基于片段的虚拟筛选与药物发现
导语
自1996 年Shuker等开创了“基于片段的药物发现( fragment-based drug discovery，FBDD) ”方法以来，人们在发现优质先导化合物的数量方面明显超过了高通量筛选( high throughput screening，HTS)方法，提高了大家对于“基于结构的药物设计( struc-ture-based drug design，SBDD) ”的理性认识，加速了新药创制过程。
FBDD 方法通常先测定水溶性好的小分子化合物( 相对分子质量＜ 300，即片段分子) 的亲和力，尽管结合力弱( 通常为几百微摩尔或毫摩尔水平) ，但其结合大都受氢键或盐键等焓因素的驱动，因此化合物的原子利用率高，冗余原子少。同时辅以结构生物学( X-射线衍射或 2D-NMR) 显示片段在靶蛋白的空间取向和结合特征，在微观结构的指导下，通过片段的增长或连接，提高结合强度，获得高活性和高质量的先导化合物分子。FBDD 是将化合物活性筛选、结构生物学技术、分子模拟、化学合成和构效关系整合在一起的综合性技术，用小分子与靶蛋白的结合特征指导优质先导物的生成，为成药性的优化预留了较大的化学空间，因而提高了研发效率。
片段对接和片段虚拟筛选
实验FBDD仅能筛选数百到数千个片段。然而，至少有25万个市售的片段，其中大部分仍未经过测试。计算作为补充方法，通过分子对接的虚拟片段筛选可以测试大部分市售片段。Carlsson小组对A2A腺苷受体（A2AAR）进行平行的基于NMR的生物物理筛选和基于对接的片段库筛选。结果强调了生物物理和基于计算的片段筛选之间的互补性，因为从NMR和基于对接的虚拟筛选命中的片段之间没有重叠。事实上，片段对接已经与实验片段筛选结合用于药物发现。
虚拟片段筛选的主要挑战是片段对接和评分的准确性。首先，难以确定片段的准确结合姿势和结合模式。由于片段尺寸小、内部自由度较低；因此在对接计算期间，碎片可能会被蛋白质表面上的许多口袋所容纳，从而导致对接位置的错误。即使将其放入正确的口袋中也难以预测片段的结合姿势，因为替代的结合可能产生相似的对接分数或计算结合能。其次，针对较大的药物样分子开发和优化了大多数评分功能，其不足以区分许多非活性片段中的弱活性片段。
片段库选择
片段库选择基于Rule of Three（简称RO3）规则：
MW ≤300
H-bond donors ≤3
H-bond acceptors ≤3
cLogP ≤3
（来自ChemBridge）
RO3规则过滤之后，可以根据自己的研究目的进行相关过滤。
案例
基于片段的药物设计是高通量筛选的有效替代方案。筛选片段优于筛选化合物的主要原因是片段的体外和计算筛选都是有效的；104个不同片段（MW <250Da）的集合通常比106-107个分子（MW <500Da）的化合物库具有更大的化学多样性。此外，片段倾向于具有良好的溶解度，这对于体外生物物理测定是有利的。基于计算的片段筛选中的一个重要优点是刚性碎片对接总是比具有几个可旋转键的分子对接更有效且通常更准确。
1)首先，2012年版本的ZINC化合物库900万个化合物依据标准：分子量在200和400 Da
之间、两个或更多个氢键受体、小于8个可旋转键、两到六个环，减少到约四分之一的相关维结构。剩余460万个化合物通过以软件分解为375,897个片段，然后将这些片段通过60Da和300Da之间的分子量过滤，至少一个氢键受体和最多三个可旋转键。
2)剩余的238,408个片段通过基于遗传算法的对接程序进行BRD4的对接，生成511,417
个姿势。根据是否与保守的天冬酰胺存在氢键，移除未参与的片段。
3)含有17,179个结合片段的化合物库，其包含665,184个分子用于柔性配体对接。最终
基于预测的结合自由能配体效率进行遴选，获得4,826个候选化合物。
4)每个蛋白-配体复合物进行100 ns分子动力学模拟，分析预测结合模式的结构稳定性，
特别注意主要相互作用。模拟显示，其预期的一些结合模式不稳定的（即氢键与Asn140侧链的断裂）的化合物被过滤。
5)最后，遴选了24种化合物用于实验验证，其中4种显示出50mM的抑制活性。且对接预
测的结合模式基本与晶体结构中观察到的结合模式相同。
参考资料
1.Sliwoski G, Lowe Jr E W. fragment-based drug design[J]. 2013.
2.Spiliotopoulos D, Caflisch A. Fragment-based in silico screening of bromodomain ligands[J].
Drug Discovery Today: Technologies, 2016, 19: 81-90.
3.郭颖, 郭宗儒. 重视基于片段的药物发现技术[J]. 中国新药杂志, 2013, 22(16):
1873-1877.
抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法
抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法 09级生科3班余振洋200900140156 一、【实验原理】 1．关于恶性肿瘤和抗肿瘤药物： 恶性肿瘤是一种常见病，严重威胁着人类的生存质量，被称为人类健康的第一杀手。多年来人类一直在不断的进行抗肿瘤药物的研究，抗肿瘤药物的筛选是整个研究过程中很重要的个环节，而进行药物的筛选首先离不开合理的筛选方法和系统。寻找选择性强、对实体瘤有效的新型抗肿瘤药物，是摆在抗肿瘤药物研究人员面前的重要任务。世界各国对抗肿瘤药物的筛选都非常重视，投入了大量的人力、物力、财力，每年都有大量的化合物(合成药、天然产物和微生物发酵产物)待筛，抗肿瘤药物筛选方法的发展经历了一个探索的过程。 8O年代中期以前，普遍采用的筛选方法是以体内小鼠白血病／淋巴瘤模型P388和L1210为基础的 J，所有化合物在进一步的临床研究之前必须通过这种小鼠肿瘤模型的筛选。即小鼠白血病P388和L1210作为第一轮初筛，能通过第一轮初筛的化合物才能被允许进入第二轮筛选。这种方法有一个很明显的缺陷就是一些在临床上有活性的药物将被筛选掉，无法保证所有具有抗肿瘤作用的药物都能通过筛选。鉴于以前的筛选方法存在较大的缺陷，1985年之后以NCI为首的一些研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法，即放弃体内小鼠筛选，代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。这种筛选系统是一种高通量的抗肿瘤筛选体系，其主要优势有两点：其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质；其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成份的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成份的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。 2．关于筛选方法： 下面为现阶段较为普遍采用的一些抗肿瘤药物的筛选方法的实验原理。 1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物 端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA和蛋白质组成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。 2）应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物 快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成份进行染色或标记。或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。现在普遍采用一种特殊的荧光染 FDAL1u(Fluoreseein diacetate)，在正常情况下它不具有荧光，但当它加人到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，FDA
虚拟药物筛选与药物分子设计教程与实战
药物分子设计前沿 摘要：近些年来，各种各样的新型疾病依次出现。因此，寻找可以治愈这些疾病的药物对人们来说至关重要。随着计算机技术的高速发展，运用计算机进行新药的模拟实验已经成为一种新的方法。本文就对这些方法做一个总的综述来介绍这些方法在新药设计过程中的应用过程。计算机辅助药物设计方法(CADD)是药物分子设计的基础。从2O世纪6O年代构效关系方法(QSAR)提出以后．经过40多年的努力和探索，CADD方法已经发展成为一门完善和新兴的研究领域。计算机辅助药物设计是应用量子力学、分子动力学、构效关系等基础理论数据研究药物对酶、受体等作用的药效模型，从而达到药物设计之目的。计算机辅助药物设计方法(CADD)大体可以分为三类：基于小分子的药物分子设计方法、基于受体结构的药物分子设计方法、计算组合方法。计算机辅助药物设计是研究与开发新药的一种崭新技术，它大大加快了新药设计的速度，节省了创创新药工作的人力和物力，使药物学家能够以理论作指导，有目的地开发新药。 关键词：药物分子设计计算机模拟分子模拟活性位点分析法 ABSTRACT：In those past years, a variety of new diseases were appeared. So, it’s vary essential for us to find the drugs that can cure these diseases. And with the fast development of computer technology, the applying of computer in the simulations of these new drugs has become a new method. In this paper, I will draw a general overview of those methods to introduce the applications in the design process of the new drugs. The method of Computer Aided Drug Design(℃ADD)was the basis 0f drugs molecule design which was proposed in 1960．During the last 40 years，the CADD method has been widely applied as a burgeoning and potential research area．The aim of CADD is to design drug according to the pharmacodynamic model between the drugs and the enzyme or receptor which is applied the quantum mechanics．