木质纤维素资源高效生物降解转化中的关键科学问题研究

项目名称：木质纤维素资源高效生物降解转化中的

关键科学问题研究

首席科学家：曲音波山东大学

起止年限：2011.1至2015.8

依托部门：教育部山东省科技厅

二、预期目标

总体目标：

提出3-5套新的木质纤维素类生物质生物转化液体燃料和化学品的生物炼制技术方案，培养一支高水平的基础研究和技术开发队伍，最终为在我国建立大规模利用木质纤维素资源转化液体燃料和大宗化学品的新型工业体系，实现社会经济可持续发展提供理论与技术基础。

五年预期目标：

1）通过阐述植物生物质抗生物降解的组成和结构特征，建立起改造纤维生物质组成和结构以提高降解效率的理论体系；解析预处理技术对提高纤维生物质降解性的结构基础，提出高效、经济和实用的预处理技术方案；

2）研究微生物对天然或预处理后底物的降解机理，特别是纤维素解聚机理、去结晶化途径以及提高纤维素酶的持续化降解能力的途径等，探讨采用现代系统生物技术，从复杂纤维质降解多酶体系中，筛选和发现新的高效、耐逆、适合工业要求的纤维质降解酶类；为降解不同的木质纤维素资源研制出低成本且高效的复合酶系；

3）选育适于转化纤维质糖分为平台化合物的微生物，研究其代谢调控机理与机制，指导构建高效代谢工程菌，研究定向转化平台化合物的过程及相关产品的利用途径；进而通过对预处理、产酶、酶解和发酵的反应动力学、工程学和方法论的研究，将预处理技术、生物反应与分离过程耦合起来，提出新的生物炼制技术方案。

4）从木质纤维素生物降解转化角度，构建纤维素降解和糖转化利用的数据库，其中包括木质纤维素原料组成与结构特征、纤维素降解微生物类群与特性、纤维素酶、半纤维素酶和木素酶及复合酶系，新型糖代谢的功能微生物等，建立专门的信息共享平台和网站，为实现大规模降解转化木质纤维素资源提供理论、技术和信息支撑。

五年的可考核指标:

提出2-3种新的高效、低能耗、少抑制物的预处理方案；

筛选到5-10种新的关键酶或非酶降解因子，构建出高效的纤维素降解酶系，使酶解转化率大于90%；

使吨乙醇用酶成本从2000元以上降到800元以下；

构建出能全糖共利用、表达纤维降解相关酶组分的统合生物加工工程菌株

3-5株，发酵性能达到国际先进水平；

综合前述进展，设计出多技术集成、全组分利用、多产品选择、经济上有竞争力的木质纤维素生物炼制技术路线3-5条；

发表相关研究论文200篇以上，包括SCI影响因子超过5的论文5-10篇，总影响因子超过300；

三、研究方案

1）学术思路：

以研究植物木质纤维素类生物质对生物降解的抗性屏障及其破解之道为核心，深入研究微生物的多种多样的降解天然纤维的策略，探索人类干预生物降解过程，认识降解产物的复杂性，提高其降解转化效率，实现全部降解糖类的代谢转化，使之转而为人类可持续发展服务的可能途径。

该学术思想可以用下图简示：

2）技术途径：

以植物有效防止微生物及酶降解的抗性屏障为切入点，从宏观（细胞）、微观（大分子）层次分析纳米级生物催化剂在降解过程效率低下的原因出发，研

究可能的物理化学预处理途径，使之有利于纳米级酶分子的作用（扩散、持续性降解与酶分子协同作用），同时，加强对微生物降解机理及其多样性、酶系组分协同作用及其合成调控机理的研究，对微生物酶分子和复合酶系进行定向进化或理性改造，加强对纤维降解糖类代谢网络的研究和代谢（进化）工程菌的构建研究，进而将一系列的工程技术手段集成起来，建立起高效的复合生物炼制转化系统。

总的技术途径可以用下图表示：

3) 创新点与特色：

（1）提出木质纤维素的抗降解性是生物质难以高效转化的核心问题，从纳米尺度和生物降解角度来研究木质纤维素超分子结构；（2）深入研究生物质的微生物降解的多样性，寻找新的生物降解因子，设计出高效的复合生物催化剂；（3）使用分子生物学改造相关的产酶和发酵微生物，设计和构建工程微生物，实现全糖定向生物转化为生物基产品，并使应用生物转化过程的成本及投资明显降低；

