D-虫荧光素钠盐
D-虫荧光素钠盐[D-Luciferin,sodium salt]
货号：D9390
保存：-20℃干燥避光保存，有效期一年。
CAS#：103404-75-7
英文名：D-Luciferin,sodium salt
分子式：C11H7N2NaO3S2
分子量：302.30
性质：
1.外观：黄色粉末
2.纯度：≥99%(HPLC)
3.产品描述：
D-虫荧光素(D-Luciferin)是萤火虫荧光素酶底物，其量子效率为0.88，是Luminol的20倍。反应原理：首先，在镁离子存在下荧光素酶使荧光素与ATP反应，接着它被氧化形成二氧杂环丁烷结构并发出黄绿色的光。Luciferin-luciferase发光用于ATP监控以测定细胞活力以及细菌计数。它还用于报告基因检测。可与小动物活体成像系统配套使用，用于标记LUC基因后的体内活体荧光检测。
4.应用
(1)体外分析
(2)活体成像分析
(3)高灵敏度ATP分析
使用方法
1.活体成像分析方法
(1)用DPBS(w/o Mg2+、Ca2+)配置D-Luciferin工作液(15mg/mL)*，0.2μm滤膜无菌过滤。
(2)注射量：10μL/g的体重，如10g重小鼠，注射100μL工作液(1.5mg D-Luciferin)。
(3)腹腔注射10～15分钟后，上机进行图像分析。
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2.体外分析方法
(1)用无菌水配置200×的D-Luciferin储备液(30mg/mL)*，立即使用，或-20℃保存。
(2)用预热好的完全培养基1∶200稀释D-Luciferin储备液，配置工作液(150μg/mL)。
(3)去除培养细胞的培养基。
(4)进行图像分析前，向细胞中添加1×的D-Luciferin工作液，进行图像分析**。
*：溶解D-Luciferin时要完全。
**：在图像分析前，将细胞进行37℃的短时间培养可以增加信号强度。
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几种常见荧光素极其特性介绍
几种常见荧光素极其特性介绍 荧光素（英语：Fluorescein，又称为荧光黄）是一种合成有机化合物，它是具有光致荧光特性的染料，外观为暗橙色/红色粉末，可溶于乙醇，微溶于水，在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光。荧光染料种类很多，目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明，酶作用后产生荧光的物质。目前荧光素广发应用在免疫荧光、免疫荧光染色实验中。 下面介绍几种常用荧光素及其基本生物学特性： 1、异硫氰酸荧光素，简称“FITC”。是一种小分子荧光素，其效率取决于于溶液的pH 值，因此，在使用FITC时应注意溶液的酸碱度。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。 FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 2、藻红蛋白，简称“PE”。相对分子质量较大，约为240kD，最大吸收峰为564nm，当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm，故可能会对其它大探针产生空间位阻。 但PE的化学结构非常稳定，有很高的荧光效率，并易与抗体分子结合。需要注意的是PE作为天然染料，因来源不同可能造成荧光素结构上的微小差别，导致其特征的不一致。 3、PI和EB。两者都具有嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中并与碱基对结合的特异性。为了获得特异的DNA分布，染色前必须用RNA酶处理细胞，排除双链RNA的干扰。 PI和EB不能进入完整的细胞膜，因此，又可以用于检测死活细胞。PI和EB各种理化性质相似，但PI比EB的发射光光谱峰向长波方向移动，因而在做DNA和蛋白质双参数测量时，PI的红色荧光和FITC的绿色荧光更易于区分和测量。另外，PI比EB测得的DNA 分布的变异系统（CV值）低，所以PI得到更广泛的应用。
荧光素酶常见问题与解答
1) 什么是双荧光素酶报告基因测试系统（DLR） DLR 测试系统灵敏，方便，在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶 (Renilla reniformis) ，DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。 2) 有哪些海肾荧光素酶载体 海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。这类载体还有T7启动子，可用 T7RNA 聚合物在体外合成海肾荧光素酶，有4个不同的载体： pRL-SV40 载体 pRL-SV40 载体含 SV40 增强子及早期启动子区域，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。 pRL-SV40 载体还含有 SV40 的复制起始区，可在表达 SV40 大 T 抗原的细胞中，如 COS-1 ， COS-7 细胞中，瞬时及附加体似地复制。 pRL-CMV 载体 pRL-CMV 载体含有 CMV 极早增强子及启动子，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。 