专题1 1.2.2 目的基因的导入、检测与鉴定

1．2.2目的基因的导入、检测与鉴定

[学习目标] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。

方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。在完成将目的基因导入受体细胞这一步骤后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。

一、将目的基因导入受体细胞

1．转化的含义

目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2．转化的方法

(1)导入植物细胞

①农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用方法。

a．土壤农杆菌的特点：植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌侵染，其Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体的DNA上。

b．方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因

插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。

②基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。

目的基因包裹在微小的金粉粒子或钨粉粒子表面→用基因枪高速射入受体细胞或组织中→目的基因表达。

③花粉管通道法

在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加目的基因，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

(2)导入动物细胞

①方法：显微注射技术。

②常用受体细胞：受精卵。

③步骤：目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的转基因动物

(3)导入微生物细胞

①原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。

②常用的方法：

a．用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。

b．感受态细胞和重组表达DNA分子在缓冲液中混合，细胞吸收重组表达载体DNA分子。归纳总结

1．上述方法中，在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。

2．对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。

3．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。

4．大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。

例1农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：

(1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是____________，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现____________________________________________________________________ ________________________________________________________________________的目的。具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T-DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞____________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到____________(部位)即可。

(2)根据T-DNA这一转移特点，推测该DNA片段上可能含有控制______________________酶合成的基因。

(3)图中c过程中，能促进农杆菌向植物细胞转移的物质是__________类化合物。

(4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还可采取____________________________(至少写出两种)。

答案(1)单子叶植物将目的基因导入植物细胞染色体的DNA T-DNA片段(内部) (2)DNA连接酶、限制(3)酚(4)基因枪法、花粉管通道法

解析(1)一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物。利用其感染性，可实现目的基因导入植物细胞的目的。真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上的是农杆菌T-DNA片段，因此目的基因必须插入到该部位才能成功。(2)根据T-DNA这一转移特点，可以推测该DNA片段能控制合成DNA连接酶、限制酶以实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合。(3)植物细胞受伤后可产生酚类物质，促进农杆菌向植物细胞转移。(4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。

易错易混农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析

第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

例2下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是()

A．基因枪法导入植物体细胞的方法比较经济和有效

B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法

C．大肠杆菌最常用的转化方法，是使细胞的生理状态发生改变

D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法

答案A

解析不同受体细胞导入目的基因的方法不同，每种方法都有利弊。目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济和有效；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射技术；目的基因导入大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，完成转化。

二、目的基因的检测与鉴定

1．分子水平的检测

(1)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中：DNA分子杂交技术。

用放射性同位素标记的含有目的基因的单链DNA片段制成基因探针。将转基因生物的基因组DNA提取出来，和基因探针进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已插入受体细胞的DNA中。

(2)检测目的基因是否转录：分子杂交技术。

将转基因生物提取出来的mRNA和基因探针进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经转录。

(3)检测目的基因是否翻译：抗原－抗体杂交技术。

从转基因生物提取出来的蛋白质和相应的抗体进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译。

2．个体水平的鉴定

(1)抗虫或抗病的接种实验。

(2)有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较。

归纳总结

1．目的基因的检测与鉴定归纳

2．不同分子检测原理的异同

(1)在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都

是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。检测原理都是碱基互补配对原则，只是被检测的物质不同，一个是转基因生物的基因组DNA，一个是转基因生物细胞内的mRNA。

(2)进行翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。

例3目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是()

①检测受体细胞的染色体上是否有目的基因②检测受体细胞是否有致病基因③检测目的基因是否转录出了mRNA④检测目的基因是否翻译出了蛋白质

A．①②③

B．②③④

C．①③④

D．①②④

答案C

例4利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是()

A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因

B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA

C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列

D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白

答案D

解析基因表达的产物是蛋白质，因此，只有在受体细胞中检测或提取到了相应蛋白质才能证明目的基因在受体细胞中完成了表达，A、C项只能说明完成了目的基因的导入，B项只能说明完成了目的基因的导入和目的基因的转录过程。

名师点拨关注基因工程操作过程的四个易误点

(1)限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：获取一个目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒一般只需要限制酶剪切1次，产生2个黏性末端或平末端，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。

(2)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶：如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下，目的基因与载体也可以连接起来。

(3)目的基因的插入点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。

(4)基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象。

1．将目的基因导入玉米茎尖分生区细胞和小鼠受精卵，应分别采用的方法是()

A．显微注射技术农杆菌转化法

B．基因枪法花粉管通道法

C．农杆菌转化法显微注射技术

D．基因枪法显微注射技术

答案D

解析玉米是单子叶植物，对单子叶植物来说，常用的方法是基因枪法；对于动物细胞来说，常用的方法是显微注射技术。

2．(2017·福建厦门一中期中)下列关于目的基因导入微生物细胞的叙述中，不正确的是() A．常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少等

B．受体细胞所处的一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态

C．感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度

D．常用生理盐水处理细胞，使其处于感受态

答案D

解析因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少，故常用原核生物作为受体细胞；Ca2＋处理后细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态，感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度；常用Ca2＋处理细胞，使其处于感受态。3．(2017·广东潮南实验学校高二月考)在基因诊断技术中，所用的探针DNA分子中必须存在一定量的荧光分子或放射性同位素，后者的作用是()

A．为形成杂交DNA分子提供能量

B．引起探针DNA产生不定向的基因突变

C．作为探针DNA的示踪元素

D．增加探针DNA的相对分子质量

答案C

解析DNA探针是指用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子，放射性同位素的作用是作为探针DNA的示踪元素，C项正确。

4．检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因的常用方法是()

