纤维素酶的生产工艺及分离提纯

纤维素酶的生产工艺及分离提纯

姓名：朱帅帅学号：201404015024 四院三连通信工程摘要：

纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶。由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。是可以将纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质。

关键词：发酵法；盐析法；凝胶过滤；离子交换层析；电泳Abstract：

Cellulase is an important enzyme products, a complex enzyme, mainly by the exo-β-glucanase, endo-β-glucanase and β-glucosidase and other components, there are very high energy Xylanase. Because cellulase has great market potential in the fields of feed, alcohol, textile and food, it has been regarded as the fourth largest industrial enzyme after saccharifying enzyme, amylase and protease, even in China it is entirely possible to become the largest enzyme species, so the enzyme enzyme industry is a new growth point. Is a protein that can decompose cellulose into oligosaccharides or monosaccharides.

Keywords:Fermentation, Salting out, Gel filtration, Ion exchange chromatography, Electrophoresis.

一、纤维素酶的概述

纤维素酶是一种对纤维素大分子的水解具有特殊催化作用的活性蛋白质，它是一组酶的总称，不是单成分酶，而是由多个酶起协同作用的多酶体系。其外观为灰白色的无定形粉末或液体，最适作用温度为40℃~55℃，反应最适PH值为4.0~6.0，在40℃~70℃以下稳定存在，溶于水，几乎不溶于乙醇、乙醚和氯仿等有机溶剂。该酶催化效率高，比一般酶高106~107倍。

自1906年Seillere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶至今已有一百余年了，现在纤维素酶已被广泛应用于食品、酿酒、饲料加工、纺织、洗衣、农业等多个领域[1]。食品方面，纤维素酶被应用于果实和蔬菜加工、油料作物加工、茶叶加工、酒精生产、啤酒生产、食醋酿造、酱油酿造等生产工艺。在饲料工业中，纤维素酶用来制备低纤维饲料、饲料酶制剂、水解植物纤维生产饲料酵母。在纺织工业中，纤维素酶被用于纤维改性，真丝脱胶，染整的退浆、精炼、整理加工等方面。纤维素酶还被用于解决“白色污染”问题。纤维素酶用于造纸工业，利用外切纤维素酶只从末端切断纤维素的作用原理，可以提高纸张的光洁度。[2]

纤维素酶在自然界分布极为广泛，昆虫、软体动物、高等植物、细菌、放线菌和真菌都能产生纤维素酶[3]。反刍动物的瘤胃以及猪大肠也有分解纤维素的细菌存在。纤维素酶的来源主要有三方面：植物、动物和微生物。纤维素酶虽然在植物中广泛存在，且在植物发育的某些阶段发挥着水解细胞壁的作用，如果实成熟、蒂柄脱落等，但

从植物中提取纤维素酶比较困难，且含量不高。很多食木性的动物及食草动物之所以可以以植物为食物来源，主要是因为其体内存在内源性的纤维素酶，但是依靠这类动物来进行工业化大规模生产也比较困难。工业化纤维素酶的生产主要采用微生物来进行。据不完全统计，20世纪60年代以来国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约有53个属的几千个菌种。由于放线菌纤维素酶的产量极低，所以研究很少。细菌纤维素酶产量也不高，主要是葡聚糖内切酶，大多数对结晶纤维素没有降解活性，且所产生的酶是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度，所以工业上很少采用细菌作为生产菌株。目前用于生产纤维素酶的微生物较多的是丝状真菌，其中酶活力较强的菌种为木霉、曲霉、根霉和青霉，以木霉属菌种居多，较为典型的有里氏木霉、绿色木霉、康氏、木霉。

二、纤维素酶的生产方法

1、固体发酵法

固体发酵法以玉米、稻草等植物秸秆为主要原料生产纤维素酶。该法投资少，工艺简单，产品价格低廉。然而固体发酵法存在着根本上的缺陷——不可能像液体发酵那样随着规模的扩大，大幅度降低成本。以秸秆为原料的固体发酵法生产的纤维素酶很难提取和精制。目前生产厂家只能采用直接干燥、粉碎来得到固体酶制剂，或用水浸泡后压滤得到液体酶制剂，产品外观粗糙，质量不稳定，杂质含量高；劳动强度大、生产效率低；易污染杂菌。国内外对木霉纤维素酶的研究较多，但木霉一方面毒性大，使之应用受到限制；另一方面普遍存

在着β-葡萄糖昔酶活力偏低的缺陷，致使纤维二糖积累，影响了酶解效率。

2、液体发酵法

液体发酵生产时，将原料送入发酵罐内发酵，同时接入纤维素酶菌种。发酵过程中，需要从发酵罐底部通入无菌空气对物料进行气流搅拌，发酵完后的物料经过处理可得到纤维素酶产品。液体发酵法生产纤维素酶，原料利用率高，生产条件易控制、产量高、劳动强度小、产品质量稳定，但动力消耗大，设备要求高。液体深层发酵的方法具有培养条件容易控制，不易染菌，生产效率高等特点。因此，目前此方法是大规模生产的可行方法。其生产工艺过程是将玉米秸秆粉碎至20目以下，进行灭菌处理后，送发酵釜内发酵，同时加入纤维素酶菌种，发酵时间约为70 h，控制温度低于60℃，将净化后的无菌空气从釜底通入，进行物料的气流搅拌，发酵完的物料经压滤机压滤、超滤浓缩、喷雾干燥，制得纤维素酶产品。