pRL-TK 载体 pRL-TK 载体含 HSV 胞嘧啶激酶启动子区域，在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。pRL-null 载体 pRL-null 载体缺真核启动子及增强子，在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。 3) 用双报告基因有何优点 一般地说，实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而另一个报告基因作为内对照，以提供实验报告基因测试的归一化。将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化减弱实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。
荧光素酶报告基因实验自我总结
荧光素酶报告基因实验自我总结 实验原理： 目前由两个主要的应用方向： 第一是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用，转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase Assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。 第二是研究微小RNA(microRNA)对于靶基因的调控，通过生物信息学方法预测microRNA潜在的靶基因以及干预位点序列，并设计合适的microRNA质粒或干预片段，同时构建靶基因的报告基因质粒，二者同时转染细胞，这是确定microRNA是否能影响（上调或下调）靶基因的首选研究方法。 实验流程： 1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic（转录因子与靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase质粒（微小RNA与靶基因）2）将要检测的转录因子表达质粒（或microRNA质粒）与报告基因质粒共转染293细胞或目的细胞。如果此转录因子（或microRNA）能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。 3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光素，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。 实验目的：研究转录因子和MicRNA对于靶基因调控的首先方法 实验步骤： （1）用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。 （2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒中。 （3）筛选阳性克隆，测序，扩增克隆并提纯质粒备用。 （4）扩增转录因子质粒（或microRNA质粒），提纯备用，同时准备相应的空载质粒对照。（5）培养293细胞（或其它目的细胞），并接种于12孔板中，生长24小时（80%汇合度）。（6）将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。 （7）用适当的方法提取蛋白并用于荧光素酶检测。 （8）加入酶作用底物，于荧光计数仪上测定荧光素酶的活性。 （9）计算相对荧光强度，并与空载对照比较，判断影响因子是否有效的作用于靶基因。
异硫氰酸荧光素_牛血清白蛋白标记物的化学发光反应
异硫氰酸荧光素2牛血清白蛋白标记物的化学发光反应 黄春保 *1 慈云祥2 常文保21(黄冈师范学院化学系,黄州438000) 2(北京大学化学与分子工程学院,北京100871) 摘 要 采用反相流动注射法,系统地研究了碱性介质中和阳离子在表面活性剂C TM AB 存在下,N aClO 氧化 异硫氰酸荧光素2牛血清白蛋白标记物的化学发光行为和化学发光反应的条件,提出了反相流动注射化学发 光测定牛血清白蛋白的新方法。该法测定牛血清白蛋白线性范围为0.08~16mg P L;检出限为0.032mg P L 。讨 论了蛋白质标记物化学发光增强作用的原因。 关键词 异硫氰酸荧光素,牛血清白蛋白,化学发光反应,流动注射法 2001205217收稿;2001211226接受 1 引 言 蛋白质测定在临床医学和生命科学研究中具有重要意义。这方面的研究引起了人们的广泛重视。近年来,常见蛋白质测定方法的报道,其中大多是利用蛋白质与生色探针的结合作用,生成有色复合物后以分光光度法测定[1~3],少数是将蛋白质用卟吩、四环素等荧光探针标记后,用荧光光度法测定 [4,5],也见有蛋白质电分析方法的报道[6]。这些方法在临床检测和生化分析中具有一定的应用价值。 研究发现,在碱性条件下,选用某些氧化剂氧化异硫氰酸荧光素(FI TC),能产生化学发光,但强度很弱。若在碱性介质中,将异硫氰酸荧光素标记到蛋白质分子上,生成的蛋白质标记物则更易于氧化,不仅化学发光能力极大增强,而且发光强度与蛋白质的含量呈良好的线性关系。本文采用反相流动注射方法,研究了碱性介质中,次氯酸钠氧化异硫氰酸荧光素2牛血清白蛋白(B SA)标记物的化学发光行为、反应条件和阳离子表面活性剂的增敏作用,提出了反相流动注射化学发光测定牛血清白蛋白的新方法。