（4）完成木质纤维素类生物质生物转化技术的优化、耦合和系统集成，为生物质综合生物炼制产业的建立构建理论和实践基础。

课题设置

课题1、植物生物质抗生物降解屏障解析与破解途径探索

研究内容：

1. 植物纤维类生物质抗降解屏障的定量解析

高通量、快速纤维生物质结构和组成分析。利用近红外（NIR）结合GC-MS 细胞壁组份分析等技术建立高通量分析、快速测定生物质结构和化学组成的技术，为明确生物质结构和组成与纤维生物质降解转化之间的关系以及鉴定经分子改良的优良品系提供便捷的分析手段。

2. 植物细胞壁生物质特性与降解转化效率的关系

建立表征细胞壁超分子组成与结构的方法，测定木质纤维素生物质转化过程中基本的物理化学限制因子；利用木素酶、半纤维素酶、纤维素酶等处理，研究细胞壁超分子结构中不同组分的构效关系；基于木质纤维素超分子结构研究纤维素酶催化过程的定量构效关系，与酶分子催化动力学过程，基于定向进化、定点突变等新技术提高酶组分的活力。

3．预处理过程中降解屏障的解构过程及其优化

研究预处理技术对降解屏障的影响，建立高效打开酶分子通道的可行方案。考察不同预处理条件下的底物成分变化（如纤维素、半纤维素、木素含量变化）和结构变化（纤维素结晶度、聚合度变化）以及对可降解性能的影响。探讨预处理过程中发酵抑制物的生成动力学。

经费比例：15%

承担单位：中国科学院过程工程研究所、山东大学

课题负责人：陈洪章

学术骨干：赵建、王禄山、邱卫华

课题2、木质纤维素生物降解多样性、新降解因子及相关机理

研究内容：

1. 结晶纤维素结构解聚的分子机理及相关生物因子的分离鉴定与特征化

在生化分离分析的基础上，通过对特定菌种或群落的不同酶活组分及非酶组分的组合配比，借助蛋白质组学定性和定量分析鉴定技术，分离鉴定能提高木质纤维素协同酶解活性的关键组分；结合底物超微结构观察及酶分子吸附模拟，深入研究阐述酶分子在木质纤维素高效酶解过程中的作用机制。

2. 天然纤维素降解的多样性分析

2.1天然生境纤维素降解微生物群系分析。

2.2 分离新型纤维素降解微生物。

2.3 用比较基因组学技术探寻新的降解策略。

3. 新纤维素降解酶和降解因子的发现分析新生物降解因子参与纤维素降解或解聚作用的模式与相关机理。分析特定环境高效酶解体系的多样性与结构组成，从中寻找能促进提高现有酶系催化水解效率的新酶、非酶蛋白质或非蛋白因子，并获得新酶或非酶蛋白因子的克隆表达；在深入研究阐述这些新降解因子在特殊环境中木质纤维素高效酶解过程中作用机制的基础上，从中筛选和发现新的高效、耐逆、适合工业要求的促纤维质降解因子。

经费比例：15%

承担单位：中国科学院微生物研究所、山东大学

课题负责人：董志扬

学术骨干：陈冠军、刘巍峰、卢雪梅、倪金凤

课题3、真菌游离酶系纤维素降解机理、酶系合成调控与高效酶系重构

研究内容：

1. 真菌纤维素酶合成代谢调控分子机制研究

在基本完成了对斜卧青霉原始菌株和抗降解物阻遏的工业高产纤维素酶突变株的全基因组测序的基础上，采用高通量基因组测序、数字化全基因组表达谱分析、荧光差异蛋白表达分析、RNA沉默、酵母双杂交等先进技术，通过比较基因组学、转录组学和蛋白质组学等方法，鉴定出关键节点基因/蛋白及其在纤维素酶表达调控网络中的位置和功能；并利用高效转化和基因评价体系对候选基因进行快速功能验证和评价，解析哪些基因或通路的改变导致了表型（高产纤维素酶突变、抗降解物阻遏）的变化，从而阐明纤维素酶合成的诱导机制、阻遏机

理和高产纤维素酶突变的分子基础，为进一步提高菌株产酶能力和改进酶系组成提供指导。

2.真菌木质纤维素降解复合酶各组分间的协同作用

构建纤维素酶、半纤维素酶和最佳酶系的组成和比例以及纤维素材料物理化学性质的数据库，为降解不同的木质纤维素资源调制低成本且高效的复合酶系提供理论依据。分离鉴定能提高木质纤维素协同酶解活性的关键组分，构建特定环境高效酶解体系的结构组成及其相互作用模式，提高纤维素酶各组分酶协同水解效率，最大限度降低纤维素酶水解过程中产物反馈抑制效应。