A．DNA分子杂交技术B．荧光分子标记技术

C．放射性同位素标记技术D．显微注射技术

答案A

解析检测目的基因常采用DNA分子杂交技术，即在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素进行标记，以此作为基因探针，并使基因探针与基因组DNA杂交，若显示出杂交带，则表明目的基因已插入染色体DNA中。

5．(2016·海南，31)基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：

(1)在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即___________和从____________中分离。

(2)利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA 文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是________________________

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(3)在基因表达载体中，启动子是______________识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是____________。

(4)将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有________和________颗粒。

答案(1)人工合成生物材料

(2)cDNA文库中只含有叶细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因

(3)RNA聚合酶大肠杆菌(或细菌)

(4)金粉钨粉

解析(1)获取目的基因主要有两大途径，即人工合成和从自然界已有的物种中分离。(2)在植物的成熟叶片中基因选择性表达，因此由所有RNA反转录形成的cDNA文库中只含有叶细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因。

(3)在基因表达载体中，启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，由于易于培养，最常选用大肠杆菌(或细菌)。

(4)将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有金粉和钨粉颗粒。

[对点训练]

题组一将目的基因导入受体细胞

1．(2017·河南南阳新野一中高二下学期期中)1982年，世界上第一例体型比普通小鼠大1.8倍的转基因“超级小鼠”培育成功。下列相关叙述正确的是()

A．将含有目的基因的DNA直接注入到小鼠体内

B．该“超级小鼠”的培育利用到了显微注射技术

C．采用的受体细胞是雌性动物的卵细胞

D．目的基因导入受体细胞前不用提纯

答案B

解析转基因“超级小鼠”的培育过程为：首先将含有目的基因的表达载体提纯，然后利用显微注射技术将含目的基因的表达载体导入受精卵，经胚胎早期培养一段时间后，再移植到雌性动物的输卵管或子宫内，使其发育成为具有新性状的动物。

2．基因工程中因受体细胞不同，目的基因导入的方法也不同，下列叙述不正确的是() A．将目的基因导入棉花细胞内常用花粉管通道法

B．将目的基因导入老鼠细胞内常用显微注射技术

C．将目的基因导入大肠杆菌内常用感受态细胞转化法

D．将目的基因导入小麦细胞内常用农杆菌转化法

答案D

解析小麦是单子叶植物，其受伤后不能分泌酚类物质，农杆菌对它没有感染能力。3．在基因工程技术中，可能需要用到CaCl2处理的环节是()

A．目的基因的提取和导入

B．目的基因与载体结合

C．将目的基因导入受体细胞

D．目的基因的检测与鉴定

答案C

解析将目的基因导入原核生物受体细胞时，首先用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后在一定条件下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化。

题组二目的基因的检测与鉴定

4．常用DNA进行亲子鉴定。其原理是从被测试者的血液或口腔上皮细胞中提取DNA，用限制性核酸内切酶将DNA样本切成特定的小片段，放进凝胶内，用电泳推动DNA小片段

分离，再使用特别的DNA探针去寻找特定的目的基因。DNA探针与相应的基因凝聚在一起，然后，利用特别的染料在X光下，便会显示由DNA探针凝聚在一起的黑色条码。被测试者这种肉眼可见的条码很特别，一半与母亲的吻合，一半与父亲的吻合。反复几次该过程，每一种探针用于寻找DNA的不同部位形成独特的条码，用几组不同的探针，可得到超过99.9%的父系分辨率。请问，DNA探针是指()

A．某一个完整的目的基因

B．目的基因片段的特定DNA

C．与目的基因相同的特定双链DNA

D．与目的基因互补的特定单链DNA

答案D

解析根据题干信息“用限制性核酸内切酶将DNA样本切成特定的小片段，放进凝胶内，用电泳推动DNA小片段分离，再使用特别的DNA探针去寻找特定的目的基因”可知，DNA 探针不是一个完整的目的基因，A项错误；DNA探针不是目的基因片段的特定DNA，B项错误；“每一种探针用于寻找DNA的不同部位形成独特的条码”，指的是根据碱基互补配对原则形成的杂交带，所以DNA探针是与目的基因互补的特定单链DNA，C项错误，D项正确。

5．在检测抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子水平的是()

A．观察害虫吃棉叶是否死亡

B．检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带

C．检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带

D．检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带

答案A

解析A项属于个体生物学水平的鉴定；B、C两项为分子水平的检测，分别利用DNA分子杂交技术、分子杂交技术，观察目的基因及目的基因转录形成的mRNA能否与DNA探针进行杂交形成杂交带；D项也为分子水平检测内容，利用抗原—抗体杂交的原理，检测基因表达产物能否与特定抗体形成杂交带。

题组三基因工程基本程序整体分析

6．下图表示一项重要生物技术的关键步骤，X是获得外源基因并能够表达的细胞。下列有关说法不正确的是()

A．X是能合成胰岛素的细菌细胞

B．质粒是细胞核或拟核外能自主复制的小型环状DNA

C．目的基因与质粒的重组只需要DNA连接酶

D．该细菌的性状被定向改造

答案C

解析分析题意和图示可知：重组质粒导入的是细菌细胞，所以X是能合成胰岛素的细菌细胞，A正确；质粒是一种常用载体，是在细胞核或拟核外能自主复制的小型环状DNA，B正确；基因与载体的重组需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶，C错误；基因工程的特点是能够定向改造生物的性状，D正确。

7．下列有关基因工程的叙述，正确的是()