体系的发光强度与B SA 的含量在0.08~16mg P L 范围内呈良好的线性关系;检测限为0.032mg P L 。由于采用反相流动注射进样方式,消除了样品背景干扰,故方法的灵敏度高,且稳定性好。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 GD 21型微光测量仪(西北有色地质研究所);LP 21型蠕动泵(北京东方仪器设备公司);自动平衡记录仪(上海大华仪表厂);821型pH 计(中山大学)。 BSA(A.R.,Sigma 公司)。FITC 溶液(1g P L):称取50mg FI TC(第三军医大学朝晖制药厂),用5mL 0.5mol P L 碳酸盐缓冲溶液和少量水使其溶解后转入50mL 容量瓶中定容。9.0@10 -2mol P L NaClO 溶液(pH=9.5):移取1.5mol P L NaClO 溶液,适当稀释,用HCl 调节溶液酸度至pH =915(酸度计测量),然后定容,该溶液在使用前配制。8.0@10-4mol P L C TM AB 溶液;0.5mol P L NaHCO 32Na 2CO 3缓冲溶液(pH= 9.5)。所用试剂均为分析纯,用二次蒸馏水配制溶液。 2.2 实验方法 2.2.1 FITC 2BSA 标记物的制备与分离 准确称取40mg B SA 置于比色管中,依次加入1.5mL 水,0.5mL 碳酸盐缓冲溶液,摇匀后缓慢滴加1mL FI TC 溶液,混合均匀后置于冰箱(4e )中反应12h 。用G 225色谱柱分离游离的FI TC 。收集FI TC 2BS A 标记物并定容20mL 。该液准确稀释250倍后用于化学发光体系的条件实验。 2.2.2 测定方法 采用反相流动注射法。测定装置流程和抽取试液速度、试液混合顺序如图1所示。NaClO 溶液通过旋转六通阀注入,每次注射体积为100L L 。试液在流动过程中混合,并立即流进发光仪第30卷 2002年4月 分析化学(FE NXI HUA X UE) 研究简报 Chinese Journal o f Analytical Chemistry 第4期 447~449
荧光素酶报告基因检测
荧光素酶报告基因检测 ●原则 荧光素酶检测系统，可用裂解液来温和而快速地提取真核细胞中的荧光素酶，用其底物来检测荧光素酶活性。检测步骤如下： 1)加裂解缓冲液裂解转染的细胞。 2)将上述裂解物转移入微孔板或者试管中（根据检测的需要选择所用器材类型）。 3)加入含有所有酶反应成分（必须包括底物荧光素），使化学发光反应开始。 4)用荧光仪或者液闪计数仪检测所发射的荧光。 ●特点 ◆敏感度和检测范围：5 fg荧光素酶 ◆发射光的线性范围：10 fg—10 ng ◆确切的检测限依检测仪器而定。 ◆特异性：本文介绍的荧光素酶报告基因系统的操作步骤，通常用来检测转染了萤火虫荧光素酶 基因的真核细胞中荧光素酶表达的活性。不适用于对细菌荧光素酶进行检测。 ●器材和试剂 ◆器材 在微孔板或试管中，用自动或手动荧光仪、液闪计数仪或者摄影胶片都可以检测到荧光素酶活性，而且高度敏感。当用微孔板时可以是白色，也可为黑色。 ◆试剂 1)荧光素酶检测试剂：荧光素酶检测试剂包括荧光素、ATP、CoA、以及一些添加剂，这些 试剂可以启动酶反应。这种荧光酶检测试剂的混合物可稳定保存在在-60℃以下12个月，- 15℃~- 25℃一个月，2℃~8℃只能保存一周。避免反复冻融。应避光保存，因为荧光素在 光照下会发生氧化。 2)裂解缓冲液：下面将加以介绍。 ●基本操作步骤 下面的操作步骤适用于培养的真核细胞。提取物必须立刻检测，否则必须在-15～-25℃储存大约一个月。不要反复冻融以避免酶活性的降低。 1)将荧光素酶报告基因与β-gal对细胞进行共转染，按实验计划进行处理。 2)彻底吸去培养皿（60mm）中的细胞培养液，用冰预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，无钙和镁离子） 小心冲洗细胞3次，彻底去除剩余的PBS。10×PBS缓冲液：NaCl 100g，KCl 2.5g，Na2HPO4 14.4g，KH2PO42.5g，用三蒸水定容至1000 ml。 3)加入最小体积的Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液盖过细胞，例如60 mm的培养皿用360 μl裂 解液，35毫米的培养板用150 μl裂解液。用橡皮刮将细胞刮离培养皿。将裂解物转移到微量离 心管中。Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液：1%（v/v）Triton X-100，25mmol/L甘氨酰甘氨酸（p H7.8），15mmol/L MgSO4，4mmol/L EGTA，1mmol/L DTT（临用前加入） 4)在漩涡混合器上轻轻振荡细胞裂解液，以最大速度4℃离心以去除细胞碎片。将上清转移到另 一个微量离心管中，置于冰上以备分析。 5)在开始化学发光反应之前，将100 μl的细胞提取物转移到荧光仪或者液闪计数仪所用的检测 器皿中（我们建议用96孔板）。加入360 μl荧光素酶分析缓冲液。荧光素酶分析缓冲液：25m
汉恒生物 荧光素酶实验原理
汉恒生物 荧光素酶检测服务 汉恒生物科技（上海）有限公司 地址：上海浦东新区蔡伦路150号1号楼