三、纤维素酶的分离纯化

纤维素酶的组分大多为糖蛋白，工业上用于生产纤维素酶的粗酶制剂常采用硫酸铵沉淀法、酒精沉淀法、丹宁沉淀法和离心喷雾干燥等方法。但在纤维素酶分析研究上主要采用一系列蛋白质分离纯化技术，如分级沉淀、色谱法、电泳法等。目前，对粗酶的提取大多采用硫酸桉分级沉淀法；对酶活力的测定国际上一般采用Horikoshi方法；对蛋白质的测定按考马斯亮蓝(Bradford)法；还原糖的测定采用３,５一二硝基水杨酸(DNS)法。以下介绍一些常用的纯化方法：

1.盐析法：盐析法就是在溶液中加入中性盐使各种蛋白质依次分别沉淀的方法。其原理是根据蛋白质在溶液中由于表面带电的氨基酸残基与溶剂分子(H20)相互作用，所以能保持溶解状态，当加入盐离子时，蛋白质分子周围所带电荷增加，促进了与溶剂分子的相互作用，使溶解度增加，此现象称为盐溶，在盐浓度较低时以这种情形为主；但当盐浓度继续增加达到一限量，大量盐离子使水浓度相对降低，蛋白质的水化作用减弱，相互凝聚而沉淀下来，称为盐析。选择一定浓度范围的盐(如0～25％饱和度硫酸铵)使杂质蛋白沉淀而有效成分呈盐溶状态，经离心分离得到上清液后，再选择一定浓度范围的盐溶液使有效成分等物质呈盐析状态而另一部分杂质呈盐溶状态，用离心法收集的沉淀物即为初步纯化的有效成分物质。此法是蛋白质进行分级沉淀时常用操作步骤，常选用的盐是硫酸铵。

2.凝胶过滤：凝胶过滤又叫分子筛层析，是利用分子筛效应分离纯化生物大分子和测定其分子量及样品脱盐的一种色谱方法。凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致的球状颗粒。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子物质，而不能排阻某些小分子化合物。当样品进入色谱柱时，由于被分离物质的分子质量不同。较大的分予不能通过孔道进入凝胶颗粒的微孔内部，与流动相一起先流出色谱柱；分子质量小的物质可通过部分孔道，更小的分子可通过任意孔道进入珠体内部。这样小分子向下流动的速度必然比大分子慢，结果是分子质量大的物质先从柱中流出，分子质量小的则后从柱中流出而达到分离的目的。凝胶过滤具有设备简单、操作方便、重复性好

及样品回收率高等特点，所以该方法除了常用于分离纯化蛋白质，核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质外，还可测定蛋白质的分子量、样品浓缩和脱盐等方面。

3.离子交换层析：离子交换层析是根据物质所带电荷的差别进行分离纯化的方法。离子交换剂以纤维素、葡聚糖凝胶等不溶性物质为母体，通过酯化、醚化或氧化等化学反应，引入阳性或阴性离子的特殊制剂，可与带相反电荷的化学物质进行交换吸附。对于呈两性离子的蛋白质、酶类、多肽等物质与离子交换剂的结合力，取决于它们的物理化学性质和特定pH条件下呈现的离子状态。当pH低于等电点(pI)时，被阳离子交换剂吸附；反之被阴离子交换剂吸附。对于呈胶体状态的大分子物质一般使用选择性好的弱酸性离子交换剂。离子交换层析法是常用的层析方法之一，广泛应用于多种生化物质的分析、制备、纯化等。

4.电泳：电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。当把一个带净电荷的颗粒放入电场时，就会受到电场力的作用，带电颗粒在电场中向一定方向泳动，速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和黏度成反比。当颗粒是两性电介质性质的蛋白质分子时，它在一定pH溶液中电荷量是独特的。由于不同的蛋白质等电点和分子量是不同的，因此经泳动后就形成了泳动度不同的区带。利用此性质，可以将混合液中不同的蛋白质区分开，同时也可以对其纯度进行测定。现在电泳法已成为开展生物化学和分子生物学研究的必不可少的常规工具。

参考文献：

[1] 高论江，董全《纤维素酶的研究进展及前景展望》2007，4.

[2] 顾方媛，陈朝银《纤维素酶的研究进展及发展趋势》2008，28

[3] 刘小杰，何国庆《纤维素发酵培养基的优化》2003，37

[4]邱雁临主编《纤维素酶的研究和应用前景》，粮食与饲料科技出版，2001

[5]宋桂经主编《纤维素科学与技术》，广西人学学报出版，2004

[6]俞俊棠主编《生物工艺学》，化学工业出版社，2003

[7]肖春玲主编《微生物纤维素酶的应用研究》，微生物学杂志，2002

A.内容说明：

本文与第四章能量与代谢第二节生物催化剂——酶的内容相关，阐述了纤维素酶的生产工艺及分离提纯。

B.对课程内容和教学方式的意见和建议

我觉得课程内容较多，课时又较少，所以上课速度过快，可以选择一些章节让大家自学，然后着重讲解一些关键的章节。