3. 真菌纤维素酶合成代谢调控的改造及纤维素酶系的优化重构

选育高分泌表达菌株；结合相关蛋白运输分泌蛋白的转录表达分析，探询纤维素酶的高分泌机制。构建纤维素酶的高效表达新系统，培育高效产酶优良菌种。针对丝状真菌纤维素酶合成代谢关键调控因子，通过嵌合体技术、基因敲除技术、RNA干扰技术和基因过量表达技术等对真菌纤维素酶表达调控网络进行人工改造，探索真菌纤维素酶整体表达水平提高及纤维素酶各组分酶表达水平的精确调控，重构具有对纤维素高效水解糖化能力的纤维素酶系，优化纤维素酶各组分的结构。

经费比例：25%

承担单位：山东大学、中国科学院上海生命科学研究院、天津工业生物技术研究所

课题负责人：曲音波

学术骨干：田朝光、方诩、汪天虹、严兴、张磊

课题4、细菌酶复合体纤维素降解转化机理和纤维小体的解析、重构

研究内容：

1. 高温厌氧纤维素降解细菌及纤维小体的筛选和多样性研究

1.1从极端环境中筛选和构建厌氧纤维素降解菌群，建立不可培养微生物筛选手段，发掘高温厌氧纤维素高效降解细菌，结合16S rRNA基因分析，研究不可培养微生物的筛选策略；

1.2运用高通量基因组测序技术，从高效纤维素降解群落中通过宏基因组分析获取关键基因信息。分析包括不可纯培养细菌在内的高温厌氧纤维素降解细菌

群落中纤维素降解相关基因的分布、丰度、可能的协作及进化关系。通过蛋白质组学分析，结合生理生化验证，研究纤维素降解复合体，尤其是纤维小体的组成及多样性。结合微生物筛选以及酶活力验证，获得新的纤维素降解关键基因及辅助因子。

2. 纤维小体的解析、体外重构、性能改良

2.1研究高效纤维素降解菌株的纤维小体的组成成分，分析各成员在空间上的排列及蛋白－蛋白相互作用，解析酶在空间上的集群与功能上的相互配合对结晶纤维素降解效率的影响。对关键蛋白或复合体进行三维结构解析，从分子水平分析结构与功能关系。

2.2体外重构纤维小体。进一步了解及验证纤维小体的结构、功能及其装配机制，为其性状改良奠定必要的理论基础。对纤维小体骨架蛋白进行优化设计、表达；同时利用功能基因组学和蛋白质组学的方法，对纤维小体关键酶进行筛选并重组表达，在此基础上体外构建人工纤维小体，并进行性状鉴定。

2.3对纤维小体进行性能改良：广泛筛选各种互补性酶组分，在底物特异性、抗逆性、催化活性、功能互补性等方面寻求最佳酶组合，充分发挥纤维小体固有的协同效应。对关键酶进行理性设计或定向进化改造，以期提高对预处理过程产生的抑制物的抗逆性，拓宽底物谱，解除产物抑制，最终提高重构纤维小体的总体木质纤维素降解效率。最后通过设计紧凑型微型纤维小体，降低体外重组纤维小体的难度，以期减少酶生产成本，最终达到实用化。

3.纤维小体的合成代谢调控机制及CBP乙醇生产技术路线的设计及改造

3.1 对中高温产纤维小体模式菌株，包括 C. thermocellum和 C. cellulolyticum，进行转录组学分析分析，比较菌株在含有纤维素或者其它碳源培养基中基因的表达情况，通过蛋白质组分析纤维小体的组成变化，根据这些组学数据，研究嗜热厌氧菌纤维小体在功能上的进化、表达和调控机理。

3.2对模式菌株热纤梭菌（C. thermocellum）LQR1进行遗传改造，设计高温厌氧细菌混合培养或热纤梭菌超级工程菌产乙醇的CBP路线。通过遗传改造，提高纤维小体的质量和数量，敲除产酸代谢途径，通过互补混合培养实现五、六碳糖共代谢，提升整体纤维素降解效率，降低生产成本。对纤维素生物转化过程采取多种物理化学手段进行表征，监测从预处理到发酵完成过程中木质纤维素原

料的变化、抑制物及产物的表观曲线，监测纤维小体在发酵过程中组成成分及酶活性的变化，通过代谢流和代谢组学分析，对CBP发酵过程进行优化，为实现木质纤维素乙醇产业化奠定基础。