psiCHECK2---miRN A与其靶点相关分析,包括miRNA靶基因验证(参考案例二A和B)、lncRNA (参考案例三)与circRNA (参考案例四)吸附miRNA 验证等。需要把miRNA 潜在结合靶点克隆到R-Luciferase (hRLuc) 3’UTR区域，然后与待测miRNA共同转染细胞内测定R-Luciferase活性高低，F-Luciferase （hLuc+）作为校正内参校正不同样品之间转染的转染效率。 pGL3-Basic---用于转录因子结合位点与启动子活性分析。把待分析启动子区段构建到F-Luciferase上游，和转录因子共转染分析F-Luciferase活性即可反应启动子的活性高低。该质粒通常需要结合持续性表达R-Luciferase的载体作为内参以校正不同样品之间转染的转染效率(参考案例一)。 两种常用载体类型极其应用场景 技术线路 学术、技术团队根据顶级学术论文真实案例协助方案设计 根据实验目的确定设计方案 采用汉恒HB-Infusion TM 无缝克隆策略，提高载体构建效率 根据实验目的确定设计方案 独家定制的转染试剂和病毒转导 系统确保基因转导效率 根据实验目的确定设计方案 顶级商品化检测试剂盒和强大高 效的检测仪器 根据实验目的确定设计方案 详实的原始数据，细致的结果分 析，清晰的实验结论 根据实验目的确定设计方案
LncRNA转录因子结合位点与启动子活性分析 论文来源: Wang, P ., et al. (2014). "The STAT3-binding long noncoding RNA lnc-DC controls human dendritic cell differentiation." Science 344(6181): 310-313. 本文是曹雪涛实验室在2014年发表在Science上一篇研究性论文。作者通过芯片鉴定出DC (树突状细胞)发育相关的一个lncRNA，命名为lnc-DC。同时高通量测序也发现了这条差异lncRNA的存在。进而作者通过Northern Blot验证了这条lnc-DC。由于lnc-DC极其特异和稳定地高表达在DC发育过程的某一时期，所以作者假设lnc-DC可能是和表观遗传学调控事件相关的。为了验证这一假设，作者通过染色体免疫沉淀结合测序的技术-CHIP-seq和qPCR发现lnc-DC的转录起始位点（TSS）附近富集了Pol II、H3K4me3和H3K27ac等蛋白（下图A），提示DC发育过程中表观遗传学变化与lnc-DC的转录增强事件相对应。进而作者通过序列分析发现在lnc-DC的转录起始位点附近（+44-+50）存在一个经典的PU.1结合位点。作者假设PU.1参与了lnc-DC的特异性表达。于是作者设计了如下实验进行了进一步的验证（下图B）。 作者把lnc-DC的启动子区段（-1447-+223）及其不同的突变体版本分别克隆到F-Luciferase表达框上游，然后和转录因子PU.1表达质粒或者空载体（Vector）共同转染到模式细胞系HEK-293T，通过测量荧光强度的变化间接反应转录活性的高低。最终证明转录因子PU.1通过经典结合位点（+44-+50）介导了lnc-DC在DC发育过程中的特异表达。 LncRNA通过吸附miRNA调控靶基因mRNA的表达 (ceRNA) 论文来源: Cesana, M., et al. (2011). "A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA." Cell 147(2): 358-369. 作者通过表达分析发现了一条肌肉发育相关的lncRNA---lnc-MD1.前期功能研究发现lnc-MD1可以调控肌肉分化的时间。信息学分析发现这条肌肉特异的lncRNA上包含36个miRNA的结合位点。如果只考虑肌肉发育相关的miRNA和基因，36个候选miRNA里面只剩下miR-133和miR-135。作者通过荧光素酶实验进行了验证。首先作者把野生型及其缺失miR-133和miR-135结合位点的Lnc-DC1克隆到进R-Luc的3’UTR，然后分别与表达miR-133和miR-135前体的质粒共同转染到细胞进行荧光素酶活性检测（下图A和B）。证明lnc-MD1缺失存在miR-133和miR-135的结合位点。 进一步的信息学预测，miR-133和miR-135分别靶向两个基因- MAML1 和 MEF2C。同样，作者还是通过荧光素酶实验进行验证。研究者把MAML1 和 MEF2C的3’UTR （WT）和miRNA结合位点缺失突变体（-mut）分别克隆在RLuc表达框的下游，然后和miRNA过表达载体共转染细胞进行酶活测定。结果显示miR-133和miR-135确实分别靶向了MAML1 和 MEF2C两个基因（下图C）。最后的模型是lnc-MD1通过ceRNA机制吸 附miR-133和135，正向调控了MAML1 和 MEF2C的表达，参与调控肌肉发育。 经典应用案例二
主要荧光素一览表
（1）荧光素类 Fluorescein 标准荧光素（Reference standard）之一,在其基础上进行结构改造,可产生一系列荧光素衍生物。 Fluorescein适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。 与其他荧光素类衍生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。 主要应用于聚焦激光扫描微阵列（Confocal laser scanning microscopy）和流式细胞计应用（Flow cytometry）。 FITC 异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate，是荧光素衍生物的一种，5-FITC较6-FITC更经常使用。 