苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究

上海师范大学

硕士学位论文

苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究

姓名：何小丽

申请学位级别：硕士

专业：微生物学

指导教师：肖明

20090501

上海师范大学硕士学位论文摘要论文题目：苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究

学校专业：微生物学

学位申请人：何小丽

指导教师：肖明

摘要

酚类化合物为细胞原浆毒物，属高毒性物质。这类物质来源广泛，通常污染水源，毒死鱼虾，危害农作物，并严重威胁人类的健康。含酚有机物的毒性还在于其只能被少数的微生物分解。从自然界中筛选分离出能够降解特定污染物的高效菌种，有针对性的投加到已有的污水处理系统中的生物强化技术，能够快速提供大量具有特殊作用的微生物，在有毒有害污染物治理中显示出巨大的潜力。

1、本研究从胜利油田河口采油厂的飞雁滩油田土壤样品中分离得到10株能够利用并降解苯酚的菌株P1-P4、P7、P9-P13。该10株苯酚降解菌能够在以苯酚为唯一碳源和能源的培养基上生长，经16S rDNA分子鉴定和生理生化检测，该10株降酚菌分别被鉴定到属或种。其中降酚菌株P1、P3和P4这3株菌株分别属于劳尔氏菌属(Ralstonia)、贪噬菌属（Variovorax）和节杆菌属（Arthrobacter）里的种。其它7株降酚菌株P

2、P7、P9-P13都属于假单胞菌属（Pseudomonas）里的种。这4个属里的细菌在国内外都已被报道有降解苯酚的特性，其中有关假单胞菌降解环境有机物的报道较多。

2、培养液中的苯酚含量通过4-氨基安替比啉分光光度法测定，通过苯酚降解效率的比较，菌株P2降解苯酚的能力较其它9株菌株要强。于是将菌株P2作为本研究中进一步研究的对象，研究了不同的环境条件下该菌株降解苯酚和菌体生长的情况。

3、通过苯酚羟化酶特异性引物的设计，从菌株P2扩增出苯酚羟化酶大亚基基因，该基因片段编码对苯酚有催化活性的多肽，催化苯酚代谢的第一步反应；表明菌株P2能降解苯酚是由于细胞具有降解苯酚的遗传基础。

I

摘要上海师范大学硕士学位论文关键词：苯酚；生物降解；类产碱假单胞菌；苯酚羟化酶；16S rDNA；水平基因转移（HGT）；

论文类型：a.理论研究

II

上海师范大学硕士学位论文Abstract

Abstract

Phenol is a strongly toxical subsubstance and is very harmful to cytoplasm. Its origin existed wildly in our life. It can pollute water, kill fish, do farm to crops and even heavily threat our health. The phenolic compound can only be degraded by several kinds of microbe. Bacteria that can effectively degrade phenolic compound had been isolated from natural environment, they can be poured into waste water treat system and obviously enhance the effect, therefore, they have extroordinary potential in bioremediation.

1. Ten bacterial strains P1-P4, P7, P9-P13 with phenol-degradating ability were isolated from a site contaminated with petroleum at Feiyan Beach Oilfield near Shengli Oilfield. They grew in basal medium with phenol as sole carbon and energy source. Through 16S ribosomal DNA (16S-rDNA) sequence analysis and determination of physiological and biochemistry parameters these ten strains respectively were classified and identification . The strian P1, P3, P4 belong to species of the genus Ralstonia,Variovorax and Arthrobacter respectively.The strian P2, P7, P9-P13 belong to species of the genus Pseudomonas.

2. Determination of phenol contents in culture medium was finished by spectrophotometric method of 4-aminoantipyrin. Comparing with phenol removal efficiency among these ten strians , strain P2 could degrade phenol better than other nine strains. so we made a further research on strian P2. Defferent environmental factors have defferent effect on the phenol-degradating of strain P2.

3. We designed a pair of special primer and gene encoding the largest subunit of multicomponent phenol hydroxylase (LmPH) were amplified in strian P2 by PCR. This gene codes enzyme catalyzing the first step of phenol-degradating metabolism. It

III

Abstract 上海师范大学硕士学位论文showed that hereditary basis of phenol-degradating existed in the strain P2.

