人磷脂磷酸水解酶3基因真核表达载体的构建及其对卵巢癌细胞生长的抑制作用

状,当出现梗噎症状时,多为中、晚期,预后极差。作为首诊的基层医院,X线双对比造影对于一些较小的隆起型病变的检出仍存在一定的限度,为了避免漏诊或误诊,放射科医师需要和内镜医师密切合作,在双对比造影高度怀疑早期癌而内镜活检结果阴性者,不可贸然否定对早期癌的诊断,应结合患者的具体情况,建议内镜定点多次反复钳取,包括黏膜下活检,以提高活检准确率。

总之,X线双对比造影和内镜活检结合起来相互印证、相互补充,则诊断的敏感性及准确性高于任何单一的检查方法,基本上可杜绝漏诊、误诊的发生。

参考文献

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(2008202218收稿　责任编辑赵秋民)

人磷脂磷酸水解酶3基因真核表达载体的构建及其对卵巢癌细胞生长的抑制作用3

李留霞1),乔玉环1)#,王　淼2),郭瑞霞1),赵国强3),张孝艳1),周　蔚1),张建好1),赵先兰1)

1)郑州大学第一附属医院妇产科郑州450052　2)厦门市妇幼保健院厦门360000　3)郑州大学微生物学与免疫学教研室郑州450001

#通讯作者,女,1946年生,教授,研究方向:妇科肿瘤

关键词　人磷脂磷酸水解酶3;卵巢癌细胞系;真核表达载体;转染

中图分类号　R737.31

摘要　目的:构建人磷脂磷酸水解酶3(h LPP3)基因的真核表达载体pLenExp ress2h LPP3并转染卵巢癌细胞系SK OV3细胞,初步观察重组表达载体对卵巢癌细胞的转染效率、目的基因表达情况及对卵巢癌细胞生长的影响。

方法:采用RT2PCR法从正常胎盘组织中提取h LPP3基因,先克隆入克隆载体pGE M2T easy质粒得到pGE M2T2

h LPP3,再用Ba mHⅠ和XhoⅠ进行双酶切,切下的h LPP3基因亚克隆入真核表达载体pLenExp ress,得到pLenEx2

p ress2h LPP3重组质粒,采用脂质体转染法转染卵巢癌细胞系SK OV3细胞。实验分为3组:A组为实验组(转染表达hLPP3基因重组质粒)、B组为空质粒对照(转染空表达质粒)、C组为无转染对照。荧光显微镜观察细胞转染效率,实时荧光定量PCR法检测h LPP3mRNA的表达,化学法测定转染前后细胞上清液中溶血磷脂酸(LP A)含量的变化,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况。结果:重组表达质粒经限制性酶切鉴定得到与h LPP3基因长度一致(936bp)的酶切产物,测序分析证实,目的基因序列与Gen Bank上登录的h LPP3基因(BC009196)序列完全一致。

荧光显微镜下见A、B2组SK OV3细胞内有大量绿色荧光信号,转染率分别为67%和69%,C组细胞中无荧光信号。实时荧光定量PCR测定显示A组细胞中h LPP3mRNA的相对表达量较B、C组明显增加(A、B、C组分别为

0.5109±0.0584、0.1499±0.0255、0.1433±0.0181,P<0.05)。A组卵巢癌细胞上清液中的LP A含量较B、C

组明显下降[A、B、C组分别为(2.37±0.76)μmol/L、(6.71±2.03)μmol/L、(6.84±1.49)μmol/L,P<0.05];流式细胞仪检测显示A组卵巢癌细胞凋亡率明显增加[A、B、C组分别为(30.50±2.12)%、(1.26±0.43)%、(0.10±

0.03)%,P<0.05],细胞周期无明显变化。结论:成功构建了表达目的基因h LPP3的重组真核表达载体pLenEx2

p ress2hLPP3,并能高效转染卵巢癌细胞系SK OV3细胞,使细胞中h LPP3基因表达水平明显升高。增强h LPP3基因表达可以降低细胞外LP A水平,诱导细胞凋亡,抑制卵巢癌细胞的生长。