FITC的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/519nm（pH=）。与蛋白的结合力也强。 FITC具有荧光素衍生物的普遍特性。在水中易变坏，不能长久保存。 FITC-Oligo 广泛用于杂交探针；FITC-多肽用于Edman降解蛋白测序；FITC也经常被用于蛋白电泳检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。 FAM 羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。 Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester，即5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。 与FITC相比，FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。 FAM也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。 5-FAM主要应用于DNA自动测序中，标记其中的d/ddCTP（PE公司），也经常用于PCR产物定量，核酸探针等。
荧光素酶报告实验
荧光素酶报告实验 1 扩增目的片段 扩增包含靶基因与miRNA互补位点的3’UTR序列以及mutant序列，上下游引物5’端各含有不同的酶切位点和保护碱基（如Pme I，Spe I）；电泳检测目的条带，看大小是否正确，然后用试剂盒纯化PCR产物备用。主要采用了2 种方法进行序列突变及扩增，如下图所示：第一种方法： 第二种方法： 1.2 取1-2 μg纯化的目的片段或pMIR-REPORT载体，按酶切反应体系配制混合液进行酶切（加0.01% BSA），酶切3h后，80℃灭活5 min，冰上降温。酶切产物进行胶回收。
酶切体系连接体系Component V olume (μl) Component V olume (μl) H2O 16-x H2O 8-m-n Vector or DNA x Vector m NEB Buffer I或IV 2 DNA n Spe I 1 10×T4 Ligase Buffer 1 Pme I 1 T4 DNA Ligase 1 Total voloume 20 Total voloume 10 1.3 配制连接反应混合液（DNA和Plasmid的molar ratio为3:1到6:1），16℃连接过夜或室温连接10 min。连接完毕后，将连接产物转化入感受态大肠杆菌（热激法）。Amp（100 μg/ml）抗性培养板筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定目的片段，送3个样本测序，提取质粒酶切鉴定等。并扩繁阳性克隆。重组Luc-3’UTR 质粒主要元件和组成如下图所示（重组Luc-3’UTR-Mut 原理相同）： pLuc-MET 3'UTR 荧光素酶报告基因载体的构建 4.接种对数生长期的HEK293细胞（10% FBS+90% DMEM培养）于96孔板，3×103个/孔，每个实验组设置6个复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养24h； 5.根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，配制转染液，转染HEK293细胞； A 液B液 pLuc-3’UTR 0.1 μg Lipofectamine 2000 0.5 μl pRL-SV40 0.05 μg OPTI-MEM 25 μl Mimic/NC 100 nM终浓度 OPTI-MEM 25 μl 6 转染48 h后，吸除96孔板中的培养液，用ddH2O稀释Passive Lysis Buffer至1×浓度，在96孔板中加入1×Passive Lysis Buffer，20 μl/孔，用移液枪反复吸打裂解细胞； 7 在白色不透明的96孔板中加入100 μl/孔的Luciferase Assay Substrate； 8 从每孔裂解好的细胞悬液中吸出11.5 μl加入Luciferase Assay Substrate中混匀； 9 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据； 10 用Stop & Glo? Buffer稀释Stop & Glo? Substrate至1×使用浓度； 11 在第7步完成后，加入Stop & Glo? Substrate 100 μl/孔，混匀； 12 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据，两次测得数据的比值代表各孔样本的相对荧光强度。
双荧光素酶报告基因