Key words:Phenol; Biodegradation; Pseudomonas pseudoalcaligenes; Phenol Hydroxylase; 16S ribosomal DNA; Horizontal Gene Transfer;

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论文独创性声明

本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表示了谢意。

作者签名：何小丽日期：2009年5月

论文使用授权声明

本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。

作者签名：导师签名：日期：

上海师范大学硕士学位论文第一章绪论

第一章绪论

1环境污染物苯酚的来源与危害

改革开放以来，中国经济飞速发展，随着生活废水的排放、工业和农业中污水灌溉措施的应用，大量有毒有害的环境物质被释放到环境中。其带来的对环境的负面影响已经越来越受人们的关注。我国在农业方面，全国受重金属污染的耕地多达2000万公顷以上，受农药和其它化学品污染的农田约6000多万公顷。土壤环境质量直接关系到农产品的安全。由于土壤大面积污染，我国每年生产重金属污染的粮食多达1200万吨；全国生产的主要农产品中，农药残留超标高达16～20%，在许多重点工业地区，土壤及地下水污染已经导致癌症等疾病的发病率和死亡率明显高于没有污染的对照区数倍至十多倍[1]。在工业方面，化学工业、造纸工业、石油工业、制革工业、电镀工业、制药工业的污染物被随意排放到水体、土壤等环境，对环境造成很大破坏，成为健康的潜在“杀手”。问题非常严重，此背景下，生物修复技术逐渐收到人们的关注。

1.1 生物修复

依靠真菌、细菌甚至高等植物以及细胞游离酶的自然代谢过程，降解并且去除环境污染物的生物技术称为生物修复技术，广义上的生物修复包括动物修复、植物修复、微生物修复和细胞游离酶生物修复四大主要类型[2-3]。由于这一技术具有高效、低耗和环境安全的特色和优点，逐渐受到人们的重视，并成为环境生物学研究的一个热点。

微生物修复是生物修复的一个重要组成部分，微生物修复主要通过微生物接种，引入与土著微生物群落有关、具有独特或专性代谢功能的微生物，来达到增加区域内的微生物生物量、增加土著微生物活性、优化微生物群落结构、改善其生物可降解程的作用过程，特别是显著影响污染物的生态化学行为[4-5]。微生物修复如果与植物修复结合起来，利用植物根部的分泌物促进微生物的活性，进而提高微生物吸附、降解、转化污染物的能力，使生物修复达到有效地效果[6]。

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第一章绪论上海师范大学硕士学位论文1.2 苯酚的性质及其来源

苯酚（），是一种半透明、白色、针状晶体。具有令人作呕的甜和辣的气味。为易燃易爆物，空气中混有3-10%的苯酚即可引起爆炸。有一定的腐蚀性，显酸性。该化合物是1834年龙格（LungeF）在煤焦油中发现的，故也叫石炭酸。在空气中易变成粉红色，密度1.071g/cm3,熔点42-43℃、沸点182℃，在室温下微溶于水、乙醚、氯仿、甘油和二硫化碳，几乎不溶于石油醚[7]。

苯酚是一种重要的有机化工原料，是丙烯的重要衍生物之一，被广泛地用作颜料合成、制药、炼焦、木材防腐剂、防锈剂、塑料制造、杀菌剂和一般杀虫剂等。随着世界经济的飞速发展，工农业对苯酚的需求量也迅速增加。自从1923年世界上首次以苯磺法生产苯酚以来，世界苯酚的生产发展很快。随后，出现了以异丙苯法为代表的苯酚生产法，这也是当前世界上生产苯酚的最主要方法，其产量约占世界苯酚总生产能力的92%。2003年，世界生产苯酚的总量约为805.3万吨，2004年增加到约865万吨，比203年增长约7.5%。目前，Ineos苯酚公司是世界上最大的苯酚生产厂商，生产能力约占世界苯酚总生产能力的18%。2005年，世界苯酚的总生产能力达到955.3万吨。而与此同时，世界苯酚的总消费量也由2003年的735万吨上升到2004年的748万吨，同比增长约1.8%。世界各个地区对苯酚的需求有所不同，其中美国的需求量约占总需求量的26.8%，欧洲的需求量约占总需求量的28.3%，日本的需求量约占总需求量的11%，亚洲的需求量约占总需求量的20%，其他地区的需求量约占总需求量13.7%。我国苯酚工业生产始于20世纪50年代，最初生产规模小，产量低，成本高，环境污染严重。到2004年，我国苯酚的生产厂家有30多家，总生产能力约为47.7万吨。2004年我国苯酚的产量为34.0万吨，比2003年增长6.3%，1999-2004年产量的年均增长率为10 %。苯酚在生产、运输及使用过程中给环境都带来了严重的污染。此外，很多行业也是酚的特有污染源，生产此类废水的企业主要有:煤气与烧焦工业的煤气厂、玻璃制造、焦化厂、炼油厂、机械、冶金、陶瓷等工业的煤气发生站、石油工业的煤油厂、木材纤维厂、页岩干馏厂、林厂化工厂、木材防腐厂、木材干馏厂，以酚作原料的化工企业有生产树脂、塑料、合成纤维、染料、消毒剂、医药、香料、农药、炸药、玻璃纤维、浮选剂、油漆、化学试剂的工厂和油脂化工厂等等[8-9]。其中以低温土法烧焦排出的低温烧焦油及其废水中含酚量最多。