molecular dynamics，and quantitative structure—activity relationship．The CADD includes three methods：method basing on the ligand，method basing on the receptor，and combinatorial chemistry method．The CADD is a new technology to research drug which can accelerate the speed of drug design，economize the manpower and material resources． KEY WORDS：Drug molecular design；computer simulation; molecular simulation；active site analysis 引言 传统药物设计从总体上来讲，缺乏成熟完善的发现途径，具有很大的盲目性，一般平均要筛选10000种以上的化合物才能得到一种新药，因此开发效率很低。随着计算机技术及计算化学、分子生物学和药物化学的发展，药物设计进入了理性阶段，其中药物分子设计是目前新药发现的主要方向。它是依据生物化学、酶学、分子生物学以及遗传学等生命科学的研究成果，针对这些基础研究中所揭示的包括酶、受体、离子通道及核酸等潜在的药物设计靶点，并参考其它类源性配体或天然产物的化学结构特征，设计出合理的药物分子。运用计算机模拟来进行新药的分子结构设计主要有三种方法：分子对接设计、遗传算法以及计算机辅助
菌种筛选方法 (2)
菌种筛选方法 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremoth ecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberell a fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的
"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就
抗肿瘤药物体内筛选试验标准操作规程(SOP)
抗肿瘤药物体内筛选标准操作规程概述： 抗肿瘤药物是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖的一类药物，作用机制包括抑制肿瘤细胞核酸或蛋白质的合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。 本操作规程包括与抗肿瘤药物申请临床试验和申请上市有关的非临床有效性和安全性研究的内容，其中着力强调非临床有效性和安全性之间的关联性，以及非临床研究和临床试验之间的关联性。旨在一方面为抗肿瘤药物的非临床研究提供技术参考；另一方面，通过技术要求引导科学有序的研发过程，使国内此类药物的研发更趋规范和合理。 本操作规程仅代表目前对抗肿瘤药物非临床研究的一般性认识。具体药物的非临床研究应在本指导原则的基础上，根据药物的自身特点制订研究方案。 研究目的： 建立一套包括抗肿瘤药物体内作用的药效学研究和评价体系及相应的标准操作规程以 及抗肿瘤药物安全性和作用新机制的研究。 ①有效性研究 抗肿瘤药物有效性研究的目的主要在于探索受试物的作用机制、作用强度、抗瘤谱等，为之后的安全性评价以及临床试验中适应症、给药方案的选择提参考信息。 ②安全性评价 安全性评价的目的主要包括：（1）估算 I 期临床试验的起始剂量；（2）预测药物的毒性靶器官或靶组织；（3）预测药物毒性的性质、程度和可逆性；（4）为临床试验方案的制订提供参考。 研究计划： (a)小鼠急性毒性测试
按照急性毒性测试的常规方法，选用昆明种小鼠，通过腹腔注射方式给药，测定体外抗肿瘤活性突出的化合物的半数致死量（LD50），参考给药小鼠体重变化情况，评价化合物的急性毒性，并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试的给药剂量。 (b)小鼠体内抗肿瘤活性测试 根据动物体内抗肿瘤活性测试的标准方法，选用昆明种小鼠，皮下接种肉瘤S180或肺癌H22瘤株，选择体外活性突出且急性毒性较低的化合物，设定合适的剂量通过腹腔注射方式给药，以临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺作为阳性对照药物，测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。 (c)专利保护范围内的化合物的继续合成 申请保护范围较大的专利，合成部分可能具有良好活性的新的化合物，拓展研究范围，发现活性更强的化合物，并申请新的发明专利。并可针对具体化合物申请从属专利，延长高活性化合物的保护期限。 （d）体外抗肿瘤活性的广泛筛选 采用MTT法或台盼蓝染色法，测定化合物对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性，确定化合物在不同瘤株间抗肿瘤活性的选择性，为裸鼠模型实验提供依据。 （e）抗肿瘤作用机理的深入研究 根据抗肿瘤（f）人癌裸鼠移植瘤模型实验活性化合物作用机理特征，选用微管蛋白聚合等实验从分子水平确认化合物的作用机理；利用人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内皮细胞骨架的影响及诱导凋亡的途经，从细胞水平上阐明化合物的作用机理。 根据抗肿瘤新药审批办法的要求，采用裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型，以相对肿瘤增值率和生存时间为指标，确定化合物的抗肿瘤活性。 （g）动物体内药物代谢动力学实验
抗肿瘤药物体内筛选试验标准操作规程(SOP)