启动子活性分析（双荧光素酶报告基因实验） 一、实验目的：分析启动子活性 二、实验原理：荧光素酶报告基因的活性用Dual-Luciferase?Reporter Assay System（Promega）试剂盒来检测。利用单通道多标记荧光检测仪测定荧 光素酶活性。在双荧光素酶系统中，除了用于检测启动子活性的萤火虫 荧光素酶外，另外一种组成型表达的Renilla荧光素酶质粒PRL-TK也被 同时转染入细胞内作为内参。 三、实验材料：Dual-Luciferase?Reporter Assay System（Promega）试剂盒， PBS，细胞裂解液，96孔， 四、实验设备：单通道多标记荧光检测仪 五、实验方法及步骤： 1）启动子萤光素酶报告载体与共转染质粒按照质量等比例、总量0.8μg的原则转染细胞，36h后收获细胞； 2）96孔板吸弃细胞培养基，PBS冲洗细胞一次，加入1×PLB细胞裂解液20μl，置于室温震荡裂解20min； 3）轻轻吹打细胞，取10μl细胞裂解液加入50μl Luciferase Assay Reagent，轻轻震荡混匀，立刻置于单通道多标记荧光检测仪中测定Firefly Luciferase活性； 4）读数后立即加入50μl Stop & Glo?Reagent轻轻震荡混匀，读取Renilla Luciferase活性； 5）所得的结果为各个实验样品的Firefly Luciferase活性与Renilla荧光素酶活性的比值。每个实验组重复3-4孔，整个实验独立重复3次。实验结 果均为3次独立的实验结果的平均值。所有的结果均以平均值±标准差 (mean±S.D.)表示。 六、注意事项 1.做好对照。 2.多做几个复孔，求平均值。 七、补充知识点 双荧光素酶报告基因实验
常见荧光素
常见荧光素： （1）异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 （2）四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。 （3）四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。（4）镧系：镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。 （5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。 （6）多甲藻叶绿素蛋白（peridinin chlorophyll protein，PerCP）：PerCP 是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为 35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。 （7）碘化丙啶（ propidium iodide，PI）：可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA
双荧光素酶检测原理和方法总结
miRNA靶基因验证 实验原理： 哺乳动物中不含内源性荧光素酶，转录完成后生成有功能性的荧光素酶，其光产物具有交到的量子效率，检测灵敏度高，已被广泛应用于miRNA靶基因检测。 一般截取mRNA 3’UTR（野生型、突变型）区域100bp 长度构建到荧光素酶质粒上 实验方法： 1.质粒构建 预测mRNA与miRNA的结合位点后，截取结合位点前后100bp长度构建到pmirGLO 载体上，同时构建结合区域突变载体，如：pmirGLO-mRNA-3’UTR、pmirGLO-mut-mRNA-3’UTR 2.合成miRNA mimics 及NC对照； 3.细胞转染, 细胞分组：（1）pmirGLO-mRNA-3’UTR + miRNA mimics （2）pmirGLO-mRNA-3’UTR + miRNA mimics NC （3）pmirGLO-mut-mRNA-3’UTR + miRNA mimics （4）pmirGLO-mut-mRNA-3’UTR + miRNA mimics NC 4.化学发光检测细胞Luciferase表达活性； 5.数据分析。
操作流程： 1、细胞培养和转染 1)将指数期细胞传到孔板中，转染时细胞密度约为70%； 2)根据转染的孔的大小，按照一定比例混匀质粒； 3)取一个新的1.5ml离心管，加入lipofectamine 2000和Opti-MEM，轻轻混匀后室 温静置5min； 4)将4中的混合液加入3的EP管中，混匀； 5)室温静置20min，将lipofectamine 2000-质粒混合液滴到孔板中； 6)4h后换回含血清的完全培养基。 2、Luciferase活性检测 1)取出细胞，室温下吸去培养基，1xPBS洗一遍，每孔加入100ul 1×passive lysis buffer。 2)把孔板放在摇床上摇15min，转移到EP管中用于后续实验或储存。 3)准备好底物，将LAR II 从-80℃中取出解冻；Stop and Glo：把50×Stop and Glo substrate 用Stop and Glo buffer 配成1×；避光放置。 4)把细胞裂解液转移到标记好EP管中，瞬时离心； 5)标记好测量管，每管加入适量细胞裂解液； 6)按说明书设置程序； 7)每测量管加入100ul LAR II溶液，快速混匀，测量； 8)每测量管加入100ul Stop and Glo溶液，快速混匀，测量；
荧光素FITC标记抗体的方法
荧光素FITC标记抗体的方法 当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下 FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 1．Marsshall法 (1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光 素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。 (2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为