4. 基于纤维小体产生菌生物强化的木质纤维素高效降解机理

以木质纤维素发酵制氢为目标体系，研究基于中高温产纤维小体梭菌 C. thermocellum和C. cellulolyticum强化的木质纤维素生物降解过程，建立该降解过程与发酵制氢匹配的体系。利用微生物分子生态手段，追踪产纤维小体梭菌在混合培养体系中的动态分布；研究纤维小体与木质纤维素的相互作用；解析纤维小体在木质纤维素转化过程中的功能，从而解析基于纤维小体产生菌生物强化的木质纤维素高效降解及转化的机理。

5. 人工菌群设计实现木质纤维素同步糖化产氢

以构建木质纤维素高效发酵制氢体系为目标，研究中高温产纤维小体梭菌与产氢菌混合发酵同步糖化产氢过程，揭示菌群间的相互作用机制。通过人工菌群合理设计，实现纤维素降解菌和产氢菌的协同作用，研究人工菌群在糖转化（纤维素、寡糖、二糖、己糖、戊糖）、中间代谢中产物（甲酸等有机酸）的代谢流相互作用，构建人工菌群代谢网络模型，解析混合菌群的关键代谢调控节点，特别是研究人工菌群中糖代谢对纤维素降解的解抑制及其缓释提高产氢菌产氢得率的机理和方法。

经费比例：14%

承担单位：中国科学院青岛生物能源与过程研究所、清华大学

课题负责人：崔球

学术骨干：邢新会、李福利、宋厚辉

课题5、纤维降解组分高效生物转化的代谢网络调控与改造

研究内容：

1. 微生物戊糖代谢与转运网络的解析

解析相关菌株的戊糖代谢相关基因的功能与作用，解析戊糖运输和代谢机理；考察葡萄糖和戊糖的转运蛋白，并对其各自转运系统进行研究，进一步解析葡萄糖对戊糖利用的抑制作用，研究如何解除抑制的方法，为进一步提高戊糖的利用效率提供理论支撑；开展转录组学分析、代谢控制分析和代谢流向分

析，研究菌株的代谢途径、代谢节点以及各种调节机制的变化，加深对戊糖代谢调控机理的认识；根据辅酶工程理念，进行分子改造或发酵工程调控，改变辅酶特异性，解决氧化还原不平衡问题；构建高效能的磷酸戊糖途径，使木糖、阿拉伯糖等戊糖代谢的中间产物进入中心代谢途径并向目标代谢产物转化。

2. 微生物遗传操作体系的建立

根据微生物的遗传特性，利用基因工程技术，建立或改进其分子操作体系，为菌株的遗传改造提供高效的技术平台。首先，对已成熟的大肠杆菌和酵母遗传操作体系进行改进，根据Cre/lox位点特异性重组系统的特点，建立适用于酵母等工业菌株的位点特异性系统及规范化操作流程，以去除因分子生物学操作引入基因组中的抗性标记基因；进而建立以不同启动强度的启动子为基础的能够不同水平表达目标基因的表达体系；直接在酵母中表达β-葡萄糖苷酶等纤维降解酶系组分。其次，对遗传操作不成熟的放线杆菌、梭菌等，进行遗传体系的探索与建立，为其代谢工程改造提供技术支撑。

3. 利用进化或系统生物学技术提高相关工程菌的抗逆性能

分析不同预处理条件下纤维素原料水解液中的主要毒性成分及其含量，通过现代分子生物学技术与经典的微生物选育技术相结合，获得对纤维素水解液中抑制因子的高抗性菌株。利用系统性扰动与高通量的分析技术（如各种组学技术），结合代谢网络的定量调控和计算机模拟技术，对菌株抗逆性能机制进行研究。

4. 大宗化学品生产用代谢工程菌的研究和改造

4.1 构建利用纤维降解组分的工程菌，生产大宗平台化合物。选择大肠杆菌、酵母、梭菌、运动单胞菌等作为出发菌株，通过基因操作的手段，运用发酵和代谢工程的技术方法，可控制地生产重要平台化合物。通过对菌体膜运输系统的研究和改造，提高菌体对底物的利用能力，消除二阶段生长现象，使其能够同时利用纤维素水解物中的多种碳源；提高菌体的抗逆及抗不良环境（耐酸和耐抑制物）的能力；以琥珀酸、乙醇等为代表，通过异源表达和代谢阻遏提高菌体合成目标化合物的能力。

4.2 建立利用纤维水解全糖组分的系统或者体系，并注重体系的协同效应和高值转化利用。在大肠杆菌、运动发酵单胞菌等菌株中构建以木糖/阿拉伯糖为唯一碳源的工程菌，并利用工程菌生产乳酸、琥珀酸、聚羟基脂肪酸酯（PHA）、丁醇、氨基酸、木糖醇等。