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上海师范大学硕士学位论文第一章绪论由于污水处理的技术水平和成本等原因，各类型的工厂，如焦化厂、石油化工厂、农药厂等均大量排出未经处理或处理未达标的污水，其中酚类化合物是最常见的水体污染物。表1-1简要列出了酚在各类工业废水中的含量[10]。

表1-1 酚在各种工业废水中的含量

工业污染源酚浓度mg/L

气化无烟煤 10-100；250-1800

气化石炭 2300-3200；400-3200

气化油页岩620-1200

气化褐煤500-600

气化泥煤1200-10800

气体工厂3300

苯酚生产12000-15000

树脂生产10-35200

木质纤维板82

塑料（焦油上水层）3000

酚醛树脂（焦油上水层）3000

炼焦脱酚前1500-5000

炼焦脱酚后10-100

石油化工200-400

玻璃纤维生产40-400

塑料600-2000

木材干馏1500-2000

木材加工560-5500

炼焦化工400-12000

采矿4000-12000

环氧树脂118

二羟苯基丙烷263

1.3 苯酚的危害

苯酚可通过皮肤、吸入、粘膜的接触和经口服而侵入人体内部。它与细胞原浆中蛋白质接触时可发生化学反应，形成不溶性蛋白质，而使细胞失活，浓苯酚溶液能使蛋白质凝固，稀苯酚溶液仅使其变性。而且苯酚还能继续向深部组织渗

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第一章绪论上海师范大学硕士学位论文透，引起深部组织损伤、坏死，直至全身中毒[11]。水体遭受含酚废水污染后，将产生许多严重的恶果。由于废水的耗氧量高，水体氧的平衡将受到严重破坏。当水中含酚0.002～0.015mg/L时，加氯消毒会产生毒性更大的氯酚恶臭，影响作饮用水源。水体含酚0.1～0.2mg/L时鱼肉有酚味，浓度高时引起鱼类大量死亡，甚至绝迹。酚的毒性还可大大抑制水体其它生物（如软体动物、细菌、海藻）的自然生长速度，有时甚至会停止它们的生长。用未经处理的含酚废水（酚大于50～100mg/L）直接灌溉农田，会使农作物枯死和减产。特别是在播种期和幼苗发育期，幼苗因抵抗力弱，酚水会使其霉烂。如用酚浓度大于1mg/L的水灌溉黄瓜地，收获的黄瓜有异味。含酚有机物的毒性还在于其只能被少数的微生物分解，因此，在国内外相继把苯酚列入有毒污染物名单，制定了严格的含酚废水的排放标准，规定饮用水的含挥发性酚的浓度不超过0.001mg/L，水源水体中含酚最高，容许浓度为0.002mg/L[12]。

2 酚类物质的处理

2.1 物理化学方法

目前，对废水中的酚类物质的处理手段主要有以下两大类：一种是传统的方法，主要是通过物理或化学方法处理[13]，如吸附法、萃取法、高压脉冲法、光催化氧化法、湿式催化氧化法、臭氧氧化法等。吸附法是一种简单易行的处理废水的方法，成功的用于废水处理早有报道[14-16]。目前较广泛采用的固体吸附剂有活性炭、大孔树脂、磺化煤等。磺化煤虽然再生容易，但吸附容量较小，处理后废水中含酚量远达不到排放标准，需进行二级处理。活性炭的吸附容量大，对高、低浓度废水都有较好的去除效果，但随着活性炭用量的迅速增加，活性炭的再生显得愈来愈重要。目前，过热蒸汽再生法仍占主要地位，但是，此法除了达到和维持800℃高温的再生条件要消耗大量的能量外，每次循环由摩擦造成的活性炭损失也高达5%～10%，且被吸附的酚易聚合形成双烃基联二苯和苯氧基酚覆盖在活性炭表面而使再生困难，结果导致用活性炭处理含酚废水的方法在经济上的可行性受到了质疑。大孔树脂较其他两种吸附剂有明显的优势，它具有良好的疏

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上海师范大学硕士学位论文第一章绪论水性，而且有大量的孔穴和较大的比表面积。它对废水中酚类物质吸附可逆性好，可用NaCl-NaOH再生，不仅树脂可反复使用，而且可以回收酚类物质。大孔树脂处理含酚量较低的废水已取得较好的效果，但对含酚量较高的废水，由于吸附量有限，仅靠树脂法还不行，可先采用化学沉淀法将废水中的含酚量降低，再用树脂法处理，效果较好。

