包涵体蛋白纯化步骤
包涵体蛋白纯化步骤
生物日记部落，这次将会擦掉黑板上曾经书写的知识笔记，转角进入“包涵体蛋白”。包涵体蛋白纯化的步骤主要包括裂解、洗涤、溶解、复性、纯化。
在实验前线着手于瓶瓶罐罐的大家，实验所纠结的问题或许总会缠绕身前身后，闯入梦中。
在情理之中时，又是怎么看待“处理实验问题”的态度？两天一个周期的实验结束，没有结果，暂且随之不作为，接着重复做一次。小伙伴们，这是一种正确的态度么？
“如果你的工具只有一柄铁锤，你就可能认为所有的问题都是铁钉”。
回想，变通，将路延伸在嘴巴上请教，预测时间进程，交叉重复，这是在过去灰色的记忆里想起的一位老师给我讲的一种态度。
将态度按照个人的素养去演绎变幻，就会有多条路，意外到问题本身。
——看的见的问题是态度本身
包涵体蛋白纯化步骤
包涵体洗涤
包涵体溶解
包涵体复性
包涵体纯化
1、包涵体裂解
细胞内重组蛋白的提取要依照蛋白的来源和性质选择合适的方法，蛋白一般来源于细菌、植物、哺乳动物细胞等。
细胞裂解常用的方法有：酶解法、研磨、匀浆、超声破碎法、冻融等。
（1） 细胞酶解：在稀释菌液中加入0.2-0.4 mg/ml 溶菌酶、1 mM MgCl 2、20 μg/ml
DNase 、1mM PMSF ，混均匀，冰上或者室温放置30 min 。根据目的蛋白对温度的敏感性选择合适的温度。
向着太阳是向日
葵不变的态度
（2）机械裂解：加入1% Triton X-100,充分混匀，冰上放置15 min，在冰上用超声波破碎细胞10 min，至细胞变澄清，或在-20℃下冰冻，室温溶解，反复冻融5次以上；4 ℃，5000 r/min离心15 min，弃上清，用0.45 μm或
0.22 μm的滤膜过滤除去细胞碎片；
在细胞裂解时应该注意：
a 尽量选择比较温和的处理方法，避免太剧烈地操作导致目的蛋白变性，或者蛋白酶释放。
b 为了保持蛋白质的稳定性，在蛋白的提取时应迅速，低温，添加蛋白酶抑制剂，例如，加入DFP（二异丙基氟磷酸）抑制或者减慢自容，加入碘乙酸抑制巯基作用的蛋白水解酶活性，加入PMSF（苯甲磺酰基氟化物）抑制蛋白水解酶的活性，另外，选择合适的缓冲溶液稳定蛋白溶液的PH值及离子强度，添加DNA酶降低核酸的粘稠度。
2包涵体洗涤
包涵体常用的洗涤试剂：中性去垢剂和还原剂。在包涵体表面吸附着大量的不溶性蛋白，内部成分除了含有重组蛋白，还含有RNA聚合酶、外膜蛋白等杂蛋白，DNA、RNA核酸片段，多糖，脂类等。通过包涵体的洗涤能够除去一些影响重组蛋白活性的杂蛋白，例如，大肠杆菌外膜蛋白OmpT在8 mol/L的尿素中具有蛋白水解酶的活性，可能在包涵体的溶解中降解重组蛋白。
常见的中性去垢剂：TritonX-100，SDS，CTAB，Tween-20，脱氧胆酸盐等，溶解能力比变性剂更加温和。
还原剂：0.1-5mM β-巯基乙醇，二硫苏糖醇，谷胱甘肽等，对于含有半胱氨酸的重组蛋白，还原剂的使用非常重要。
3 包涵体的溶解
变性剂盐酸胍/尿素是包涵体溶解常用的试剂，使蛋白质的氢键发生可逆性的变性作用，破坏蛋白质的折叠。如4-8M的尿素，4-6M的盐酸胍；变性剂在溶解包涵体蛋白时，必须事先检测他们和目的蛋白的兼容性，可以利用层析柱法分离溶解蛋白和变性剂，在分离的同时进行纯化和复性。
还原剂的浓度、作用时间、温度、离子强度要影响变性剂的溶解作用，因此在蛋白质变性时可以加入中性去污剂（SDS、CTAB、Tween 20等）、还原剂（β-巯基乙醇、DTT、GSH等）。
4 包涵体蛋白复性
溶解后的重组蛋白必须正确的折叠才能复性形成具有功能性的蛋白，去除变性剂是影响蛋白复性的因素之一，另外还需考虑pH值、还原剂的存在，宿主蛋白与重组蛋白之间的浓度比对蛋白复性的影响。
复性的技术有：稀释蛋白溶液到接近中性、逐步透析去除变性剂、柱上复性、凝胶过滤层析。
蛋白复性之后可根据其他纯化蛋白的方法进一步纯化蛋白。
5包涵体蛋白纯化
复性以后的蛋白纯化方法和可溶性蛋白纯化方法相似，即离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析、硫酸铵盐析沉淀法等。
后记：
每一种蛋白质都有其相应的氨基酸的序列，表现出不同的理化性质，这些物理上的差异性可以作为进行蛋白纯化的线索，具体的实验操作还需多次实践验证，愿这些基础知识能为你的实验操作提供理论支持，我们是北京义翘神州生物，有专业的蛋白表达纯化团队，若有需要请联系我（xiaoli_li@https://www.360docs.net/doc/3917224872.html,）。
蛋白的纯化
第二部分：蛋白的纯化 如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？ 破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。 根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。但如果超声完之后，菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成的无活性的蛋白质聚集体，难溶于氺，可溶于变性剂如尿素，盐酸胍等，其实，包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。对于后者，可将上清和沉淀分别跑一个PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。 对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。 沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。 取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。 无论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM 咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。 包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。 电泳检测的话，可以用SDS-PAGE检测，在上样之前，需要用上样缓冲液处理样品，处理后，包涵体也就解聚了，每个蛋白分子与SDS结合，形成了可溶物。 包涵体是不容易破碎的，超声可以破碎菌体释放里面的包涵体，但是不能破碎包涵体；但如果用水煮的话，包涵体会变性，会有一部分可溶于水，所以你跑的上清中有可能有包涵体存在，也有可能没有包涵体； 建议： 还是先将菌体超声破碎，然后离心，取沉淀和上清再跑一次电泳，如果沉淀上清中都有你要的蛋白，说明表达的结果是部分可溶；如果仅上清有就是可溶性表达；如果仅沉淀中有，就是完全包涵体了。不过，一般情况下，应该是第一者的可能性大。
蛋白质的纯化方法
蛋白质纯化的方法 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
(整理)包涵体的分离纯化.