抗肿瘤药物体内筛选标准操作规程 概述： 抗肿瘤药物是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖的一类药物，作用机制包括抑 制肿瘤细胞核酸或蛋白质的合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。 本操作规程包括与抗肿瘤药物申请临床试验和申请上市有关的非临床有效性和安全性 研究的内容，其中着力强调非临床有效性和安全性之间的关联性，以及非临床研究和临床试 验之间的关联性。旨在一方面为抗肿瘤药物的非临床研究提供技术参考；另一方面，通过技术要求引导科学有序的研发过程，使国内此类药物的研发更趋规范和合理。 本操作规程仅代表目前对抗肿瘤药物非临床研究的一般性认识。具体药物的非临床研究 应在本指导原则的基础上，根据药物的自身特点制订研究方案。 研究目的： 建立一套包括抗肿瘤药物体内作用的药效学研究和评价体系及相应的标准操作规程以 及抗肿瘤药物安全性和作用新机制的研究。 ①有效性研究 抗肿瘤药物有效性研究的目的主要在于探索受试物的作用机制、作用强度、抗瘤谱等， 为之后的安全性评价以及临床试验中适应症、给药方案的选择提参考信息。 ②安全性评价 安全性评价的目的主要包括：（1）估算I期临床试验的起始剂量；（2）预测药物的毒性靶器官或靶组织；（3）预测药物毒性的性质、程度和可逆性；（4）为临床试验方案的 制订提供参考。 研究计划： （a）小鼠急性毒性测试 按照急性毒性测试的常规方法，选用昆明种小鼠，通过腹腔注射方式给药，测定体
外抗肿瘤活性突出的化合物的半数致死量（LD5o），参考给药小鼠体重变化情况，评价化合物的急性毒性，并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试的给药剂量。 （b）小鼠体内抗肿瘤活性测试 根据动物体内抗肿瘤活性测试的标准方法，选用昆明种小鼠，皮下接种肉瘤 S180或肺癌H22瘤株，选择体外活性突出且急性毒性较低的化合物，设定合适的剂量通过腹腔注射方式给药，以临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺作为阳性对照药物，测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。 （c）专利保护范围内的化合物的继续合成 申请保护范围较大的专利，合成部分可能具有良好活性的新的化合物，拓展研究范围， 发现活性更强的化合物，并申请新的发明专利。并可针对具体化合物申请从属专利，延长高活性化合物的保护期限。 采用MTT法或台盼蓝染色法，测定化合物对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性，确 定化合物在不同瘤株间抗肿瘤活性的选择性，为裸鼠模型实验提供依据。 （e）抗肿瘤作用机理的深入研究 根据抗肿瘤（f）人癌裸鼠移植瘤模型实验活性化合物作用机理特征，选用微管蛋白 聚合等实验从分子水平确认化合物的作用机理；利用人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内 皮细胞骨架的影响及诱导凋亡的途经，从细胞水平上阐明化合物的作用机理。 根据抗肿瘤新药审批办法的要求，采用裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型, 以相对肿瘤增值率和生存时间为指标，确定化合物的抗肿瘤活性。 （g ）动物体内药物代谢动力学实验 选择在人癌裸鼠移植瘤模型实验中活性良好的化合物，开展动物体内药物代谢动力学实验，考查化合物的吸收、分布、代谢、排泄性质。 （h）动物亚急性，长毒实验 根据抗肿瘤新药审批办法的要求，测定动物亚急性、长毒性质，进行药物安全性评价。 基本方法: ①小白鼠的灌胃法
药物的发现
药物的发现： 神农尝百草之经验式和文献式众所周知，药物的发现和应用是经过原始的经验积累而完成的。这一过程是人类进行的无意识的自然药物筛选过程。随着人类对医药知识认识的深人，才开始了有意识的主动药物筛选过程，神农尝百草就是人类主动进行药物筛选的具体实践。 最早的药物来自天然植物、动物及矿物原料。药物是人类在长期的生产、生活和与疾病作斗争的过程中发现和逐步发展起来的。早期人类为维持生存不断的与伤痛疾病作斗争。在捕捉动物、采集植物为食的过程中意外发现有些天然的动物、植物、矿物质有减轻伤病或解除疾病的功效，便逐步有意识地应用它们来治疗伤病。 药物的发现与发展：偶然发现和随机筛选。 随着时代的进步药物的发现也逐步由机遇筛选向合理设计、由偶然向必然的漫长历史过程。本草时期的药物是人们在生产和生活的实践中偶然发现的，到了近代也有的药物是在实验室里偶然发现的。例如20世纪30年代发现的抗菌药物磺胺类药物是在研究偶氮染料的过程中偶然发现的，后来成为人类系统地用于预防及治疗细菌感染的一类化学合成药物，这类药物的发现和发展是近代药物发展史上的一个里程碑。抗菌药物发明的又一个里程碑式的药物是青霉素，青霉素是由英国细菌学家Fleming在研究葡萄球菌的实验中偶然发现的。 随机筛选主要是从广泛的天然资源中寻找，如植物中的化学成份，土壤微生物的代谢产物或人工合成的化合物，从中发现特定结构和作用特点的先导化合物。在此基础上进一步进行结构改进，可能发现一系列的有治疗价值的新药。例如当前人们常用的药品其中很多是从植物成份中筛选出来的。而抗生素就是从土壤微生物中筛选发展起来的。 从文献中发现：我国《史记纲鉴》称“神农尝百草，始有医药”。汉代-《神农本草经》是我国第一部药书，该书收载了365种中药，也是全世界第一部药物学著作。它所指出的大黄导泻、麻黄治喘至今仍然行之有效。唐代-《新修本草》是我国第一部药典，颁行于公元659年，有世界最早药典之称。全书收载药物共844种。明代-《本草纲目》李时珍通过毕生对于药物的调查去伪存真写成《本草纲目》收载药物1892种，插图1160幅，药方11000余条，对药物的生态、形态、性味、功能作了比较系统的记述，对后世从文献方式发现药物提供了丰富的
药物筛选方法
药物筛选的方法 分子水平筛选 Microbead FCM联合筛选 原理：FCM（流式细胞术）（flow cytometry）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术，它可以根据穿过毛细管的细胞荧光强度或类型分离细胞。由于不同的分子与标记有不同荧光素的受体或抗体结合，利用和细胞大小相似的Microbead作为固相载体取代细胞通过FCM，不同荧光标记的Microbead就被分离出来，于是靶分子或目标分子就很容易的被分离、纯化。 应用：Lanza等利用这项技术测定了患有脊髓发育不良综合症和急性骨髓源白血病病人体内的各种细胞因子受体CR表达量的变化。 蛋白质-蛋白质；蛋白质-RNA相互作用。 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation） 原理：它是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。 应用：免疫共沉淀一般用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和MS质谱分析鉴定准备样品，常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。主要用于检测大分子和大分子相互作用。 放射免疫性检测（RIA）（与EIA，FIA相比灵敏度更高，但由于放射性元素，RIA的使用受到了限制）原理： （1）竞争结合分析：Ag（非标记抗原）+ Ab（特异性抗体） - AgAb *Ag（标记抗原）+ Ab（特异性抗体）- *AgAb （2）IRMA（免疫放射分析） 应用： （1）肿瘤相关抗原的测定：AFP，CEA，CA199，CA125，CA153，CA724，CYFRA211，PSA等