A．基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA聚合酶

B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列

C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快

D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功地实现表达

答案C

解析基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶，A错误；限制酶能够识别某种特定的核苷酸序列，并在特定位点切割磷酸二酯键，B错误；细菌作为受体细胞原因有多个，如细胞体积小、繁殖周期短、遗传物质少等，C正确；目的基因进入受体细胞中，由于操作失误和不可预测的干扰等，并不是所有受体细胞都能按照预先设计的方案进行重组和表达，真正能有效表达的只是一小部分，D错误。

8．基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，无需进行碱基互补配对的步骤是()

A．人工合成目的基因

B．基因表达载体的构建

C．将目的基因导入受体细胞

D．目的基因的检测与鉴定

答案C

解析将目的基因导入受体细胞过程中没有进行碱基互补配对。

[综合强化]

9．番茄叶片受害虫的损伤后，叶肉细胞迅速合成蛋白酶抑制剂，抑制害虫的消化作用。人们尝试将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米，以对付猖獗的玉米螟。下图为培育转基因抗虫玉米的流程图，下列描述正确的是()

A．用限制性核酸内切酶切割番茄的DNA得到的产物就是蛋白酶抑制剂基因

B．用氯化钙处理玉米受体细胞，有利于含目的基因的重组质粒导入

C．重组Ti质粒应有RNA聚合酶识别和结合的部位，以启动蛋白酶抑制剂基因的转录D．若将目的基因导入玉米花粉细胞，通过花药离体培养可获得稳定遗传的转基因玉米

答案C

解析目的基因是用限制性核酸内切酶将DNA酶切后得到的，需筛选；氯化钙用于处理细菌细胞；基因成功表达的前提是能转录和翻译，转录时需RNA聚合酶识别转录的起点才能启动；花药离体培养得到的是玉米的单倍体，需再用秋水仙素处理单倍体，使染色体加倍才能得到稳定遗传的转基因玉米。

10．下图表示细胞膜上乙酰胆碱(一种神经递质)受体基因的克隆技术操作过程，下列相关分析正确的是()

A．获得该mRNA的最佳材料是受精卵

B．构建基因表达载体最可能使用的载体是大肠杆菌

C．完成过程①②必不可少的酶分别是反转录酶、DNA聚合酶

D．探针筛选的目的是淘汰被感染的细菌，获得未被感染的细菌

答案C

解析该受体基因在神经细胞中表达，获得该mRNA的最佳材料是神经细胞；构建基因表达载体最可能使用的载体是质粒；探针筛选的目的是检测是否存在cDNA。

11．蓝藻拟核DNA上有控制叶绿素合成的chlL基因。某科学家通过构建该种生物缺失chlL 基因的变异株细胞，以研究chlL基因对叶绿素合成的控制，技术路线如下图所示，下列相关叙述错误的是()

A．①②过程应使用不同的限制性核酸内切酶

B．①②过程都要使用DNA连接酶

C．终止密码子是基因表达载体的重要组成部分

D．若操作成功，可用含红霉素的培养基筛选出该变异株

答案C

解析限制性核酸内切酶有特异性，①②过程要切割的DNA序列不同，故应使用不同的限制性核酸内切酶；DNA连接酶的作用是连接被切开的磷酸二酯键，使chlL基因、红霉素抗性基因与质粒结合；基因表达载体由目的基因、启动子、终止子、标记基因组成，终止密码子是mRNA上密码子的一种，表示一次翻译的结束；变异株中chlL基因被重组基因替换，重组基因中有红霉素抗性基因，故可用含红霉素的培养基筛选出该变异株。12．(2015·全国Ⅰ，40节选)HIV属于反转录病毒，是艾滋病的病原体。回答下列问题：(1)用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时，可先提取HIV中的________，以其作为模板，在______________的作用下合成________，获取该目的蛋白的基因，构建重组表达载体，随后导入受体细胞。

(2)从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是________，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是______________________________________________________________________。答案(1)RNA反转录酶cDNA(或DNA)(2)抗体抗原抗体特异性结合

解析(1)HIV是RNA病毒，其核酸是单链RNA，而在基因工程中构建目的基因表达载体时，载体一般用的是质粒，为双链DNA，故先用反转录酶催化HIV的RNA反转录为DNA 分子再进行基因工程操作。(2)本题涉及到了免疫学方面知识，抗原进入机体后可以产生特异性免疫反应，产生相应的抗体，抗体与抗原特异性结合。

13．如图是获得转基因抗虫棉的技术流程示意图。

请回答：

(1)A→B利用的技术称为________，其中②过程需要热稳定的_______________酶才能完成。

(2)图中将目的基因导入棉花细胞需要经过③过程，该过程为构建______________，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在且可以遗传给下一代，并能表达。

(3)上述流程示意图中，将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是________________法，该方法一般__________(填“适宜”或“不适宜”)用于将目的基因导入单子叶植物。

(4)欲确定抗虫基因在G体内是否表达，在个体水平上需要做__________实验。如果抗虫基因导入成功，且与某条染色体的DNA整合起来，该转基因抗虫棉可视为杂合子，将该转基因抗虫棉自交一代，预计后代中抗虫植株占________。

答案(1)PCR DNA聚合(Taq)(2)基因表达载体(重组DNA)(3)农杆菌转化不适宜(4)抗虫接种3/4

解析PCR技术需要用到热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)。图中③过程为构建基因表达载体，将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是农杆菌转化法，农杆菌对大多数单子叶植物没有感

染能力。欲确定抗虫基因在体内是否表达，在个体水平上应做抗虫接种实验。由于抗虫基因只整合到一条染色体DNA上，则该抗虫棉产生的配子只有一半含有抗虫基因，雌雄配子随机结合，后代抗虫植株占3/4。