20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。 ②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。 a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。 b．总蛋白量(AXB)＝Crag。 c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。 d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。 e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。 f．PBS量D-(B+F)=Gml。 注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。 ③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，
异硫氰酸荧光素-溶菌酶的制备及晶体生长预研究.
2005年第63卷化学学报V ol. 63, 2005第7期, 559～561 ACTA CHIMICA SINICA No. 7, 559～561 * E-mail: dspr@https://www.360docs.net/doc/0915715822.html, Received June 30, 2004; revised November 16, 2004; accepted December 5, 2004. 国家自然科学基金(No. 30270302)和中国科学院知识创新工程基金(No. KSCX2-SW-L05)资助项目.
560 化 学 学 报 V ol. 63, 2005 分利用我们实验室已有的LSCM 这一研究晶体生长的有力工具, 本文采用了常用蛋白质——溶菌酶作为研究对象并对其进行了荧光标记. 在考虑了激发波长和发射波长范围后, 我们选择了异硫氰酸荧光素(FITC)作为探针. 另外本文还对标记后的溶菌酶的一些性质进行了研究. 1 实验方法 1.1 仪器与试剂 溶菌酶, Sigma 公司(批号：L6876, 已经三次重结晶, 未进一步处理); 异硫氰酸荧光素, 美国Sigma 公司(批号：F7250); 0.1 mol?L －1 HOAc-NaOAc 缓冲液: pH 4.5; 0.5 mol?L －1二甲砷酸纳缓冲溶液 (CB): pH 9.0; 聚乙二醇 (PEG20000): 分析纯; PD10柱(瑞典Pharmacia 公司, Sephadex G25柱); 紫外分光光度计: 日本HITACHI 公司, UV-2800型; 生化培养箱: 上海一恒科技有限公司, LRH-150型; 荧光光度计: 日本HITACHI 公司, F-2500型; 荧光显微镜: 日本Olympus 公司, BX60F5型. 1.2 荧光标记方法 在碱性条件下FITC 的碳酰胺键可与蛋白质赖氨酸残基的ε氨基共价结合, 在荧光标记后要求它与蛋白质的结合不影响蛋白质原有的生化性质[7]. 本文采用搅拌法标记蛋白质. 将溶菌酶加入到CB 缓冲溶液中, 使浓度为每毫升CB 中含20 mg 溶菌酶, 然后再称取适量FITC 加入到CB 溶液中使浓度为每毫升CB 中含3 mg FITC. 将FITC-CB 溶液逐滴加入到溶菌酶-CB 溶液中, 室温避光搅拌2 h 后用0.1 mol?L －1 NaOAc-HOAc 缓冲液透析过夜. 透析后溶液用PD10柱除去游离FITC, 然后用PEG 20000浓缩, 离心后取上层清液, ―4 ℃保存. 用NaOAc-HOAc 缓冲液洗脱第一个FITC 结合蛋白峰时要测定F (荧光素个数)和P (蛋白质分子个数)的比值, 计算公式如下: 280280495 2.87/0.35A F P A A ×＝ ―× 其中, A 280和A 495分别是280和495 nm 处的吸光度. 结果表明, 每分子溶菌酶上标记的FITC 约为11个. 1.3 紫外-可见吸收光谱和荧光光谱测定 根据FITC-溶菌酶中每分子溶菌酶上标记的FITC 约为11个(F /P ＝11), 用0.1 mol?L －1 HOAc-NaOAc 缓冲液来配制与FITC-溶菌酶含量相同的溶菌酶和FITC 做样品, 以0.1 mol?L －1 HOAc-NaOAc 缓冲溶液做参比. 测量均在室温下进行. 在波长范围200～500 nm 进行紫外-可见光测定. 荧光光谱的测定条件为: 激发波长488 nm; 激发狭缝10 nm; 发射狭缝10 nm. 在浓度为10 mg?mL －1 FITC-溶菌酶溶液中等体积加13%(体积含量)NaCl 的HOAc-NaOAc 溶液(0.1 mol? L －1, pH 4.5), 在20 ℃生化培养箱中批量法生长晶体, 一段时间后可观察到晶体出现. 2 结果与讨论 图1为溶菌酶、FITC 和FITC-溶菌酶的紫外-可见吸收谱图. 从图1中可以看出, FITC 在488 nm 处有吸收峰. 在280 nm 附近, FITC-溶菌酶表现出强的吸收, 并且在此峰附近, 溶菌酶、FITC 都有吸收. FITC 和溶菌酶的吸收谱图之和与FITC-溶菌酶吸收谱图基本吻合, 这说明溶菌酶与FITC 之间通过ε氨基共价结合后, 没有干扰各自的吸收特性 . 图1 溶菌酶、FITC 和FITC-溶菌酶吸收谱图 Figure 1 Absorption spectra of lysozyme, FITC and FITC- lysozyme, and the sum spectrum of lysozyme and FITC 图2是FITC-溶菌酶在激发波长为488 nm 下的荧光发射谱图, 其最大发射峰为518 nm, 与FITC 和溶菌酶最大发射峰相比基本相同. 并且在518 nm 下, FITC-溶菌酶峰强度比FITC 和溶菌酶高, 这说明如果用LSCM 观察, FITC-溶菌酶将得到比FITC 和溶菌酶更灵敏的信号 . 图2 溶菌酶、FITC 和FITC-溶菌酶的荧光发射谱图 Figure 2 Fluorescence emission spectra of lysozyme, FITC and FITC-lysozyme