虚拟筛选在中药研究中的应用前景与不足
虚拟筛选在中药研究中的应用前景与不足姓名：汪岩学号：S2010210 专业：中药学 计算机药物虚拟筛选技术是20世纪后期起发展起来的新药发现新技术，该项技术应用了现代科学研究的成果和技术，使药物发现的方式方法和理论都产生了巨大变化。 药物筛选是药物发现的最初阶段和关键步骤，其目的是发现新药。由于采用动物模型进行药物筛选的成本高、效率低、速度慢、样品需要量大等特点，近年来已逐步从以体内实验筛选为主，转变为以体外实验筛选为主特别是以高通量筛选(high throughput screening，HTS)为主的新药发现模式[1]。高通量筛选采用自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测方法和手段采集生物活性数据，每天可以完成数万甚至数十万个样品的活性检测，从而极大地提高了药物筛选的速度。 高通量筛选技术的应用，使得待筛样品的数量成为药物筛选的重要瓶颈，因此新的化学合成技术特别是组合化学合成技术得到快速发展和广泛应用。据理论推算，一个组合化学工作者一年可合成1×104～1×105个化合物，若将所有的组合化学库加在一起，目前的化合物数量可达1×l09甚至更多[2]，大量化合物的出现虽然满足了高通量药物筛选的需要，但是对于如此海量化合物的活性评价，如果采取高通量筛选的方法，其阳性率很低，一般不到万分之一。在这种情况下，仅仅依赖于高通量筛选技术发现先导化合物，其成本高且成功率低，将造成大量不必要的浪费。因此，目前开展药物筛选，还需要引入其他新理论、新方法和新技术，以提高新药发现的几率，降低新药发现的成本。 药物虚拟筛选是基于药物设计理论，借助计算机技术和专业应用软件，从大量化合物中挑选出一些有苗头的化合物，进行实验活性评价，其阳性率一般在5％～20％，远远高于高通量筛选的阳性率[3]，但虚拟筛选的计算结果最终还需要实验结果来验证。因此，虚拟筛选技术与实验筛选技术优势互补，如果将两者结合起来，将有利于新药的快速发现。 目前，基于相似性的方法作为实用工具已被广泛应用于药物设计过程中。由于组合化学技术的应用，化合物的合成速度大大提高，因而产生大量不同结构的化合物，在此基础上，最常应用的虚拟筛选方法就是基于分子相似性的方法。另外，这种方法还用于确定待筛化合物结构类型，相似性配体分类以后，构建生物活性与亚结构或功能团出现与否的SAR模型，这些模型用于决定化合物参与实验筛选的优先权。 一、虚拟筛选的应用及优势 在药物筛选过程中，应用虚拟筛选技术方法指导药物筛选，首先需要确定药物筛选的疾病相关药物靶点，在此基础上设计虚拟筛选策略。化合物数据库的处理需利用非类药化合物排除法和假阳性化合物排除法，对化合物数据库进行初步过滤，然后应用基于配体的虚拟筛选方法和(或)基于受体的虚拟筛选方法，对化合物数据库作进一步过滤，从中挑选部分有苗头的化合物进行生物活性评价。虚拟筛选完成以后，库中的化合物分为两个部分：一部分为被排除的化合物，另一部分为待筛化合物。待筛化合物经实验筛选后，一般情况下可以发现一些活性化合物，将这些化合物的结构特点，反馈到化合物数据库，可以用于评价虚拟筛选的方法策略。对于特定药物靶点的药物筛选，通过虚拟筛选和实验验证的多次反复，可以不断完善两者结合的方法策略，为基于其他靶点的药物筛选提供借鉴。 近年来，虚拟筛选和高通量筛选等多种新药发现技术在新药发现中的整合应用，出现了许多成功的实例，如HIV Nef的蛋白一蛋白相互作用的抑制作用研究，抗肿瘤药物研究，抗流感病毒神经氨酸酶抑制剂的发现等。 应用多种虚拟筛选方法所得到的待测化合物，其阳性率均有所提高，阳性率最高可达6 ％以上。经虚拟筛选，待筛化合物的数量减少了10余倍，但其中活性化合物的阳性率比
天然抗肿瘤药物的筛选方法
物碱,文献报道该类生物碱具有抗肿瘤作用,可治疗皮肤鳞癌、皮肤基层细胞癌等[25,26]。 219 局部麻醉作用:以脊蛙足蹼、豚鼠皮丘、在体蛙坐骨神经丛及蛙、兔椎管等为实验材料的麻醉实验研究证明,不同浓度的菊叶三七水提醇沉液分别具有明显的表面、浸润及传导麻醉作用。椎管注射,脊髓出现先兴奋后抑制现象,有可逆性。其局麻作用强度随着浓度加大而成比例地增强,存在药物浓度2反应依赖关系[27]。 2110 其他作用:菊叶三七还具有明显的镇静、安定、催眠、抗惊厥等中枢神经系统抑制作用[25]。在坦桑尼亚,Shambaa 部族孕妇服一种该属植物土三七根煎剂用以堕胎[28]。2111 毒理研究:该属很多植物中都含有吡咯啶类生物碱,该类生物碱能使肝细胞RNA酶活性下降,RNA、DNA的合成能力下降,细胞不能完成有丝分裂,从而形成多核巨细胞,坏死与RNA合成减少DNA横向断裂有关[25]。以菊三七碱注射液对大鼠进行急性毒性实验,ip50mg/kg,隔日1次, 6次后动物全部死亡,镜检显示肝脏呈广泛急性坏死;在大鼠亚急性实验中肝脏出血、瘀血、变性坏死,并见肝小静脉周围纤维组织增生。菊三七碱剂量与实验持续时间对肝脏病变的程度有显著影响。大剂量短期使用主要引起广泛急性肝坏死,小剂量长期使用除引起肝坏死外,可引起肝小静脉和肝动脉周围组织增生[29]。也有部分该属植物毒性较低,如小鼠po灵菊七,其最大耐受量大于23016g/kg,相当于成人日用量的512倍,说明其毒性极小,口服安全[24]。 3 结语 菊科菊三七草属部分植物,在民间已经被作为药材使用,且具有多方面的药理活性,一方面应注意到该属很多植物中所存在的双稠吡咯啶生物碱对动物和人的肝毒性和致癌作用;另一方面应对除双稠吡咯啶生物碱以外的其他活性成分进行研究。今后应加大对该属植物资源的研究工作为其充分利用提供参考。 