痰液标本细菌学检验(一)

痰液标本细菌学检验（一）

关键词：细胞库菌株培养中心 atcc 北京标准物质网

一、检验程序

痰及呼吸道标本的细菌学检验程序见图34—1。

二、检验方法

(一)显微镜检查

1．一般细菌涂片检查挑取标本中脓性或带血部分涂片进行革兰染色镜检，描述观察到的细菌的染色性、形态及排列等特征，可发出初步报告。

2．结核分枝杆菌涂片检查挑取标本干酪样或脓性部分做抗酸染色和金胺“O”荧光染色，前者用油镜，后者用荧光显微镜检查。具体操作详见第十五章分枝杆菌属检验。

3．放线菌及诺卡菌涂片检查将痰液用生理盐水反复洗涤数次，挑取黄色颗粒(硫黄颗粒)或不透明着色斑点，置玻片上并覆以盖玻片，轻压后置高倍镜下观察。如见中央为交织的菌丝，其末端粗杆呈放线状排列时揭去盖玻片，待干后做革兰染色及抗酸染色镜检。

4．下呼吸道其他标本检查支气管肺泡灌洗液等直接取自下呼吸道的标本，不易受上呼吸道杂菌的污染，涂片检菌的意义较大。可取离心沉淀物进行革兰染色与抗酸染色检查。

(二)培养和鉴定

1．痰培养标本的前处理于痰标本中加入一定量无菌生理盐水，剧烈振荡5～10秒后，将沉淀于管底的脓痰小片取出，置于另一试管中，同法再处理2次，可洗去痰中的正常菌群。然后向洗涤过的痰液中加入等量pH 7. 6的1％胰酶溶液，放置35℃环境90分钟，使痰液均质化后备用。

2．培养基与培养环境

(1)血琼脂平板：适用于分离多种细菌，需氧环境，可分离β-溶血性链球

环境培养，分离肺炎链球菌和β-溶血性链球菌。根菌，葡萄球菌；置于5％CO

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据血琼脂平板生长的菌落特征及镜检形态，得出初步结果，再按各类细菌特性做进一步鉴定。

环境培养，常用于分离嗜血杆菌和脑膜

(2)巧克力色琼脂平板：置于5％CO

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炎奈瑟菌等有特殊营养需求的细菌。

(3)中国蓝琼脂平板／麦康凯平板：需氧环境培养，常用于分离肠杆菌科细菌。

(4)TTC-沙保弱培养基：需氧环境培养，用于分离白假丝酵母菌及其他酵母菌、诺卡菌、放线菌以及烟曲霉菌等。

(5)厌氧血平板：厌氧环境培养，用于培养厌氧菌。

(6)结核分枝杆菌培养基：需氧或5％～10％CO

环境培养，改良罗氏培养基、

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米氏7H10培养基或其他合适的培养基，用于培养结核分枝杆菌。

环境培养，药用炭酵母琼

(7)军团菌专用培养基：置于2．5％～5. 0％CO

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脂(CYE)培养基、F-G琼脂，用于培养军团菌。

3．标本的培养

(1)普通细菌培养：将处理后的痰标本接种于血琼脂平板、中国蓝琼脂平板／麦康凯平板、巧克力色琼脂平板上，分别放入普通环境和5％～10％CO

环境

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中，35℃培养18～24小时，观察菌落特征，并涂片进行革兰染色，根据菌体的

形态特点做进一步鉴定。有条件或必耍时进行厌氧培养。具体操作详见第十七章厌氧性细菌检验。

(2)结核分枝杆菌培养：将处理后的痰标本接种于改良罗氏培养基或米氏

环境中培养。根据初步生长出菌落时间和7H10培养基，置35℃、5％～10％CO

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是否产生色素等特点，加以判定。

(3)标本的菌落计数培养：液体标本，如保护性支气管肺泡灌洗吸出液(PBAL)、气管穿刺抽吸液(TTA)、保护性标本刷洗液(PSB)标本或定量稀释均质化处理的痰标本，可做菌落计数培养。

常用的改良Gould法是一种半定量的方法，先将平皿分为A、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等4个区，阻3mm接种环取一满环液化痰液(或定量采集的PBAL、TTA、PSB)接种于血琼脂平板或巧克力色琼脂平板，先在A区画线20~40条，然后在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区分别画线4条。在做Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分区画线前，接种环均须经烧灼灭菌。接种后的培养基置35℃培养1 8～20小时，然后分别计数各区某一特征的菌落数，查阅表34—3即得出每毫升痰液中某一特征菌落细菌的对应数量。

一般认为痰液标本中，某种细菌浓度达到≥107CFU／ml，可视为病原菌；<104，可视为污染菌；若介于105～106CFU／ml两者之间时，要连续分离培养两次阻上，仍为105～106CFU／ml时，亦认为是病原菌。

例如：一份痰标本，经均质化处理过程已经进行了1：16倍稀释，按上述菌落计数方法操作，培养24小时后，某一特征最优势菌落Ⅰ区生长5个(相当于90个)，查表对应于10000行，计算(×103)得菌落数≥107CFU/ml，由此可以判断该特征菌落为病原菌。提倡做菌落计数培养有两方面原因，其一，有的标本中细菌数量可能较少，需通过茼落计数判断是否足以引起化脓性感染；其二，有的

标本污染正常菌群的可能性较大，需通过菌落计数判断哪一种菌落是引起化脓性感染的病原菌。痰标本细菌菌落计数培养还没有列入统一规范，供做参考。