14．马铃薯块茎含有大量的淀粉，富含多种维生素和无机盐，我国已将马铃薯作为主粮产品进行产业化开发。下图是转基因抗盐马铃薯的培育过程，请分析回答下列问题：

(1)为获取抗盐基因，可以从碱蓬细胞研磨液中提取抗盐基因的________来合成cDNA。

(2)上图构建基因表达载体时，最好选用__________________酶切割含目的基因的外源DNA 和质粒，不能使用SmaⅠ切割的原因是____________________________________。构建好的重组质粒在抗盐基因前要加上特殊的启动子，启动子是一段有特殊结构的__________片段。

(3)将基因表达载体导入农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA上的原因是_______________。通过农杆菌的转化作用，使抗盐基因插入到马铃薯细胞中的染色体DNA上，从而使抗盐基因的遗传特性得以____________________。

(4)从个体水平上检验转基因抗盐马铃薯是否培育成功的方法是_____________________

________________________________________________________________________。

答案(1)mRNA

(2)Eco RⅠ和Hin dⅢSmaⅠ会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因DNA

(3)T-DNA是可以转移的DNA(T-DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA 上)稳定维持和表达

(4)将转基因马铃薯幼苗栽种在盐碱地或较高浓度盐溶液中，观察是否能正常生长

解析(1)基因工程中，获取目的基因时可以利用mRNA为模板，反转录形成cDNA。(2)图中质粒的标记基因为抗生素抗性基因，而SmaⅠ的切割位点就在该基因和目的基因上，因此用质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，则应该用Eco RⅠ和Hin d Ⅲ酶切割含目的基因的外源DNA和质粒。基因表达载体中启动子是一段有特殊结构的DNA 片段。

(3)农杆菌中Ti质粒上的T-DNA是可以转移的DNA，可以将目的基因带入马铃薯细胞，并将目的基因插入到马铃薯细胞中的染色体DNA上，从而使抗盐基因的遗传特性得以稳定维持和表达。

(4)检验转基因抗盐马铃薯是否培育成功，从个体水平上来讲，可以将转基因马铃薯幼苗栽种在盐碱地或较高浓度盐溶液中，观察是否能正常生长。

高中生物选修三基因工程知识点

高中生物选修三基因工程知识点基因工程：是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。（一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶（1）两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。（2）与DNA聚合酶作用的异同：

（2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA双链复制（4）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链；第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。（5）特点：指数(2^n)形式扩增第二步：基因表达载体的构建(核心) 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。第三步：将目的基因导入受体细胞 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法：

基因工程知识点梳理

生物选修3知识点专题1 基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过，赋予生物以，创造出。基因工程是在上进行设计和施工的，又叫做。（一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别的核苷酸序列，并且使每一条链中的两个核苷酸之间的断开，因此具有。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：来源于大肠杆菌，来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而能缝合两种末端，但连接的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。必须需要模板 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②，供外源DNA片段插入。 ③，供重组DNA的鉴定和选择。（2）最常用的载体是 ,它是一种。

（3）其它载体： (二)基因工程的基本操作程序第一步： 1.目的基因是指：基因。 2.原核基因采取获得，真核基因是。人工合成目的基因的常用方_ 和_。 3. 从基因文库中获取基因文库（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（2）类型：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库）（1）原理：（2）过程：第一步：加热至90～95℃；第二步：冷却到55～60℃，；第三步：加热至70～75℃，。第二步：（核心步骤）

荧光定量PCR、基因克隆和基因测序

临床分子生物学 1. 试述荧光定量PCR技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用。（1）原理：实时荧光定量PCR是一种将PCR扩增和扩增结果的检测有机地结合在一起的一种分子生物学技术，系在PCR反应体系中加入能够反映PCR反应进程的荧光报告基团，随着PCR 反应的进行，荧光信号强度也按特定的规律随PCR产物不断累积而增加。同时，每经过一个热循环，定量PCR仪收集一次荧光信号，通过实时监测反应体系荧光强度的变化来实时监测PCR扩增过程，最终得到荧光强度随PCR循环数的变化曲线。理论上，PCR的扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,其荧光量与扩增产物量亦成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。最后根据该曲线的特征及标准曲线实现起始模板数的精确定量。荧光定量PCR的扩增曲线可以分为三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。在荧光信号背景阶段，由于PCR扩增产生的荧光信号远远小于荧光背景信号，为背景荧光所掩盖，我们难以判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已经不再呈指数增加，PCR的终产物量与起始模板之间没有线性关系，所以用终产物量不能计算出起始模板的量。为了定量和比较的方便，在定量PCR中引入了三个非常重要的概念：荧光基线、荧光阈值和CT值。基线是指PCR循环开始时，虽然荧光信号累积，但仍在仪器可以检测的灵敏度下。基线范围的定义是从三个循环开始起到CT值前的第三个循环止。荧光阈值的确定是3－18个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。CT值的定义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。可见CT值取决于阈值，而阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，因此CT值是一个完全客观的参数。（2）方法： 1、引物设计遵守的原则 2、探针设计遵守的原则 3、RNA提取 4、逆转录逆转录成cDNA 5、常规PCR扩增（1）反应体系（2）混匀，瞬时离心。（3）设定扩增条件，进行扩增反应，循环35次。（5）产物用于琼脂糖电泳或-20℃长期保存。 6、实时荧光定量PCR扩增目的基因用假定初始拷贝数（X）的cDNA模板按10倍梯度进行稀释，制成标准模板系列，自每个稀释模板中取样5μl，分别加入30μl的反应体系中，行实时荧光定量PCR。反应体系在荧光定量PCR仪上进行，这种仪器较普通的PCR仪增加了一套复杂而紧密的荧光强度检测系统及数据分析系统，可对PCR反应过程中的每一循环的系统荧光强度进行实时（real-time）检测，通过对荧光强度的分析来达到等量检测的目的。将PCR仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期。45循环的扩增反应结束后，系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数（DRn）进行分析绘制每一反应管的扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值（threshold）时的扩增循环数（Ct值），根据Ct值与标准模板初始拷贝的对数值作图，得到该样品的标准曲线。在此反应系统中，荧光强度的增加与模板量的增加成正比，荧光强度的变化可反应模板产物量的变化。 7、基因相对拷贝数的检测与计算 8、统计学分析