参考文献: [1] 广东植物研究所1海南植物志[M]1北京:科学出版社, 19741 [2] 中国科学院植物研究所主编1中国高等植物图鉴[M]1第四 册:北京科学出版社,20021 [3] 唐世蓉,吴余芬,方长森1菊叶三七抗疟成分的提取鉴定 [J]1中草药,1980,11(5):19321951 [4] Russell J,J ameset N,Mabry B,et al113C2NMR Spectros2 copy of pyrrolizidine alkaloids[J]1Phytochemist ry,1982, 21:43924451 [5] 袁珊琴,顾国明,魏同泰1菊叶三七生物碱成分研究[J]1药 学学报,1990,25(3):19121971 [6] Helmut W1Two pyrrolizidine alkaloids from Gy nura scan2 dens[J]1Phytochemist ry,1982,21(11:2767227681 [7] Erhard R,Alexandra E,Helmut W1Pyrrolizidine alkaloids from Gynura divaricata[J]1Planta Med,1996,62(4):3861 [8] Mat heson J R,Robins D J1Pyrrolizidine alkaloids from Gy2 nura sarmentosa[J]1Fitoterapia,1992,63(6):55725611 [9] Ferdinand B,Christa Z1Naturally occurring terpenoid deriv2 atives[J]1Phytochemist ry,1977,16:49424981 [10] Jong T T,Chou H,J u Y1An optically active chromanone from Gy nura f ormosana[J]1Phytochemist ry,1997,44(3): 55325541 [11] Lin W Y,Kuo Y H,Teng C M,et al1Anti2platelet aggrega2 tion and chemical constituent s from t he rhizome of Gy nura j aponica[J]1Planta Med,2003(69):75727641 [12] 胡 勇,李维林,林厚文,等1白背三七地上部分的化学成 分[J]1中国天然药物,2006,4(2):15621581 [13] 卓 敏,吕 寒,任冰如,等1红凤菜化学成分研究[J]1中 草药,2008,39(1):302321 [14] Lin W Y,Teng C M,Tsai I L,et al1Anti2platelet aggrega2 tion constituent s from Gy nura elli ptica[J]1Phytochemis2 t ry,2000,53(8):83328361 [15] Takahira M,K ondo Y,Kusano G,et al1Four new3a2hy2 droxy spirost252ene derivatives from Gy nura j aponica Makino [J]1Tet rahed ron L ett,1977,(41):3647236501 [16] 李丽梅,李维林,郭巧生,等1白背三七化学成分研究[J]1 时珍国医国药,2008,19(1):11821191 [17] 孙凤英,刘晓秋,孙彤伟,等1菊三七化学成分的研究(Ⅱ) [J]1中草药,1992,(2):10221041 [18] 张铭龙,刘文彬,李星元,等1菊三七生物碱的提取以及类 似物的药理活性比较[J]1吉林中医药,1998,4:352381 [19] 李成章1紫背三七止血作用的实验观察[J]1中药通报, 1985,10(9):42624291 [20] 刘贺之,庞 健,王增岭,等1菊三七与参三七对血小板超 微结构影响的研究[J]1药学学报,1982,17(11):80128031 [21] 林 菁,林建忠,李常春,等1红番苋水提物的抗炎作用 [J]1福建中医药,1996,27(2):232241 [22] Zhang X F,Tan B K1Effect s of an et hanolic extract of Gy2 nura p rocumbens on serum glucose cholesterol and triglyceride levels in normal and streptozotocin2induced diabetic rat s[J]1 S ingapore Med J,2000,41(1):92141 [23] 胡 勇,李维林,林厚文,等1白背三七地上部分降血糖作 用研究[J]1西南林学院学报,2007,27(1):552581 [24] 刘 莹,徐向进,陈明珠,等1灵菊七的急性毒性与降糖作 用研究[J]1解放军药学学报,2005,21(5):34023421 [25] 史清水,袁惠南1菊三七研究概况[J]1中草药,1991,22 (8):37723801 [26] 林启寿1中草药成分化学[M]1北京:科学出版社,19771 [27] 刘学韶,刘希智1菊三七的药理作用研究[J]1中草药, 1987,18(6):212241 [28] 余国奠1东非的堕胎和利分娩药用植物[J]1中药通报, 1982,7(5):6281 [29] 刘宝庆,马晋渝,王旭东,等1菊三七碱对动物肝脏毒性的 实验研究[J]1中草药,1984,15(1):272291 天然抗肿瘤药物的筛选方法 顾琳娜1,顾 昊23 (11湖州市药品检验所,浙江湖州 313000;21首都医科大学附属北京朝阳医院,北京 100020) 摘 要:恶性肿瘤是一种严重危害人类健康的疾病。目前发现许多天然药物具有抗肿瘤作用。随着细胞生物学、分子药理学和肿瘤药理学研究的发展,针对细胞和分子靶点的天然药物已成为当今抗肿瘤药物研究的重要方向。在研究过程中,建立合理的抗肿瘤药物筛选方法就显得尤为重要。详细介绍了近年来天然抗肿瘤药物的筛选方 3收稿日期:2008208210
肿瘤药物筛选