溶剂萃取法[17-19]是工业上常用的废水脱酚方法之一。但采用通常的溶剂萃取工艺处理含酚废水，废水中酚含量很难达到排放标准。络合萃取法处理高浓度含酚废水已在制药、苯酚等工厂得到应用，易于工业实施，经过2～3个萃取理论级可以达到国家规定的排放标准。但此技术为液一液相萃取，出水需经油水分离器之后才能排放，存在着溶剂损失等问题。

化学氧化法是一种发展早且比较成熟的一种有效降解苯酚的方法[20-22]，它主要是通过外加氧化剂与溶解在水体中的酚类物质发生化学反应，从而达到降解有机物的目的，常用的降酚物质的氧化剂有臭氧(03)、Fenton试剂、过氧化氢(H202)等。其中Fenton试剂从发现至今己有一百多年的历史，它因能有效快速地降解酚类等难降解的有机污染物仍而沿用至今，但是此法的局限性在于运行时需要消耗大量的H202而使降解成本大幅度提高。

湿式氧化法是在化学氧化法基础上发展起来的一种优良的污水处理技术[23-25]，它是在高压、高温下，利用外加氧化剂将有机污染物氧化降解从而达到去除污染物的目的，该法的突出优点是能彻底氧化高浓度、难降解污染物，缺点是因要求高温、高压而大大增加了投资成本和运行成本。

催化氧化法[26]是在有催化剂的条件下降解有机污染物的过程，该法也主要是通过过渡金属或其氧化物做催化剂产生羟基自由基，从而高效降解酚类等有机物，该法对催化剂的技术含量要求比较高，如果使用贵金属，成本将会很高。

光化学催化氧化法、光化学氧化法[27-29]都是在光的作用下，产生具有高氧化电极电位的羟基自由基有效降解酚类物质的方法，近二十年来，这两种方法因其不再产生二次污染且能高效地降解有机污染物等优点开始成为国内外学术界与环境界共同探讨与研究的课题，被称作为“高级氧化技术”。现探讨研究最多的光化学氧化法、光化学催化氧化法包括H202/UV法、03/UV法、Ti02/UV法、03/ H202/UV 法、UV/Fenton试剂法等。其中UV/Fenton法是均相光化学催化氧化法的主要方法，它是在Fenton反应的基础上发展而来。它的核心也是通过光助产生大量的羟基自

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第一章绪论上海师范大学硕士学位论文由基降解有机污染物。它的出现大大提高了光的催化效率和增强了氧化降解能力，在深度处理废水方面比其它方法有更多优势，但它同时存在着光量子效率低和自动产生H202的机制不完善的缺点。同所有光化学催化氧化法、光化学氧化法一样，该法目前存在的主要问题仍然是处理成本高，难以普及化。

2.2 生物处理方法

苯酚虽然是一种较强的生物毒性物质，但是很多微生物(包括好氧微生物和厌氧微生物)可利用苯酚作为生长碳源和能源，因此为含酚废水的生物处理法提供了理论依据。有研究表明，当废水中无高浓度有毒物质或预先脱除有毒物质情况下，含酚量在5mg/L～500mg/L时，适于用生物法处理。生物法与物理、化学方法相比，具有经济、高效的优点，更重要的是可以实现无害化，处理量大、无二次污染，是目前应用最广的废水处理技术，也是我国含酚废水无害化处理的主要方法。生物处理多采用厌氧一好氧处理、好氧处理、活性污泥和生物膜法。

最常用的是传统的活性污泥法[30]。苯酚即使在低浓度下对人体及微生物也有毒害作用，由于很多好氧菌及微生物可利用苯酚作为生长碳源，因此活性污泥法是常用的除酚方法。但该法同时也存在运行管理要求高、对毒物承受能力低、不适应冲击负荷、曝气池容积负荷低、污泥产生量大等不足之处，对组成复杂、浓度较高的含酚废水处理效果不理想。为提高常规活性污泥法的处理效果，改良工艺的应用是近年来生物处理技术发展的一个重要方向之一。如添加粉末活性炭的活性污泥(PACT工艺)；在普通序列间歇式活性污泥法(SBR 工艺)中投加粉末活性碳即PAC-SBR工艺；利用形成生物铁絮凝体的生物铁法以及近年来开发的膜分离活性污泥法。

普通活性污泥法中细胞对毒物的承受能力低、微生物易流失。近几十年来，国内外开展了将固定化细胞技术用于废水处理的探索研究。2000年，朱柱[31]等用红砖碎粒为载体固定脱酚菌，脱酚菌经固定后，代谢苯酚的反应速率增大，降解苯酚的能力大大增强；刘和、王晓云[32]等采用经苯酚驯化后的活性污泥制成固定化微生物小球处理苯酚浓度为2148.0mg/L, COD为10828.8 mg/L的高浓度含酚废水，经24h处理后，对苯酚的去除率为50.1%, KaiChleeLon等用Psedomonas putida 构造的固相细胞膜反应器处理酚，可使浓度高达2000-3500mg/L的酚完全降解。固定化细胞技术在处理时间及苯酚浓度两方面均优于活性污泥法，但该技术还处6