2019_2020高中生物专题1基因工程2第2课时目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定检测含解析人教版选修3

第2课时将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定一、选择题题型一目的基因导入受体细胞 1．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是( ) 答案 B 解析花粉管通道法是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，A正确；将目的基因导入微生物细胞，常采用感受态细胞法(Ca2＋处理法)，这种方法能使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法，C正确；双子叶植物和裸子植物常用农杆菌转化法导入目的基因，单子叶植物(如小麦)可用基因枪法导入目的基因，D 正确。 2．农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是( ) A．Ti质粒上 B．受体细胞染色体的DNA上 C．T-DNA D．农杆菌的拟核答案 B 解析在农杆菌转化法中利用农杆菌的T-DNA将目的基因整合到受体细胞染色体的DNA 上。 3．目前将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是( ) A．显微注射法B．农杆菌转化法 C．基因枪法D．花粉管通道法答案 A 解析显微注射法是迄今为止将目的基因导入动物细胞中采用最多、最有效的一种方法。 4．在基因工程技术中，需要用氯化钙处理的环节是( ) A．目的基因的提取和导入 B．目的基因与载体结合 C．将目的基因导入受体细胞 D．目的基因的表达答案 C 解析如果载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，使其成为感受态细胞，使含有目的基因的重组DNA分子更容易进入受体细胞，目的基因导入受体细胞后，

基因工程主要知识点整理

第一章基因克隆基因工程的基本技术有哪些？答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。构建基因文库一般使用什么作为载体？答：一般使用大肠杆菌作为载体克隆与亚克隆？答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。 PCR对基因克隆有什么作用？答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。第二章分子克隆工具酶限制与修饰系统？答：限制系统可以排除外来DNA。限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。并且能够保证自身的DNA不被降解。使用最广泛的限制酶？答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶限制性内切酶的命名？答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。如：HindIII 限制与修饰系统分类？答：至少可分为3类。II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。其限制反应与甲基化反应是分开的反应。不需要ATP的参与。限制酶识别的序列长度？结构？

答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列限制酶产生的末端？答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端什么是同裂酶？分类？答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。但他们的切割位点有可能不同。分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？答：什么是同尾酶？答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。酶切的缓冲液中一般含有什么？作用是？答：调控pH的缓冲剂：稳定溶液的pH M g2+：稳定酶的作用，提高酶的活性，提高酶的特异性 DDT（二硫苏糖醇）：防止DNA二聚化，影响酶切结果 BSA（小牛血清蛋白）：防止了酶的贴壁效应（可使酶变形），同时减少非特异性吸附，对酶有稳定和促进的作用。酶切的反应温度？反应时间？中止酶切的方法? 答：反应温度大多为37℃，时间一般为2-3h。中止的方法是在65℃下反应20min。什么星星活性？抑制其发生的办法？答：在极端非标准条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特性称为星星活性。抑制星星活性的措施有很多，如减少酶的用量（可避免过分酶切）、减少甘油浓度、保证反应体系中唔有机溶剂或乙醇、提高离子强度到100-150mmol/L（如果不会抑制酶活性的话）和降低反应pH至pH7.0以及保证使用M g2+作为2价阳离子。影响酶活性的因素有？答：可分为内因和外因外因是可预见的，可控的：反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应提及的选择以及反应时间的长短等。内因有：星星活性、底物甲基化和底物构象（线性还是超螺旋）原核细胞有几种DNA聚合酶？其特点是什么？答：DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或者双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。

基因工程知识点总结归纳(更新版)

基因工程绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。

基因工程基础知识梳理(二)

基因工程基础知识梳理（二）三、基因工程的应用．植物基因工程的成果提高农作物的＿＿＿＿＿能力、改良农作物的品质、利用植物生产＿＿＿＿＿等。（）抗虫转基因植物 ①方法：将＿＿＿＿＿导入植物体，使其具有抗虫性。 ②成果：各种抗虫作物，如抗虫水稻、抗虫棉、抗虫玉米等。 ③意义：减少＿＿＿＿＿，降低生产成本，减少环境污染。 ④主要杀虫基因：＿＿＿＿＿、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。（）抗病转基因植物 ①方法：将＿＿＿＿＿导入植物体中，使其具有抗病特性。 ②成果：多种抗病作物，如抗病的烟草、小麦、甜椒、番茄等。 ③意义：提高作物抗病力，增产。 ④主要抗病基因：抗病毒的＿＿＿＿＿和病毒的复制酶基因；抗真菌的＿＿＿＿＿基因和抗毒素合成基因。（）抗逆转基因植物 ①方法：将＿＿＿＿＿基因导入植物体，获得抗逆作物。 ②成果：多种抗逆植物，如抗盐碱和干旱的烟草、抗寒番茄、抗除草剂大豆和玉米等。 ③意义：提高作物抗逆能力，稳定高产。 ④主要抗逆基因：抗盐碱、抗干旱的＿＿＿＿＿基因、耐寒的＿＿＿＿＿基因、抗除草剂基因。（）利用转基因改良植物的品质 ①方法：将优良性状基因导入植物体，获得＿＿＿＿＿。 ②成果：＿＿＿＿＿含量较高的玉米、耐储存番茄、新花色的矮牵牛。 ③意义：改良植物的某些品种。 ④主要优良性状基因：＿＿＿＿＿的蛋白质编码基因、控制番茄果实成熟的基因、与植物花青素代谢有关的基因。．动物基因工程的成果