运用MTT法对一种新型抗肿瘤药物的筛选 1.细胞培养 将几种肿瘤细胞（HEPG2人体肝癌细胞、HELA宫颈癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞、PC-3人前列腺癌细胞）用含10%热灭活的小牛血清的RPMI1640培养液于37℃, 5%CO2及饱和湿度下培养。 2.药物处理 将药物单体或提取物分别溶于DMSO, 作用于培养细胞体系。设置药物浓度在0.005至0. 5( mg/ mL) 之间, 等量DMSO作为阴性对照。培养体系中溶剂浓度不超过1%。培养24h 后, 显微镜下观察细胞状态。 3.体外药物敏感性分析 针对药物单体, 以几种肿瘤细胞系为实验模型, 以MTT实验法分 析其体外抗肿瘤活性。 4.MTT比色法实验步骤： 4.1贴壁细胞： （1）、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。 （2）、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况 （3）、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 （4）、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。（5）、终止培养，小心吸去孔内培养液。 （6）、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 （7）、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜） 4.2悬浮细胞： （1）、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加所要筛选的药物A（有毒性）10ul用培养液稀释l g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul 加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100 (储存液100 1640）。（2）、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 （3）、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值） （4）、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔
药物筛选
药物筛选 药物筛选是现代药物开发流程中检验和获取具有特定生理活性化合物的一个步骤，系指通过规范化的实验手段从大量化合物或者新化合物中选择对某一特定作用靶点具有较高活性的化合物的过程。药物筛选的过程从本质上讲就是对化合物进行药理活性实验的过程，随着药物开发技术的发展，对新化合物的生理活性实验从早期的验证性实验，逐渐转变为筛选性实验，即所谓的药物筛选。作为筛选，需要对不同化合物的生理活性做横向比较，因此药物筛选的实验方案需具有标准化和定量化的特点。随着组合化学和计算化学的发展，人们开始有能力在短时间内大规模合成和分离多种化合物，因而在现代新药开发流程中药物筛选逐渐成为发现先导化合物的主要途径之一。 筛选模型: 筛选模型就是在药物筛选实验中所应用的药理实验模型，由于药物筛选要求实验方案有标准化和定量化的特征，因而在传统药理实验中常见的动物实验在药物筛选中较少应用，根据实验模型的不同，药物筛选可以分为生化水平的筛选和细胞水平的筛选。 生化水平的药物筛选用拟开发药物作用的靶点设计实验，一般而言这种作用靶点是具有特定生理功能的蛋白质，如酶和受体等，此外一些编码功能明确的DNA也越来越多地成为药物作用的靶点。候选化合物与靶点混合后，可以通过酶连免疫、荧光显色、核磁共振等方法定量测定化合物与靶点的相互作用，从而成为筛选化合物的依据。 细胞水平的药物筛选是更接近生理条件的一种药物筛选模型，其模型是拟设计药物作用的靶细胞，应用细胞培养技术获取所需细胞，将这些细胞与候选化合物相互作用，通过与生化水平筛选类似的检测技术测定化合物的作用能力，从而对化合物进行筛选。 生化水平的药物筛选操作相对简单，成本较低，但是由于药物在体内的作用并不仅仅取决于其与靶酶的作用程度，吸收、分布、代谢、排泄均会对药物的作用产生极大的影响，仅仅一道薄薄的细胞膜就能够阻挡住许多候选化合物成为药物的道路，因而生化水平的药物筛选不确定因素更多，误筛率更高。细胞水平的药物筛选模型更接近生理条件，筛选的准确率更高，但是需要建立细胞模型，操作更复杂，成本更高，数据之间的平行形较差，另外由于技术的限制，有些靶标还不能进行细胞水平的药物筛选。 高通量筛选 高通量筛选最初是伴随组合化学而产生的一种药物筛选方式。1990年代末，组合化学的出现改变了人类获取新化合物的方式，人们可以通过较少的步骤在短时间内同时合成大量化合物，在这样的背景下高通量筛选的技术应运而生。高通量筛选技术可以在短时间内对大量候选化合物完成筛选，经过近十年的发展，已经成为比较成熟的技术，不仅仅应用于对组合化学库的化合物筛选，还更多地应用于对现有化合物库的筛选。目前世界各大药物生产商都建立有自己的化合物库和高通量筛选机构，对有潜力形成药物的化合物进行篦梳式的筛选。 一个高通量药物筛选体系包括微量和半微量的药理实验模型、样品库管理系统、自动化的实验操作系统、高灵敏度检测系统以及数据采集和处理系统，这些系统的运行保证了筛选体系能够并行操作搜索大量候选化合物。高通量筛选技术结合了分子生物学、医学、药学、计算科学以及自动化技术等学科的知识和先进技术，成为当今药物开发的主要方式。完整的高通量筛选体系由于高度的整合和自动化，因而又被称作“药物筛选机器人系统”
治疗阿尔茨海默病的中药多靶药物计算机虚拟筛选
Traditional Chinese Drug Research ＆Clinical Pharmacology,2010May ,Vol．21No．3 阿尔茨海默病（Alzheimer ’s Disease ，AD ）是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍[1-2]。伴随着人口老龄化的日趋明显，AD 作为老年期痴呆最常见的 一种类型，必将成为我国一个重要的医学和社会问题[3]，因此开发有效的AD 治疗药物是药学研究者关注的热点。本研究采用分子对接方法从中药中快速筛选AD 关键治疗靶酶的天然配体，为新型AD 治疗药物的研发提供先导化合物。 fluences on transfection efficiency in gene delivery[J].J Control Re － lease ，2007，123（3 ）：184-194.