Constructi on of h LPP3eukary otic ex pressi on vect or and its inhibiti on

3国家自然科学基金资助项目　30571948

effect on ovarian cancer cell line

L I L iuxia1),Q I AO Yuhuan1),WAN G M iao2),GUO R u ixia1),ZHAO Guoqiang3),ZHAN G X iaoyan1), ZHOU W ei1),ZHAN G J ianhao1),ZHAO X ianlan1)

1)D epart m ent of Gynecology and O bstetrics,the F irst A ffiliated Hospital,Zhengzhou U n iversity,Zhengzhou 450052　2)W o m en and Children Hospita l of X iam en,X iam en360000　3)D epart m en t of M icrobiology and I mm unology,Zhengzhou U niversity,Z hengzhou450001

Key words　hu man li p id phos phate phos phatase3gene;ovarian cancer cell line;eukaryotic exp ressi on vect or; transfecti on

Abstract　A i m:T o construct an eukaryotic exp ressi on vect or of hu man li p id phos phate phos phatase3gene(h LPP3), pLenExp ress2h LPP3,and transfect it int o ovarian cancer cell line SK OV3.The transfecti on efficacy of the recombinant vec2 t or,the exp ressi on of hLPP3gene in the transfected SK OV3cells and the inhibiti on effect on the gr owth and apop t osis of o2 varian cancer cells were observed.M e tho d s:The h LPP3gene(936bp)was obtained fr om hu man p lacenta tissue by RT2 PCR.The PCR p r oduct was cl oned int o pGE M2T easy vect or,digested by BamHⅠand XhoⅠrestrictive enzy mes,subse2 quently subcl oned int o the pLenExp ress vect or t o f or m a recombinant p las m id pLenExp ress2h LPP3,which was identified by PCR,restrictive enzy me cutting and sequencing.The SK OV3cells were transfected by recombinant vect or with the hel p ing of li p id reagent li pofecta m ine T M2000.There were three gr oup s:gr oup A(the cells were transfected by pLenExp ress2h LPP3), gr oup B(the cells were transfected by blank pLenExp ress)and gr oup C(non2transfecti on cells).The transfecti on efficacy was detected with fluorescentm icr oscope.The exp ressi on of h LPP3mRNA in the transfected cells was detected by Real ti m e quantitative PCR,the LP A level in supernatants of the cells was deter m ined using a bi oche m ical method,and the cell cycle and apop t osis of the cells were measured by fl ow cyt ometry.R e su lts:The recombinant exp ressi on vect or pLenExp ress2 h LPP3was constructed successfully and identified t o be coincided with the sequence of the h LPP3gene in Gen Bank (BC009196)by endonuclease digesti on and sequencing.A l ot of green fluorescent signals were observed under the fluores2 cence m icr oscope in gr oup A and gr oup B,and their positive rates were67%and69%res pectively.W hile no signal in gr oup C.The ex p ressi on of h LPP3mRNA in gr oup A was significantly higher than those in gr oup B and C(gr oup A,B,C were0.5109±0.0584,0.1499±0.0255,0.1433±0.0181,res pectively,P<0.05).The LP A levels in supernatants of gr oup A was l o wer significantly than those in gr oup B and C[gr oup A,B,C were(2.37±0.76)μmol/L,(6.71±2.03)μmol/L and(6.84±1.49)μmol/L,P<0.05].The apop t osis rate in gr oup A was dra matic higher than those in gr oup B and C[gr oup A,B,C were(30.50±2.12)%,(1.26±0.43)%,(0.10±0.03)%,res pectively,P<0.05].Concl usi o n:The reco mbinant eukary otic ex p ressi on vect or pLenEx p ress2h LPP3was constructed successfully,which could be transfected int o the ovarian cancer cell line SK OV3with high efficacy.The elevated ex p ressi on of h LPP3in the SK OV3cells transfected by reco mbinant vect or could p r o mote LP A hydr olizati on,induce cell apop t osis and inhibit ovarian cancer cells gr o wth.

卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一,由于位置深在,缺乏早期症状和体征,75%左右的患者确诊时已属晚期,失去彻底手术机会,化疗又容易产生耐药,5 a存活率约为30%,病死率居妇科恶性肿瘤首位[122]。寻找早期诊断和除手术、化疗、放疗以外的其他有效治疗方法成为卵巢癌研究的关键和热点。近年来研究[324]发现卵巢癌细胞可以分泌溶血磷脂酸(lys ophos phatidic acid,LP A),LP A可促进卵巢癌的发生发展,与卵巢癌的增殖、浸润、转移、化疗耐药等密切相关。人磷脂磷酸水解酶3(li p id phos phate phos phatase3,h LPP3)可以特异性水解LP A,在降低LP A受体功能及LP A信号转导方面也可发挥作用[526]。作者采用逆转录PCR(RT2PCR)技术从胎盘组织中获得hLPP3基因,将其分别克隆和亚克隆到pGE M2T easy克隆载体和pLenExp ress表达载体上,构建表达hLPP3基因的真核表达载体(pLenEx2 p ress2hLPP3),并转染卵巢癌细胞系SK OV3细胞,观察重组表达载体对卵巢癌细胞系SK OV3的转染率、转染后细胞hLPP3mRNA、LP A水平及细胞凋亡情况,初步探讨增强hLPP3基因表达对卵巢癌细胞生长的抑制作用及其机制,为卵巢癌基因治疗寻找新的靶点和方法。

1　材料与方法

1.1　材料　pGE M2T easy克隆载体购自美国Pr o2 mega公司;重组真核表达载体pLenExp ress为美国

华盛顿大学韩志强教授惠赠;Triz ol RNA提取试剂盒、293FT细胞、脂质体L i pofecta m inea m T M2000购于I nvitr ogen公司;RT2PCR逆转录和Realti m e PCR扩增试剂盒、Ba mHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、T4连接酶均购于日本TaKaRa公司;小提质粒试剂盒、快速凝胶回收试剂盒均购于美国Axygen公司;高保真Taq聚合酶、RP M I1640培养基购自美国HyCl one公司;胎牛血清购自美国GI B CO公司;LP A检测试剂盒购自北京泰福仕科技开发有限公司;青链霉素和其余实验所用试剂均为国产分析纯;凝胶成像系统购自美国SY NGE NE公司;PE9600型PCR仪购自美国PE公司;AB I5700型实时荧光定量PCR扩增仪购自美国AB I公司;引物合成和基因测序由上海生工生物工程有限公司完成;人卵巢癌细胞系SK OV3购自北京肿瘤研究所,细胞用含体积分数10%胎牛血清的RP M I1640培养液在37℃含体积分数5% CO2条件下培养。

1.2　重组克隆载体和真核表达载体的构建

根据Gen Bank(编号:BC009196)h LPP3c DNA和选用的质粒pLenExp ress,设计一对带有Ba mHⅠ和XhoⅠ酶切位点的h LPP3全基因引物,内参照采用β2actin,引物序列见表1。

表1　各引物序列及扩增片段长度

引物序列位置扩增片段长度/bp

LPP321正义链5’2TGG ATCCTCCACCATGCAAAACT ACAAGT ACG AC23’3722392936 LPP322反义链52’CCTCG AGCT ACATCATGTTGTGGTG AT23’128821307

β2actin21正义链5’2ATGG ATG ACG AT ATCGCTGC23’812100176

β2actin22反义链5’2ACAT AGG AGTCCTTCTG ACC23’2412222

JC2LPP321正义链5’2CCTCTTCTGCCTCTTCATGG3’4912510250

JC2LPP322反义链5’2CCACGT AGGGGGTTCTG AATC3’7412722

JC:目的基因荧光定量PCR引物

按Triz ol试剂盒操作说明从人正常胎盘组织提取总RNA,用AMV逆转录酶合成c DNA,以c DNA 为模板进行PCR反应。反应循环参数:94℃,预变性3m in;94℃,30s,55℃,30s,72℃,60s,35个循环;72℃,延伸10m in。用凝胶回收试剂盒进行PCR产物的回收。PCR产物回收后为了便于与pGE M2T easy载体连接,先在目的基因上加A(脱氧腺苷酸),在T