（）提高动物的生长速度 ①生长基因：外源＿＿＿＿＿基因。 ②成果：转基因绵羊、转基因鲤鱼。（）改善畜产品的品质 ①优良基因：肠＿＿＿＿＿基因。 ②成果：转基因牛乳汁中＿＿＿＿＿含量少。（）转基因动物生产药物 ①基因来源：药用蛋白基因＋乳腺蛋白基因的＿＿＿＿＿。 ②成果：乳腺生物反应器。（）转基因动物作器官移植的供体 ①器官供体：抑制或除去＿＿＿＿＿。 ②成果：利用＿＿＿＿＿培育没有免疫排斥反应的猪器官。．基因工程药物（）来源：转基因＿＿＿＿＿。（）成果：＿＿＿＿＿、抗体、疫苗、激素等。（）作用：预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、＿＿＿＿＿、类风湿等疾病。．基因治疗（）特点：把＿＿＿＿＿导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。（）成果：将腺苷酸脱氨酶基因导入患者的＿＿＿＿＿，治疗复合型免疫缺陷症。（）方法：分为体外基因治疗法和＿＿＿＿＿基因治疗法。四、蛋白质工程．蛋白质工程的崛起（）实质：将一种生物的＿＿＿＿＿转移到另一种生物体内，后者产生它本不能产生的蛋白质，从而产生新性状。（）目的：生产符合人们生活需要的、并非自然界已存在的＿＿＿＿＿。（）实例：天冬氨酸激酶和＿＿＿＿＿＿＿＿的活性受细胞内＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的影响，当赖氨酸浓度达到一定量时会抑制这两种酶的活性，改变两种酶的特性后，玉米游离赖氨酸含量提高。．蛋白质工程原理

人教版高中生物选修3检测目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定

第2课时将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定一、选择题题型一目的基因导入受体细胞 1．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是() 选项受体细胞导入方法 A 棉花细胞花粉管通道法 B 大肠杆菌农杆菌转化法 C 羊受精卵显微注射技术 D 小麦细胞基因枪法答案 B 解析花粉管通道法是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，A正确；将目的基因导入微生物细胞，常采用感受态细胞法(Ca2＋处理法)，这种方法能使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法，C正确；双子叶植物和裸子植物常用农杆菌转化法导入目的基因，单子叶植物(如小麦)可用基因枪法导入目的基因，D正确。 2．农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是() A．Ti质粒上 B．受体细胞染色体的DNA上 C．T-DNA D．农杆菌的拟核答案 B 解析在农杆菌转化法中利用农杆菌的T-DNA将目的基因整合到受体细胞染色体的DNA上。 3．目前将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是() A．显微注射法B．农杆菌转化法 C．基因枪法D．花粉管通道法答案 A

解析显微注射法是迄今为止将目的基因导入动物细胞中采用最多、最有效的一种方法。 4．在基因工程技术中，需要用氯化钙处理的环节是() A．目的基因的提取和导入 B．目的基因与载体结合 C．将目的基因导入受体细胞 D．目的基因的表达答案 C 解析如果载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，使其成为感受态细胞，使含有目的基因的重组DNA分子更容易进入受体细胞，目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的复制而复制。 5．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞的主要原因是() A．结构简单，操作方便 B．繁殖速度快 C．遗传物质含量少，易操作 D．性状稳定，变异少答案 B 解析微生物一般具有以下几个特点：①个体微小，结构简单；②繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代；③代谢类型多，活性强；④易变异，相对于高等生物而言，较容易发生变异。在基因工程中，主要是利用它快速繁殖的特点，可以提供更多的基因工程的产物。 6．目的基因整合到某作物DNA片段上后() A．改变了原DNA的碱基排列顺序 B．改变了原DNA上各基因的碱基排列顺序 C．改变了原DNA上各基因的复制过程 D．改变了原DNA上各基因的转录过程答案 A 解析目的基因整合到某作物的DNA片段上后，不能改变其他基因的碱基序列，也不能改变基因的复制和转录过程，B、C、D错误；只能改变原DNA的碱基排列顺序，A正确。 7．人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体加工合成。通过转基因技术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是() A．大肠杆菌B．酵母菌

基因工程知识点_超全

基因工程一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的额，因此又叫做DNA重组技术。二、基因工程的基本工具 1、限制性核酸切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）存在：主要存在于原核生物中。（2）特性：特异性，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。（3）切割部位：磷酸二酯键（4）作用：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸

（5）识别序列的特点：（6）切割后末端的种类：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。

2．“分子缝合针”——DNA连接酶（1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。

相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用: ①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞对目的基因进行大量复制。【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。 (8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。例1．限制酶MunⅠ和限制酶Eco RⅠ的识别序列及切割位点分别是－C↓AATTG－和－G↓AATTC－。如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为限制酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是（） A

基因工程基础知识梳理

基因工程的基本工具一、基因工程的概念：二、基因工程的原理和优点：三、基因工程的基本工具 1.分子手术刀：（1）来源：（2）作用：（3）不同类限制酶的区别：（4）与DNA连接酶的异同点：相同点：不同点： 2.分子缝合针：（1）分类：（2）作用：（3）区别：（4）与DNA聚合酶的异同点：区别：相同点： 3.分子运输车：（1）作用：（2）种类：（3）质粒是什么？（4）质粒的特点及每一个特点的作用： <1>.特点：作用： <2>.特点：作用：