上海师范大学硕士学位论文第一章绪论于研究阶段，要投入实际应用，还面临许多问题。

综上所述，运用化学和物理处理含酚废水不仅极有可能存在着二次污染，而且因为溶剂损失或者高耗能等问题而不经济，因此如今更倾向于利用经济有效且无二次污染的微生物降解的方法来处理含酚废水，但是由于含酚废水的难降解特性，所以引入的菌种要有较强的降解酚能力，并且要能较好地适应冲击负荷的变化。于是，近几年很多国内外科研工作者致力于高效苯酚降解菌株的研究与探索。

3 微生物代谢酚类物质的途径

3.1 目前已分离的降酚类的微生物

对于苯酚降解的研究，国外起步较国内早。到目前为止，已经有许多苯酚降解菌株得到了分离和研究。目前已分离和鉴定的降酚微生物包括根链霉菌(Streptomyces setonii)[33]、瘤菌（Rhizobia）[34]、藻类（Alga Ochromaonas）[35]、酵母菌（Yeast trichosporon）[36] 、克氏杆菌属(Klebsiella sp.)、醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）[37]、假单胞菌（Pseudomonas.sp）[38]、真氧产碱菌（Alcaligenes eutrophus）[39]、反硝化菌（Denitrifying bacteria）[40]和Ralstonia eutropha[41]等苯酚降解菌。国外许多科学家对苯酚降解菌的功能特性和遗传机理进行了大量而深入的研究。

由于我国工业化进程较国外晚，对于环境生物学的研究也起步较迟。目前国内对于苯酚降解的研究基本上处于起步阶段。我们菌种资源丰富，许多苯酚降解菌已经得到了分离和初步的研究。潘利华等（2003）[42]从某印染厂下水道的污泥中分离到一株高效降解苯酚的菌株，经初步鉴定为微球菌属。沈锡辉等（2004）[43]分离到一株能以苯酚、对甲酚、苯甲酸、萘为唯一碳源和能源生长、具有同时降解单环和双环芳烃能力的细菌菌株，经生理生化、16S rRNA基因序列分析等鉴定为红球菌PNAN5菌株（Rhodococcus sp. Strain PNAN5）。徐玉泉等（2000）[44]从我国东北某炼油厂工业废水中分离到一株高效降解苯酚的菌株PHEA-2，经16S rRNA基因序列分析鉴定为醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）。顾立峰等（2004）[45]从化工厂污泥中分离到一株酵母菌，初步鉴定为徳氏酵母属

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第一章绪论上海师范大学硕士学位论文（Debaryomyces sp.），命名为Gb。该菌株可以在0～20%Na2SO4环境中生长，并能以苯酚为唯一碳源和能源。吴培诚[46]等从被含酚废水污染的土壤中分离筛选到一株苯酚琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)，能以苯酚为唯一碳源生长，16h 内可完全降解600mg/L；杨光、向阳[47]等从化工废水污染的土壤中筛选分离到一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)，在24h内可完全降解浓度为600mg/L；陈明，张维[48]等从炼油厂污水中分离的醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)在24h内完全降解苯酚的浓度为300mg/L；高平平，陈迎春[49]等用未经处理的含酚焦化工业废水为基础培养基，采用平板涂布法分离到Arthrobacter mcotianae、Alcaligenes faecalis、Ochrobactrum sp.和Klebsiella sp.等四株菌株，均能在苯酚浓度为500～800 mg/L的唯一碳源的培养基上生长；周治、杨柳燕[50]用生物流化床驯化活性污泥，富集、筛选一株瓶形酵母菌(Pityrosporum sp.),可以降解1000 mg/L 的高浓度苯酚；周群英[51]等人从焦化废水中筛选出了12株高温降酚菌株，在温度为60～68℃下，含酚量为l000 mg/L的情况下进行实验研究，它们的降酚率从12%～100%不等。

通过筛选菌株，引入高效苯酚降解活性菌株能提高含酚废水的降解率，但如何使这些优良降酚菌株长期在生物处理系统中占优势，并保持其高效降解性是研究者们要解决的主要问题，而且提高降解速率是生物处理含酚废水的一个关键问题，因此有必要进行高效降解菌株的筛选培养，研究这些高效菌株的降解特性，确定其最佳的生长条件。但是，已报道的各种降解苯酚菌的降解时间较长，耐苯酚浓度较低(最高1000mg/L)，因此有必要继续分离筛选出降解时间短耐酚浓度高的高效降酚菌，为有效、经济处理含酚废水打下基础。