[6]Gamrekelashvili J ，Kr üger C ，von Wasielewski R ，et al.Necrotic tumor cell death in vivo impairs tumor-specific immune responses[J].J Immunol ，2007，178 （3）：1573-1580.[7]王静，李茹柳，郭文峰，等.基于脾虚证相关基因功能鉴定的小 肠上皮细胞RNA 干扰转染条件的研究[J].广州中医药大学学报，2009，11 （26）：624-629.[8]王静.脾气虚证相关基因RPS20在IEC-6细胞的生物功能鉴定[D]． 广州中医药大学博士学位论文，2009. [9]Chen YL ，Chen WW ，Wang YF ，et al.Bioinformatics research on chronic superficial gastritis of Pi-deficiency syndrome by gene arrays [J].Chinese Journal of Integrative Medicine.2009，15 （5）：341-346.[10]Brummelkamp TR ，Bernards R ，Agami R.A system for stable ex － pression of short interfering RNAs in mammalian cells [J].Science ， 2002，296 （5567）：550-553.[11]Fewell GD ，Schmitt K.Vector-based RNAi approaches for stable ， inducible and genome-wide screens[J].Drug Discov Today ，2006，11（21）：975-982. [12]李刚.RNAi 研究现状与进展[J]. 广东医学，2003，24（3）：327-329. [13]潘宁，章蔼然，侯颖春.脂质体介导法转染肿瘤细胞效率的优化 [J].生物技术，2008，18 （6）：47-50.（编辑：梁进权） 收稿日期：2009-12-28作者简介：姚丽梅（1975-），女，硕士，讲师，主要从事中药的教学科研工作。Email ：yaolm@https://www.360docs.net/doc/fe6451586.html, 。通讯作者：朱伟，副研究员，研究方 向：中药药效物质基础研究。Email ：zhuwei9201@https://www.360docs.net/doc/fe6451586.html, 。基金项目：中国博士后基金（20060390721）；广东省中医药局建设中医药强省课题（2008334）；广东省自然科学基金课题（9151063201000050）。 治疗阿尔茨海默病的中药多靶药物计算机虚拟筛选 姚丽梅1，朱伟2（1.广东食品药品职业学院，广州510520；2.广州中医药大学第二临床医学院，广州510106 ）摘要：目的用现代化学信息学手段和中药化学数据库寻找中药中治疗阿尔茨海默病的多靶药物。方法采用 Accelrys 公司Discovery Studio 分子模拟软件包 （版本2.5.5），对蛋白质晶体结构数据库（Protein Data Bank ，PDB ）中5个阿尔茨海默病相关靶酶的三维结构活性部位进行分析，通过配体对接 （Ligandfit ）模块进行分子对接。结果分别以靶酶原配体的打分函数为阈值，筛选出中药化学数据库中6个具有多靶作用的化学成分。结论该研究结果可为新型阿尔茨海默病治疗药物的研制提供参考。 关键词：计算机虚拟筛选；中药；阿尔茨海默病；分子对接；多靶药物中图分类号：R285.5文献标识码：A 文章编号：1003-9783（2010）03-0322-03Computer Virtual Screening of Multitarget Chinese Medicine for Treatment of Alzheimer's Disease YAO Limei 1，ZHU Wei 2（1.Guangdong Food and Drug Vocational College ，Guangzhou 510520,China ；2.Second College of Clinic Medicine ，Guangzhou University of Chinese Medicine ，Guangzhou 510006，China ）Abstract ：Objective To screen the multi-target Chinese medicine for the treatment of Alzheimer's disease (AD)based on chemical informatics and the Chinese medicinal chemical database.Methods The optimized complex struc －ture of the 5kinds of AD-associated target proteins from Protein Data Bank was analyzed by software package Discov － ery Studio （2.5.5）of Accerlrys company.Molecular docking was carried out through Ligandfit module.Results With docking score of original inhibitor and the receptor as the threshold values ，six compounds from Chinese medicinal chemical database were predicted to have good interactions with those five target proteins.Conclusion It is expected that six identified compounds could be helpful for the development of new AD therapeutic drugs. Keywords:Computer virtual screening;Chinese medicine;Alzheimer's disease;Molecular docking;Multitarget drugs ·322 ·