4

DNA连接酶的作用下与经Ba mHⅠ和XhoⅠ双酶切后回收的pGE M2T easy载体连接,4℃过夜。转化入J M109感受态细菌并接种培养,挑取白色阳性菌落,用质粒提取试剂盒提取重组质粒,分别用T7、SP6鉴别引物进行PCR鉴定和Ba mHⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将含有正确的hLPP3基因的克隆质粒pGE M2T2h LPP3和表达载体pLenExp ress分

别用Ba mHⅠ和XhoⅠ进行双酶切,回收双黏片段,用T

4

DNA连接酶连接,转化入J M109感受态细菌并接种于含氨苄青霉素的培养板上,利用插入目的基因质粒的氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,用质粒提取试剂盒提取重组质粒,用h LPP3引物进行PCR鉴定及双酶切凝胶鉴定,将鉴定正确的重组子(pLe2 nExp ress2h LPP3)送上海生工生物工程公司测序。1.3　重组表达质粒转染卵巢癌细胞系　用含体积分数10%胎牛血清的RP M I1640在37℃、体积分

数5%CO

2

条件下培养SK OV3细胞,当细胞融合达70%～80%时,用脂质体转染试剂进行转染,转染体系为无血清RP M I1640培养液200μL、脂质体L i po2 fecta m ine T M20001μL、重组质粒pLenExp ress2h LPP3 0.5μg/孔。实验分组:转染重组质粒pLenExp ress2 hLPP3(A组)、转染pLenExp ress空质粒(B组)、未转染细胞(C组)。次日更换全培养液继续培养48 h,荧光显微镜下观察重组真核表达载体的转染效果,如细胞中出现绿色荧光信号,证明重组质粒已转染入SK OV3细胞中。计数阳性细胞,计算转染率。利用G418筛选1周,获得稳定表达hLPP3基因的SK OV3细胞株。

1.4　转染细胞h L PP3基因m RNA的表达　转染后7d分别取A、B、C组SK OV3细胞约5×106个,离心后弃去上清液,细胞沉淀用Triz ol试剂盒按说明书提取细胞总RNA。然后行逆转录反应得到细胞总c DNA。采用嵌合荧光检测法,根据Realti m e PCR试剂盒与扩增仪(AB I5700型)说明,采用50μL反应体系(2×SY BRμPre m ix Ex Taq T M25μL、上游引物JC2LPP3211μL、下游引物JC2LPP3221μL、50×ROX Reference Dye1μL、c DNA溶液4μL、DEPC H2O18μL),95℃预变性180s,95℃20s, 60℃60s,40个循环。用pLenExp ress2hLPP3质粒和β2actin,系列稀释同时扩增产物,制作标准曲线。记录各管扩增CT值,换算出基因拷贝数。以h LPP3基因拷贝数与β2actin基因拷贝数的比值作为hLPP3mRNA的相对表达量。

1.5　细胞上清液L PA测定　采用生化法测定LP A[7]。分别取各组转染前及转染后7d的SK OV3细胞培养上清液各约2mL,按LP A测定试剂盒说明的步骤操作,在722型分光光度仪波长为636nm处比色,测定吸光度(A)值,计算上清液中LP A含量。LP A含量(μmol/L)=6(A样品-A对照)/(A标准-A对照)。

1.6　SKO V 3细胞周期及凋亡检测　取A 、B 、C 组

细胞分别培养于含体积分数2%胎牛血清的RP M I 1640培养液中进行同步化处理,当细胞融合度达50%时,更换为含体积分数10%胎牛血清的RP M I 1640培养。当细胞融合度达80%～90%时制成单细胞悬液,P BS 洗2遍后用体积分数70%乙醇1mL 固定,调整细胞密度为1×106

个mL -1

,加入10mg/L 的碘化丙锭10μL,吹打混匀后,静置30m in,上流式细胞仪测试。图像分析采用Cell Quest 软件,资料用MODF I T 3.0软件分析处理。1.7　统计学处理　采用SPSS 13.0行单因素方差分析,检验水准α=0.05。