3.2 微生物代谢苯酚的途径

随着分子生物学和基因工程的发展，人们己经可以对生物进行适当的改造，使其更适合于人们的需要。因此，许多科学工作者对分离鉴定的降酚菌的功能特性和遗传机理进行了深入的研究，揭示了微生物降解苯酚的代谢途径中编码各类酶所需要的基因及其表达系统。

通常编码降酚酶的基因成簇排列在大质粒上面，也有一些位于染色体上。在好氧菌中厂苯酚羟化酶基因是微生物降酚的关键基因，编码苯酚降解途径的第一个酶，负责将苯酚转化成邻苯二酚；而邻位酶和间位酶分别负责将邻苯二酚开环8

上海师范大学硕士学位论文第一章绪论裂解为三羧酸(TCA)产物。在邻位代谢途径中，邻苯二酚被开环裂解产生乙酸、内酯和琥珀酸等中间物；而在间位途径中，邻苯二酚开环裂解后产生黄色的2一羟基粘糠酸半醛。虽然微生物降解苯酚类物质具有不同的途径和酶系统，但是均产生同一类酶即邻苯二酚2，3一双加氧酶(C23O，间位裂解)或1，2一双加氧酶(CatA，邻位裂解) （图1-1），它们分别由C23O和cat A双加氧酶基因编码，它们在不同的降酚菌中具有高度同源性[52]。通过缺失定位、核酸序列分析和多肽分析发现，假单胞菌CF600[53]中的15个基因都是以dmpKLMNOPQBCDEFGH的顺序排列于同一个操纵元上，基因间的间隔在0～70个核昔酸范围内。dmpKLMNOP 编码假单胞菌CF600多组分的苯酚羟化酶，DmpB、DmpC、dmpD和dmpE分别编码C23O、2-羟基粘糠酸半醛脱氢酶(HMSD)、4-氧代丁烯酰变位酶和4-氧代丁烯酰脱羧酶（4-OD)，基因dmpF编码乙醛脱氢酶(乙醛:NAD+氧化还原酶)。DmpQ 存在于间位途径中，可能对C23O酶活性起辅助作用.启动子Pr开启基因dmpR的表达，其表达产物DmpR调控从启动子P0处开始的间位途径中所需专一性酶的一系列基因的表达，启动子Pr和P0的转录方向相反的。

好氧菌中主要存在两种不同类型的苯酚羟化酶蛋白，即单链黄素蛋白一苯酚单加氧酶和多组分寡聚蛋白。苯酚降解菌恶臭假单胞菌(Pseudomonas. Putida)H 的phlD、假单胞菌(Pseudomonas sp.)CF600的dmpN、醋酸钙不动杆菌NCIB8250的mopN和Ralstonia eutropha E2的poxD是编码多组分苯酚羟化酶大亚基的基因。向述荣通过比较它们核苷酸序列的同源性，以这些基因所共有的保守序列设计合成了两个苯酚羟化酶基因特异性引物L1(5′-AGG CAT CAA GAT CAC CGA CTG-3′)和L2(5′-CGC CAG AAC CAT TTA TCG ATC-3′)。以苯酚降解菌醋酸钙不动杆菌Phea-A2为对照，以假单胞菌Phen8的总DNA为模板，用PCR扩增出苯酚羟化酶基因643bp的特征性DNA片段。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测到苯酚羟化酶基因的特征性条带，认为它们的大小与其理论估计值基本一致。在发现了降酚菌的苯酚羟化酶基因有高度同源性后，Kazuya Watanabe[54]以苯酚羟化酶的保守序列为引物，从活性污泥混合菌中提取的总DNA中，扩增出了苯酚羟化酶

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第一章绪论上海师范大学硕士学位论文

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图1-1微生物降解苯酚的代谢途径

注：1.苯酚；2.邻苯二酚；3.2-羟基粘糠酸半醛；4.2-羟基粘酸；5.4-氧代二乙酸（α-酮基二乙酸）；6.2-氧代戊乙酸；7.乙二酸；8.内酯；9.β-酮基二乙酸；HO：苯酚羟化酶；C23O：邻苯二酚2，3加氧酶；C12O：邻苯二酚1，2加氧酶；HMSD：2-羟基粘糠酸脱氢酶；4-OD：4-氧化丁烯酰脱羧酶；TE：顺粘糠酸内酯酶