<3>.特点：作用：基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取 1.目的基因指什么： 2.获取目的基因的来源： 3.获取目的基因的方法 1.条件： 2.基因文库的分类：基因组文库：部分基因文库（cDNA文库）： 3.基因文库的构建流程 4.两种基因文库的区别： 1.条件： 2.中文名称： 3.原理： 4.原料：

5.过程及每一步的作用：第一步：第二步：第三步： 1.条件：二、基因表达载体的构建（核心步骤） 1.基因表达载体的结构元件 1①目的基因 2启动子： 3终止子： 4标记基因： 5复制原点 2.构建基因表达载体的目的： 3.构建的方法：[理解单酶切和双酶切的区别] 三、将目的基因导入受体细胞（转化） 1.植物细胞（充当受体细胞）的转化 1农杆菌： 2Ti质粒： 3总体思路： 4农杆菌侵染植物时的机理： ⑤适用范围：

注意事项：注意事项： 2.动物细胞（充当受体细胞）的转化 1技术： 2具体谁来充当受体细胞： 3.微生物细胞（充当受体细胞）的转化 Ca2+转化法：四、目的基因的检测与鉴定 1.分子水平的检测目的：方法：结果：目的：方法：结果：目的：方法：结果： 2.个体水平的检测

肌动蛋白的克隆与鉴定

β—肌动蛋白的克隆与验证李亚楠邹曾阳孟冠奇李军张建忠沈彤摘要：Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α-smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-acti n(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。[1]β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot 很好的内参指数。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。[2] 本次实验主要通过PCR的手法来扩增目标蛋白。通过组织细胞提取DNA，用琼脂凝胶电泳来验证是否得到目标DNA；回收后的目标DNA 用PCR仪扩增，并用电泳进行回收；与T载体（PUD-18T）连接；用培养的大肠杆菌DH-5a来制备感受态细胞；将制备完成的感受态细胞均匀的涂布于含有x-gal和IPTG的混合液的LB培养基平板中进行蓝白斑的筛选；最后提取质粒DNA，经验证后保藏菌种。关键词：β-肌动蛋白横纹肌蛋白质PCR 1材料与方法 1.1 组织细胞DNA提取。[3] 1.1.1 试剂：细胞裂解缓冲液、蛋白酶K、TE缓冲液、酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、7.5mol/l乙酸铵。器材：胶头滴管、离心机、烧杯、动物组织、研钵、水浴。 1.1.2 方法取新鲜或冰冻动物组织块0.1g，尽量剪碎，置于石英研钵中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K20微升，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴20min，间歇震荡离心管数次。于台式离心机以

高中生物第4章基因工程第2节基因工程的操作程序第2课时目的基因的导入和检测同步备课教学案北师大版

第2课时目的基因的导入和检测 [目标导读] 1.结合教材P77～81图文，阐明目的基因的导入的四种方法。2.分析教材P81～83内容，掌握目的基因的检测与表达产物的测定。 [重难点击] 1.目的基因的导入方法。2.目的基因的检测与表达产物测定的原理方法。方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。一、目的基因的导入 1．花粉管通道法(如图)

(1)概念：是指外源基因利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道进入受体细胞，借助天然的种胚系统形成含有目的基因的种胚。常用的两种方法有柱头滴加法和花粉粒携带法。 (2)实验：利用花粉管通道法将目的基因导入棉花的实验操作程序 ①原理：授粉后使外源DNA能沿着花粉管通道渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵细胞、合子或早期胚胎细胞。 ②操作过程 a．提取含有目的基因的总DNA或者质粒DNA，配成质量分数为0.01%的溶液。 b．用棉线捆住将要在第二天开花的花朵，不让花朵自动开放。 c．第二天清晨给花朵进行人工授粉，授粉后套袋，作好标记。 d．0.5～1 h后用一定浓度的DNA溶液涂抹柱头。 e．收获种子，种植，进行抗虫性检测。 (3)特点 ①优点：简单经济、快捷实用，且不受植物基因型的限制，理论上适用于任何开花植物。 ②缺点：工作效率较低，且后代的遗传情况较复杂。 2．氯化钙法 (1)适用条件：运载体是质粒，受体细胞是大肠杆菌。 (2)作用原理：氯化钙使大肠杆菌细胞成为感受态细胞，细胞膜的通透性发生变化，允许含有目的基因的运载体分子进入。 (3)过程

BOP基因的克隆及鉴定

Bop基因克隆摘要：以pUC18质粒为载体，bop基因为目的基因，通过PCR扩增出含目的基因，将克隆载体pUC18和bop基因经限制性内切酶酶切后，在T4DNA接酶连接下，形成重组质粒并转化入大肠杆菌DH5a。通过氨苄青霉素平板筛选出抗性转化子，对重组子进行PCR和酶切，电泳鉴定检测完成了bop基因额的克隆。关键词：基因克隆；PCR；BOP基因第一章 1.前言 1.1 基因工程狭义上仅指基因工程。是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，表达出新产物或新性状。重组DNA分子需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆（Gene Cloning）。广义上包括传统遗传操作中的杂交技术、现代遗传操作中的基因工程和细胞工程。是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；

下游技术：基因工程菌（细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。广义的基因工程是一个高度的统一体：上游重组DNA的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想；下游过程则是上游重组蓝图的体现与保证。---基因工程产业化的基本原则。基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞或基因工程生物体的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。从实质上讲，基因工程的定义强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种（species）间限制，扩大和带来了定向改造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA，然后送到受体生物中去表达，从而产生遗传物质的转移和重新组合。[1] 1.2 PCR技术基本原理 PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依靠于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将