2　结果

2.1　h L PP 3基因的PCR 扩增　以逆转录合成的

c DNA 为模板进行PCR 扩增,PCR 产物用15g/L 琼

脂糖凝胶电泳分析,结果在约936bp 处见到一条明

显的DNA 条带,与预期的目的基因片段大小相符,说明已成功扩增了hLPP3基因。见图1

。

图1　h L PP 3目的基因片段PCR 扩增产物

1:h LPP3目的基因片段;M:M arker

2.2　重组克隆载体pGE M 2T 2h L PP 3的PCR 筛选

鉴定　重组克隆载体用鉴定引物扩增后,凝胶电泳显示插入正确的条带位于1112bp 附近,未插入的条带位于200bp 附近(图2)。将3号菌落进行质粒小量提取后用Ba mH Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切电泳鉴定,可见2个条带分别位于3000bp 和936bp,其中936bp 为插入的目的基因条带(图3)。2.3　重组真核表达载体p L enExpress 2h L PP 3鉴定从氨苄阳性LB 平板上随机挑选3个菌落,用目的基因的自身引物LPP321和LPP322进行PCR 扩增后,经琼脂糖凝胶电泳显示有目的基因插入的克隆,特异性条带位于936bp 附近,无目的基因插入的克隆在936bp 处无特异条带,证实泳道1、2的菌落中有目的片段插入(图4)。对泳道2的菌落用Ba mH Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切电泳鉴定,可见2条特异性条带分别位于

8000bp 、936bp 处,其中936bp 的为插入的目的条带(图5),证实泳道2的菌落有目的条带插入。对经PCR 和双酶切鉴定正确的pLenEx p ress 2h LPP3重组质

粒进行序列分析,证明所获得的扩增序列与Gen Bank 中登录的h LPP3基因序列完全一致。2.4　重组表达质粒对卵巢癌细胞SKO V 3的转染率　转染后48h 在荧光显微镜(O ly mpus,日本)下观察,A 组和B 组SK OV3细胞内均可见大量绿色荧光信号,转染率分别为67%和69%,C 组细胞内无绿色荧光信号。2.5　转染SKO V 3细胞中h L PP 3m RNA 的表达　转染后7d A 组细胞中hLPP3mRNA 相对表达量较B 、C 组明显增加(P <0.05)。见表1

。

图5　重组表达载体p L enExpress2h L PP3双酶切鉴定M:M arker;1:pLenExp ress2h LPP3表达质粒;2:pLenExp ress2 h LPP3表达质粒双酶切结果

表1　各组SKO V3细胞中h L PP3m RNA的相对表达量组别n h LPP3mRNA表达量3

A组60.5109±0.0584

B组60.1499±0.0255△

C组60.1433±0.0181△

3F=287.86,P<0.05;与A组比较,△P<0.05

2.6　转染前后SKO V3细胞上清液L PA含量测定A组细胞上清液中LP A含量与B、C组比较差异有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2　转染前后各组

SKO V3细胞上清液L PA含量μmol?L-1

组别n转染前转染后7d3

A组206.51±1.112.37±0.76

B组207.02±1.236.71±2.03

C组206.69±1.556.84±1.49

3F=17.40,P<0.05

2.7　各组细胞周期比例及凋亡率　转染后各组SK OV3细胞生长周期无明显变化(P>0.05),A组细胞凋亡率明显增加,与B、C组比较有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3　各组细胞周期比例及凋亡率变化%

组别n G1期S期G2期凋亡率3

A组675.62±3.5915.59±1.589.78±0.8930.50±2.12 B组678.78±3.8914.54±1.658.38±0.56 1.26±0.43△C组674.59±3.5816.89±0.4810.21±0.340.10±0.03△3F=1106,P<0.05;与A组相比,△P<0.05

3　讨论

LP A是一种活性磷脂,通过与G蛋白偶联受体结合发挥多种生物学效应[8]。LP A可促进卵巢癌细胞增殖、浸润、转移过程中的蛋白酶活化,诱导多种细胞因子表达增加,最终导致癌细胞的转移、扩散,在卵巢癌的发生发展过程中具有重要作用[9]。hLPP3为细胞内的磷酸脂酶超家族的成员,可以直接水解胞外环境中的LP A,也可以通过一些细胞因子抑制LP A的信号转导通路而抑制LP A的作用[5]。Tanvi等[10]发现将转染并表达h LPP3基因的子代细胞同转染前的亲代细胞共培养,能降低亲代细胞形成克隆的能力。Long等[11]研究表明,hLPP3过表达可通过调节细胞内的LP A水平来调控癌细胞的生存和凋亡过程。hLPP3可通过与整合素αvβ3及α5β1结合,抑制碱性成纤维生长因子和血管内皮生长因子的促血管生成作用,抑制肿瘤新生血管网的形成,从而抑制肿瘤细胞的浸润和转移[12]。