LmPH基因、gyrB基因片段的特征性条带。Ningyi Zhou[55]将一株能够分解苯酚、甲苯和苯等多种芳香烃化合物的黄色杆菌Xanthobacter Py2的aamA基因编码的xamolA亚基、Rhodococcus rhodochrous B276编码的苯酚羟化酶、链烯和甲烷单加氧酶的亚基进行比较，结果表明，它们具有很高的同源性，并明显具有一定的脂肪族化合物加氧酶的特性。Kim.Y[56]等人对真养产碱菌（Ralstonia eutrophus）的苯酚羟化酶部分序列的分析结果表明，它与假单胞菌(P.pickettii)的甲苯-3-单加氧酶的亚基具有很高的同源性。这些结果表明，不同细菌的苯酚羟化酶基因来自同一祖先，但在长期进化过程中演变形成了不同的苯酚羟化酶基因。

上海师范大学硕士学位论文第一章绪论另外，https://www.360docs.net/doc/3915217359.html,ck[57]等研究表明还存在另外一条苯酚代谢途径，苯酚厌氧代谢的第一步是将苯酚羧化为4-羟基苯甲酸，此反应被认为是Kolbe-Schmitt羧化反应。

4 细菌鉴定的分子生物学方法

科学家估计有分类纪录的各类物种大约有150万，其中微生物超过10万种，而且微生物数目和种类还在不断的增加。微生物学工作者要认识、研究和利用微生物或控制有害微生物，必须对它们进行分类(classification)。

对生物进行分类主要存在两种基本的、截然不同的分类原则：一是根据表型(phenetic)特征的相似成都分群归类，这种表型分类重在应用，不涉及生物进化或不以反映生物亲缘关系为目标；第二种分类原则是要按照生物系统发育相关性水平来分群归类，其目标是探寻各种生物之间的进化关系，建立反映生物系统发育的分类系统。

因此，以进化论为指导思想的分类学(taxonomy)，其目的已经不仅仅是物种的识别和归类，其主要目标是通过追溯系统发育，推断进化谱系，这样的分类学也称之为生物系统学(syatematics)。

分子生物学的发展，使我们不仅可以根据表型特征，而且可以从分子水平上，通过研究和比较微生物乃至整个生物界的基因型特征来探讨生物的进化、系统发育和进行分类鉴定。

4.1 进化的测量指征

20世纪70年代以前，生物类群间的亲缘关系主要是根据生理生化、形态结构、行为习性等表型特征以及少量的化石资料来判断它们之间的亲缘关系。直到60-70年代，科研工作者才清醒地认识到：仅依靠表型特征无法解决微生物的系统发育问题，必须寻找新的特征作为生物进化的指征。

4.2进化指征的选择

根据形态学特征推断微生物之间的亲缘关系主要存在两个突出问题：一是由于微生物可利用的形态特征少，很难把所有微生物放在同一水平上进行比较；二

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第一章绪论上海师范大学硕士学位论文是形态特征在不同类群中进化速度差异很大，仅根据形态推断进化关系往往不准确。

20世纪70年代以后研究微生物的系统发育，主要是分析和比较生物大分子的结构特征，特别是蛋白质、RNA和DNA这些反映生物基因组特征的分子序列，作为判断各类微生物乃至所有生物进化关系的主要特征[58]。

为了准确确定各种生物之间的进化关系，还必须挑选恰当的大分子来进行序列研究。在挑选大分子时应注意以下几点： (1) 选择在各种生物中功能同源的大分子。催化不同反应的酶的氨基酸序列或者具有不同功能核酸的核苷酸序列不能进行比较，因为功能不相关的分子也意味着进化过程中来源不同，对这一类不相关分子进行比较也不期望他们会表现出序列的相似性。所以，大分子进化的研究必须从鉴定大分子的功能开始。(2)它必须普遍存在于所研究的各个生物类群中。如果我们所研究的是整个生命界的进化，那么所选择的分子必须在所有生物中存在，这样才便于分析和比较。 (3)为了鉴定大分子序列的同源位置或同源区，要求所选择的分子序列必须能严格线性排列，以便进行进一步的分析比较。(4)还应注意根据所比较的各类生物之间的进化距离来选择适当的分子序列。

4.3 rRNA作为进化的指征

大量的实验研究表明：在众多的生物大分子中，最适合于揭示各类生物亲缘关系的是rRNA,尤其是16S rRNA[59]。16S rRNA所以被普遍公认是一把好的谱系分析的“分子尺”，这是因为：(1) rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中，其功能保持不变；(2)16S rRNA相对分子质量大小适中，便于序列分析；(3)在16S rRNA分子中，即含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究； (4)16S rRNA普遍存在于真核生物和原核生物中(真核生物中其同源分子是18S rRNA)。