目的基因(COR)转入细菌细胞的方法及其检测

目的基因（COR）转入细菌细胞的方法及其检测 XXX （XXX农业与生物技术学院，XXX XXX，XXX）摘要：以PGEM-T-easy质粒为载体，将氨苄青霉素抗性基因导入大肠杆菌，通过含有氨苄青霉素的培养基筛选出具有氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌，对筛选出的大肠杆菌进行质粒DNA提取,并对质粒进行PCR扩增和酶切，将产物进行琼脂糖凝胶电泳图谱分析。结果表明：氨苄青霉素抗性基因被导入大肠杆菌中并在大肠杆菌中得到表达。关键字：PCR扩增氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌引言：随着生物科技的飞速发展，越来越多的生物技术被广泛的应用于各类应用领域。如PCR技术、基因重组、DNA连接等等已被人们广泛的应用于生物体内基因的扩增及新的生物性状的研究。然而，对于氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌染色体上整合及表达尚未见研究。本研究借助于PCR、DNA连接转化、琼脂糖凝胶电泳对氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌染色体上整合及表达进行了研究。旨在为氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌染色体上整合及表达提供一定的理论依据。 1 材料和方法 1.1 试剂与器材 1.1.1 材料试剂：大肠杆菌；PGEM-T-easy质粒；Taq酶；引物(正向、反向； 10umol/ml)；模板DNA；10×RCRbuffer；ddH 2O；dNTP（2.5mol/L）；T 4 DNAligase； Cacl 2 （0.1mol/L）；LB培养基；氨苄青霉素（50mg/ml）；溶液Ⅰ（葡萄糖，50mmol/L；Tris-HCl，25mmol/L；EDTA，10 mmol/L）；溶液Ⅱ（0.4mol/LNaOH和2%SDS用前等体积混合）；溶液Ⅲ（5mol/L乙酸钾，60ml；冰醋酸，11.5ml；水，28.5ml）；TE缓冲液（pH8.0）；0.5mol/LEDTA；70%乙醇；氯仿：异戊醇（V:V，24：1）；Tris 饱和酚：氯仿：异戊醇（V:V：V，24：24：1）；琼脂糖。 1.1.2 器材：PCR扩增仪；移液枪；电泳仪；紫外检测仪；恒温摇床；恒温水浴器；恒温培养箱；低温离心机；超净工作台；冰箱；离心管；小指管；酒精灯；牙签；培养皿、试管若干。 1.2 方法 1.2.1 PCR基因扩增 1.2.1.1 加样：

基因分离克隆和功能鉴定.

动物遗传学读书报告之新基因的分离克隆及功能鉴定学院班级：动物科技学院动物科学10级2班新基因分离克隆及功能鉴定方法研究进展前言随着DNA 分子双螺旋结构、密码子等的被发现，几种模式生物基因组测序和人类基因组计划的相继完成，使人们对基因的研究很快进入后基因组时代。基因组学时代的主要任务是图谱制作性和序列测定，后基因组学时代则是进行基因组功能注释，这也是功能基因组学的主要研究目标。而PCR 技术的诞生，推动了许多新技术和方法的应用。 1. 基因的分离克隆基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。分子克隆是指在体外对不同生物的DNA 分子进行人工剪切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA 。基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。 1.1基因的分离克隆主要方法基因分离与克隆是基因工程的第一步，它是利用分子克隆技术获取用于转化、控制目的性状相关的基因。一般方法是先建立文库(基因组文库或cDNA 文库，再利用适当的探针，通过分子杂交从基因文库分离出目的基因，这是应用最早，目前最为成熟的一种方法。而对于未知序列，常采用步移的方法，其原理是如果知道离开该基因一定距离上的DNA 序列，则可用这个DNA 序列作探针，通过染色体步移来逐步接近并最后达到待克隆的基因。先用探针筛查文库，得到阳性克隆后，将

这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分(注意不能包含重复序列作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分(即探针序列是重叠的，共有的。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛查文库。通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。以下对目的基因分离和克隆方法作一总结。 1.1.1功能性克隆通过基因产物的克隆技术在传统遗传学占主导地位的时代，人们以基因产物为导向来分离克隆基因。由于基因产物的结构、功能已知，可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列，反推其核苷酸序列，设计探针或引物从基因组DNA 文库或cDNA 文库中筛选克隆，也可以制备产物抗体，从表达载体构建的cDNA 文库中筛选相应克隆，进而分离目的基因。若可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时，可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法，筛选阳性克隆获取其目的基因。除了免疫筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得，但纯度较高时，可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，据此合成寡核苷酸用于cDNA 文库的筛选；或根据所获得的基因序列，指导5’端的引物合成，根据mRNA 3’端poly —A 序列指导合成poly —T 的3’端引物，用PCR 技术从制备细胞的mRNA 或直接从胞浆内溶物中合成相应的cDNA ，将该cDNA 克隆到表达载体上进行产物表达。 1.1.2同源性序列克隆技术随着基因研究的不断深入，人们发现几乎所有的基因与其他的基因都有一定的联系：生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。基于此原理，在其他种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA 文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列设计简并引物，并用简并引物对含有目的基因的DNA 文库

高中生物专题11.2.2 目的基因的导入、检测与鉴定学案新人教版选修3

1．2.2 目的基因的导入、检测与鉴定 [学习目标] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。在完成将目的基因导入受体细胞这一步骤后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。一、将目的基因导入受体细胞 1．转化的含义目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2．转化的方法 (1)导入植物细胞 ①农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用方法。 a．土壤农杆菌的特点：植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌侵染，其Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体的DNA上。 b．方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插