经费比例：17%

承担单位：南京工业大学、山东大学、中国科学院大连化学物理研究所

课题负责人：姜岷

学术骨干：祁庆生、鲍晓明、何冰芳、蔡恒、谭海东

课题6、木质纤维素降解转化过程强化的工程学原理与方法

研究内容：

1. 产酶、酶解和发酵过程特性与优化控制研究

1.1 产酶、酶解和发酵的反应动力学研究：以降低能耗为目标，通过实验和理论分析，解析上述反应系统中各因素的相互作用关系，采用分层建模方式（由简单到复杂）逐步完善纤维质原料同步糖化发酵生产乙醇过程的动力学模型，并根据敏感性分析，探讨底物中抑制物浓度、底物酶解性能与发酵性能三者之间的定量关系。由动力学模型从理论上分析同步糖化发酵过程的控制策略。

1.2 非均相酶解发酵过程的优化控制：考虑非均相酶解过程的主要特点，包括纤维素原料的特点（结晶度、聚合度、粘度）、纤维质原料对纤维素酶的吸附（特别是木素对纤维素酶的不可逆失活吸附）等酶解性能与发酵性能之间的定量关系，分析温度、酶用量、底物浓度控制策略。对不同反应器规模下的发酵过程进行优化和控制。

1.3纤维素降解转化过程放大的基础研究：针对木质纤维素降解转化过程的特点（极限低水用量、极高固体含量、极低纤维素酶用量与发酵营养等），研究工业化约束条件下的资源节约型过程集成中的基础理论问题和过程放大方法论；高粘度多相流体系的混合与传递过程的数学模拟、生物转化与代谢过程中酶与细胞状态的定量表征与调控、复杂化学反应与酶反应体系的反应网络动力学模型与过程强化；木质纤维素降解产物的直接分离技术以及其它新型节能型分离技术；木质纤维素全组分的物性数据库构建；基于Aspen plus平台上的过程模型化与优化；木质纤维素降解过程全流程集成的Mini-Plant评价系统。

2. 预处理技术、生物反应与分离过程的耦合和集成系统

2.1 适合预处理的物料与联产反应条件：测量底物预处理前后的纤维素、半纤维素、木素含量变化、纤维素结晶度、聚合度变化等参数，研究不同预处理条件下发酵抑制物（乙酸、糠醛、5-羟甲基糠醛等）的生成动力学；研究异质性底

物降解过程中反应的不均一性；研究酶组分耐酸碱性环境、耐毒性物质的适应机理，对其进行定向进化与理性改造；探索针对特定预处理物料的高效酶组分组合的转化产糖系统；并建立潜在的污染评价体系。

2.2 预处理、生化反应和产物分离过程的节能和酶循环利用：为代替传统的高耗能浓缩生物燃料蒸馏法，致力于将有机溶剂和水有效分离的新型材料的基础研究，力图开发省能源、可连续式生产的新型膜分离技术；研究新型酶载体，开发纤维素酶回收技术，通过纤维素酶的再循环利用，降低酶的成本；

2.3 物料的全转化与高值产品的多样化：发展新的过程耦合技术和集成系统；优化预处理--酶解糖化--杂多糖发酵过程，通过高效发酵与代谢流控制产生多种高值化工产品。

经费比例：14%

承担单位：清华大学、华东理工大学

课题负责人：鲍杰

学术骨干：刘德华、张建安、叶蕊芳、程可可

四、年度计划

一、研究内容

围绕三个关键科学问题开展研究工作

（1）纤维素类生物质是如何抗生物降解的：抗生物降解的多层次屏障包括纤维素的结晶结构、纤维素与半纤维素和木素组合形成的异质高聚物、复杂的细胞壁多层结构等。从生物降解转化的角度，来深入研究这一系列抗降解屏障的特性，寻求破解之道，是实现生物质高效转化的基础。

（2）微生物是如何攻击植物的抗降解屏障的：在长期自然进化中，微生物形成了攻击植物生物质抗降解屏障的多酶组分系统代谢策略。深入研究微生物降解木质纤维素的机理、多样性以及酶系合成调控，特别是其攻击纤维素结晶结构的途径，解析降解所需复杂酶系的组成和合成调控，是提高生物催化剂效率的前提。（3）破解抗性屏障和提高转化效率的可能途径；分子和系统生物学研究的快速发展为生物系统的定向设计与改造提供了可能。通过设计和改造微生物及其降解和转化酶系，开展过程导向的酶分子优化改造，结合相关化工技术的研究，探讨利用生物技术和物理、化学手段破解抗降解屏障的新途径，有望集成和设计出新的环境友好、效益可行的生物炼制方案。