4.4 rRNA的测序和进化

rRNA序列测定和分析方法分两类：寡核苷酸编目法和全序列分析法。

(1) 寡核苷酸编目分析法

20世纪80年代以前的研究,主要是采用寡核苷酸编目分析法。

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(2)全序列分析法

寡核苷酸编目分析法，只获得了16S rRNA分子的大约30%的序列资料，加上采用的是一种简单相似性的计算方法，所以其结果有可能出现误差，应用上受到一定限制。随着核算序列分析技术的发展，20世纪80年代末又陆续发展了一些rRNA全序列分析方法，其中最常用的是直接序列分析法。这种方法用反转录酶和双脱氧序列分析，可以对未经纯化的rRNA抽提物进行直接的序列测定。

4.5 系统发育树

在研究生物进化和系统分类中，常用一种树状分枝的图型来概括各种(类)生物之间的亲缘关系，这种树状分枝的图型被称为系统发育树(phylogenetic tree)[60]，简称系统树。通过比较生物大分子序列差异的数值构件的系统树称为分子系统树。图型中，分枝的末端和分枝的连接点称为结(node)，代表生物类群，分枝末端的结代表仍生存的种类。系统树可能有时间比例，或者用两个结之间的分枝长度变化来表示分子序列的差异数值。

5 水平基因转移在污染修复中的应用

5.1 水平基因转移（Horizontal Gene Transfer, HGT）

一般认为,生物体的基因转移分为两种类型：水平转移和垂直转移。垂直转移一方面是通过高等生物(动植物)的有性繁殖来实现,另一方面是通过绝大多数微生物(如细菌)的分裂生殖来完成,“垂直”标志着物种的延续,使得生物体自身能一代一代地进化繁衍；而基因水平转移（HGT）是指生物体从其生境中获得外源DNA片断的过程,它主要发生在不同种的生物体之间,它既可以通过自然选择获取也可通过人为改造获取[61]。水平基因转移被认为是多个过程的结合,在进化过程中,某种特定的生物体中可移动的基因片断通过载体直接(杂交)或间接(感受态)转入另外一种特定生物体(受体)细胞。转入的基因能在受体细胞中长期保存且能复制,若转入的基因插入到受体的染色体中,则它将随染色体的复制而同步复制；若转入的基因游离于染色体之外,则它可独立自我复制。在这期间,转移机制

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第一章绪论上海师范大学硕士学位论文及维护对水平基因转移有很大影响,如错配修复系统能阻止某些细胞的同源重组。而后,转入基因通过某种机制扩散到受体的种群当中，尽管这其中的机理还不是很清楚,一般认为是由于选择压力(如抗性)所引起。最后,转入基因在选择压力的条件下在受体细胞中表达,并随同受体一同进化和改良[62]。

HGT在生物进化上起着非常重要的作用。它广泛存在于原核生物间并可能直接影响到一部分真核生物。一些可移动遗传因子的基因片断(如编码抗性基因)能以很高的速率转移到其他生物体中[63]。水平基因转移是否在某些生物进化过程中起决定性作用还存在争议。大多数学者认为,由于各种选择压力会造成对水平基因转移的阻碍,其发生频率相对较低,水平基因转移只是对初始基因组有一些影响,并不能决定基因系统进化发展史,真正起决定作用的仍然是达尔文进化作用。但无可争议的是水平基因转移加速了生物体基因组的革新及进化[64]。

5.2 细菌的水平基因转移

水平基因转移的检测方法主要可分为以下几种(1) 通过对基因组的部分序列或开放阅读框的比对研究，确定是否发生水平基因转移。这种方法可以根据特定基因组中不规则的G + C含量及密码子选择模式确定是否发生水平基因转移，但方法本身由于受很多影响因子的限制，因此只能作为水平基因转移检测的参考，不能决定其是否真的发生[65,66]。：(2) 通过对物种系统发育史的研究来看是否发生了水平基因转移。根据基因树形成的不同的基因家族进行比对来确定水平基因转移是否发生，但这种方法在实际运用起来比较困难，由于许多基因家族存在着严格的种族分类，同时，一些基因接受变化的速度很快，因此很难确定这些基因是否是直系同源基因。(3)通过编码抗性基因的供体与不具有这种抗性的受体进行杂交培养，再通过抗性筛选转化结合子来确定水平基因转移的发生。

(4)将可能存在的可移动遗传因子编码上荧光蛋白标记，然后对受体菌进行原位监测确定是否发生水平基因转移[67-69]。这种方法由于其精度高且能原位检测从而被广泛使用。

现有的水平基因转移检测技术还不是很完善，尤其在测定转基因农作物与本地菌之间的水平基因转移上。因此，急需新的有效的检测方法来弥补当前的技术缺陷。

细菌的水平基因转移一直是这些年研究的热点，主要是由于细菌之间存在着14