双萤光素酶报告基因的应用-常见载体及案例简介
双萤光素酶报告基因的应用，常见载体及案例简介双萤光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase Reporter Assay）通常以萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)为报告基因，以海肾萤光素酶(Renilla luciferase)为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势，广泛用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。 Firefly luciferase（简称F-Luc）以萤光素(luciferin)为底物，在Mg2+、ATP和氧分子存在条件下，催化luciferin氧化成oxyluciferin，在此过程中发出最强波长在560nm 左右的生物萤光(bioluminescence)。F-Luc表达框的上游启动子区域插不同功能序列，可以通过转录起始条件造成其报告萤光的变化。在F-Luc的3’UTR区域插入待验证的靶序列，通过其翻译抑制或mRNA稳定性降低，可以反映是否存在靶向互作。 Renilla luciferase（简称R-Luc）以腔肠素（coelenterazine）为底物，在氧分子存在的条件下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide，此过程中发出最强波长在465nm 左右的生物萤光。R-Luc通常由固定组成型启动子驱动，在报告系统中作为校正input误差的内参信号。 生物萤光产生反应式 一、应用方向 1. 验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果萤光素酶活性下降，则提示为其靶序列。 2. 验证microRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测萤光素活性。 3. 启动子结构分析。将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。 4. 启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用萤光素酶报告系统分析其相对活性。
异硫氰酸荧光素FITC
异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 FITC是一种常用的绿色荧光探针。FITC的吸收(激发)和发射峰参见下表。 Fluorophore Absorption Peak(nm) Emission Peak(nm) FITC 492 520 当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 1．Marsshall法 (1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol ／LPBS等。 (2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。 ②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。 a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。 b．总蛋白量(AXB)＝Crag。 c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20) d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。 e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。 f．PBS量D-(B+F)=Gml。 注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。 ③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。 ④透析结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8．0缓冲盐水透析(0～4~C)过夜。 ⑤过柱取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：0．01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．2)；过滤量：12ml标记全球蛋