作者采用RT2PCR技术从人胎盘中扩增h LPP3基因,通过基因重组技术,分2步将目的基因h LPP3先克隆入克隆载体,再亚克隆入真核表达载体上,成功构建了表达目的基因的真核表达载体(pLenEx2 p ress2h LPP3),通过PCR、双酶切及测序鉴定证明目的基因插入正确。这种分2步的克隆方法成功率高,便于鉴定。

本实验中作者选用的真核表达载体携带有绿色荧光蛋白,转染细胞后易于观察和鉴定。重组表达载体对SK OV3细胞的转染率达65%,与空载体转染效率接近,说明目的基因的插入不影响质粒对细胞的转染能力。转染后的SK OV3细胞内h LPP3 mRNA表达增加,细胞上清液LP A含量下降,表明作者构建的重组质粒不仅能较高效转染卵巢癌细胞,而且能稳定表达插入的h LPP3基因功能,发挥对LP A的水解和功能抑制作用,从而诱导肿瘤细胞的凋亡,抑制卵巢癌细胞生长。本研究为探讨hLPP3在卵巢癌发生发展中的作用及其机制奠定了实验基础,也为临床上卵巢癌的基因治疗提供了一个新的思路。

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(2008203212收稿　责任编辑徐春燕)

3教育部“十五”211工程重点建设项目　肿瘤与生物工程(教重办(2002)第2号)

He La 细胞系中核转录因子2κB 与Bcl 22的表达

3

田卫红1)

,田　芳

2,3)

,许培荣3),刘红涛3),薛乐勋

3)#

1)安阳市肿瘤医院妇科安阳455000　2)郑州大学基础医学院病理生理学教研室郑州450001　3)郑州大学细胞生物学研

究室郑州450052

#通讯作者,男,1944年生,教授,研究方向:肿瘤与生物工程,E 2mail:xuelx@https://www.360docs.net/doc/0f15645267.html,

关键词　HeLa229细胞株;核转录因子2κB;Bcl 22 中图分类号　R737.33

摘要　目的:分析宫颈鳞癌He La229细胞中核转录因子(NF 2κB )的激活状态及其与抗凋亡基因Bcl 22表达的相关性。方法:采用免疫细胞化学法和W estern B l ot 法检测宫颈鳞癌He La229细胞中NF 2κB 亚单位p50和p65及其下游调控基因Bcl 22的蛋白表达,RT 2PCR 法检测宫颈鳞癌HeLa229细胞中p50和p65mRNA 的表达。E MS A 法检测He La229细胞核中NF 2κB 与DNA 的结合活性。结果:宫颈鳞癌He La229细胞质中NF 2κB 的亚单位p50和p65均有表达,p50/p65在细胞核中具有较高的DNA 结合活性。RT 2PCR 结果表明,p50和p65的mRNA 在细胞质中也存在表达,并且在He La229细胞中也检测到Bcl 22蛋白的表达。结论:在宫颈鳞癌He La229细胞中存在有NF 2κB 及其下游基因Bcl 22的表达,提示激活的NF 2κB 信号通路可能在宫颈鳞癌发生发展及抗凋亡中起重要作用。

Correlati on bet w een nuclear fact or 2kappa B and Bcl 22in cervical cancer cell cervical carcino ma

TI AN W eihong 1)

,T I AN Fang

2,3)

,XU Peirong 3),L I U Hongtao 3),XU E L exun

3)

1)D epart m ent of Gynecology,A nyang Tum or Hospital,A nyang 455000　2)D epart m ent of Pathophysiolo 2gy,College of B asic M edical Sciences,Zhengzhou U niversity,Zhengzhou 450001　3)L abora tory for Cell