者都是蛋白定位的检测（也就是确定蛋白是表达在细胞核/浆/膜）。 二、区别是： 1、概念和基本原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的现像和放大作用，在细胞，亚细胞水平检测各种抗原物质，并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免疫组织化学技术现已有：免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织（细胞）化学技术、亲和组织化学技术、免疫金银及铁标记免疫组织化学技术等。 免疫荧光组织（细胞）化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量。以达到对抗原物质定位、定性、定量测定的目的。 2、标本制作： 免疫荧光一般用冰冻切片，减少杂质干扰；而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。 3、实验步骤：免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程。 4、染色后的标本保存：免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照，时间长了荧光衰退；而酶免疫组化染色标本可以长期保存。 5、免疫组化结果除了知道蛋白是在细胞浆还是细胞膜表达高些，还可以用软件做相对定量分析。 6、免疫荧光得到的图片是彩色的，漂亮些，可以发高档次文章。 免疫学三大工具：免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。
免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事 项 免疫组化 ，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。 二，免疫组化技术的基本原理 免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。 免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等, 用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。 ，免疫组化步骤 1, 切片，烤片60C, 1h;
2, 脱蜡及复水 二甲苯10min，100%乙醇5min，95%乙醇5min，90%乙醇5min，85%乙醇5min，80%乙醇5min，75 %乙醇5min，60%乙醇5min，50%乙醇5min，30%乙醇5min，自来水1min，双氧水1min ； 3，1份30%H2O加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min; 4, 微波修复 将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98E -100C）加热至沸腾，冷却（约5-10min）,反复两次； 5, 将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min； 6, 封闭，5%BSA室温20min,甩去多余液体； 7, 滴加一抗，37C, 1h,或者4C过夜； 8, PBS洗涤3次，每次3min； 9, 滴加二抗，37°C, 15-30min ； 10, PBS洗涤3次，每次3min； 11, 滴加SABC 37C, 30min ； 12, PBS洗涤3次，每次5min； 13, 1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀； 14, DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）; 15, 自来水冲洗干净，过蒸馏水； 16, 苏木素复染2min,自来水冲洗； 17, 脱水 30%乙醇3min, 50%乙醇3min, 70%乙醇3min, 80%乙醇3min, 90%乙醇3min, 95%乙醇3min, 100%乙醇3min,二甲苯20min ； 18, 树胶封片，镜检。
免疫组化HE染色步骤
免疫组化H E染色步骤 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020
骨组织石蜡切片制作 步骤： 1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲 液内固定12—24h。 2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h. 3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。 4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。 5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。 6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。 7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。 免疫组化检测 步骤： 1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1 （10min）二甲苯2（10min）。 2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min） 80%酒精（2min）70%酒精(2min)。 冲洗3次，每次5min.。
4.抗原修复：将组织片置的柠檬酸缓冲液（）中煮沸15min,自然冷 却至室温。 冲洗3次，每次5min。 6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活 性。 冲洗3次，每次5min。 8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜） 冲洗3次，每次5min。 10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 显色5min。 13.自来水冲洗10min。 14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。 15.自来水冲洗10min。 16.常规脱水，透明，封片，镜检。 组织切片HE染色 步骤 1、将烘烤后的组织切片依次侵入二甲苯1，二甲苯II进行脱蜡各 10min。 2、脱蜡后的组织切片依次浸入无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中各2min，PBS冲洗2次，每次5min。
免疫组化步骤
免疫组化实验步骤 细胞和组织的固定 （一）固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大 （二）固定剂 用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂 2）Bouin’s液 该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 2．丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记
免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
免疫组化技术 免疫组化技术
业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
---------------------------------------------------------------------------------华中科技大学同济医学院
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免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化 一，免疫组织化学简介 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 二，免疫组化技术的基本原理 免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。 免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。 三，免疫组化步骤 1，切片，烤片60℃，1h； 2，脱蜡及复水 二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min； 3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min； 4，微波修复 将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次； 5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理:应用基本原理——抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使的（、酶、、）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和），对其进行定位、定性及定量的研究，称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液配成1000毫升溶液 应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液 应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝蒸馏水750毫升，碘酸钠，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟； ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯） ⑶95%乙醇3分钟； ⑷85%乙醇3分钟； 3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入，抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。
免疫组化步骤
免疫组化：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法 1)将石蜡切片置于烤片机烘烤２－３h,{因为做石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，所以应烤片2-3h,除非组织的抗原性较稳定，则时间可长一点}后可把烤好的组织切片，放在60℃烤箱中过夜，最佳时间控制在14-18h{乳腺病理处省略此步骤}。取组织切片于切片架，用吹风机吹至产生蜡液，不可靠太近，以免使组织切片局部温度过高，破坏组织切片。 2）常规脱蜡 ({二甲苯脱蜡，在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长}二甲苯I 20min →二甲苯II 20min→二甲苯Ⅲ20min →无水乙醇10min（清洗二甲苯）→无水乙醇10min→95%乙醇5min→80%乙醇5min) {梯度酒精用无水酒精与蒸馏水配置} 目的：把水渗入组织切片中，给细胞创造一个水溶性环境 <以下步骤是为细胞染色做准备> 3）捞出，放入铁缸内，用凉清水冲洗3次{如果组织容易脱片，就尽量泡一下，这样脱片可以减少很多}； 4）将配好的柠檬酸盐抗原修复液（抗原修复液的量为稍高于横向放倒的切片架的高度）{EDTA配制方法：EDTA修复液使用比例：EDTA:蒸馏水=1:49,每次最好配制1000ml。EDTA修复液重复使用最好不要超过5次，并且3次之后要测PH值，测PH是否为9.0，如偏离太大则弃用。枸橼酸修复液只能用一次。修复的原因：因为常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得抗原性物质形成醛键，羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇。另外，蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。在染色时，要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态}{用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也可，因其抗原修复效果比柠檬酸盐的好，可从另外的问题上着手}灌入高压锅中，不旋紧，盖上即可，210℃烧至沸腾后，把切片架放入横向放倒，旋紧锅盖，待喷气时，开始计时2min-2min30s,如果组织不易染色，可延长修复时间，但一般不超过3min，否则容易掉片。 5）到时间后，把高压锅放入水池中用凉水冲至气体放出完，旋下锅盖，自然冷却至室温，大于30min。 6）冷却后取出切片架用凉清水冲洗3次，放入3% H2O2 罐中10min，目的：封闭过氧化物酶。【每天用前新放入10ml H2O2 】【配制方法：1000ml 3%的过氧化氢=100ml 30%过氧化氢+900ml蒸馏水，（H2O2保存需避光）】 7）捞出后用凉清水冲洗多次，应注意H2O2 有腐蚀性，最后一次用PBS（磷酸盐缓冲液），PBS