包涵体的纯化和复性总结（二） 关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂 一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-1 00, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的load ing buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的. "取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体? " 而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的.
His蛋白纯化原理 方法和问题分析
组氨酸(His)标签蛋白的纯化 His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）纯化。 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et 年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC 纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。 Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。 步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。挂完之后，按理想来讲，你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数在烧杯里，留下来了，当然肯定有少量杂蛋白也挂上了，这时候你要，拿咪唑和你的buffer配，一般从0 20mM 40mM。。。。100mM 这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度。咪唑加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋白，会在不同的浓度被洗脱下来，洗完之后，你可以用400mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡几次，是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~过的蛋白用不同的管子收下，然后SDS-page检测在哪个管子里。 市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种： 一、组氨酸(His)标签蛋白的纯化步骤： 大肠杆菌的破碎方法： 1）收集培养发酵液，4度7000-8000g离心10分钟，收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放-70度冷冻，但是最好能保存成小块或者薄片，这样好用。) 2）取1-2克菌体加10ml破碎缓冲液（的50mM磷酸缓冲液含NaCl，ml溶菌酶，1mM PMSF，1mM MgCl2，ml Benzonase,其中的菌酶，1mM PMSF，ml Benzonase现加）在冰上混合45分钟，如果pH不在7-8，需要用NaOH一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶10mg/ml混合时间可以缩短到10分钟.
包涵体纯化
包涵体： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。 包涵体的组成与特性： 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF 和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。 包涵体表达的有利因素： 1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。 破菌： 1、机械破碎 2、超声破碎 3、化学方法破碎 分离： 1、离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。 2、过滤或萃取方法： 洗涤： 由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。 溶解：
包涵体纯化全过程(3)
一、包涵体的纯化和复性总结（二） 二、[ 2008-2-25 14:25:00 | By: 飞鸿 ] 三、关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂 一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等
细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml 溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的. "取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法
蛋白质纯化与结晶的原理
蛋白质纯化与结晶的原理 获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈，就是制备大量纯化的蛋白质(>10 mg)，其浓度通常在10 mg/ml 以上，并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术，将特定基因以选殖(clone)的方式嵌入表现载体(expression vector)内，此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中，如大肠杆菌(Escherichia coli)，在菌体快速生长的同时，也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体，因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。 在取得高纯度的蛋白质溶液后，接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似，是在饱和溶液中慢慢产生的，每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异，影响晶体形成的变量很多，包含化学上的变量，如酸碱度、沈淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等；物理上的变数，如溶液达成过饱和状态的速率、温度等；及生化上的变数，如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等，皆是养晶时的测试条件。截至目前为止，并无一套理论可以预测结晶的条件，所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后，才可能得到一颗完美的单一晶体(图一) 。 蛋白质晶体的培养，通常是利用气相扩散法(Vapor Diffusion Method) 的原理来达成；也就是将含有高浓度的蛋白质(10-50 mg/ml)溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态时，蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说，我们将蛋白质溶于低浓度(~1.0 M) 的硫酸铵溶液中，将它放置于一密闭含有高浓度(~2.0 M)硫酸铵溶液的容器中，由气相平衡，可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度，进而达成结晶的目的(图二)。 蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处，但在晶体的内部，却有很大的差异。一般而言，蛋白质晶体除了蛋白质分子外，其他的空间则充满约40 %至60 %之间的水溶液，其液态的成分不仅使晶体易碎，也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现，造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性，让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态，极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构，基本上可视为自然状态下的结构。 蛋白质结构解析的方法简介 到目前为止，蛋白质结构解析的方法主要是两种，x射线衍射和NMR。近年来还出现了一种新的方法，叫做Electron Microscopy。其中X射线的方法产生的更早，也更加的成熟，解析的数量也更多，我们知道，第一个解析的蛋白的结构，就是用x晶体衍射的方法解析的。而NMR方法则是在90年代才成熟并发展起来的。这两种方法各有优点和缺点。 首先来说一下，这两种方法的一般的步骤和各自的优点和缺点。电子显微镜（electron microsco py）作为一种新型的技术，目前的应用还是非常少，并且比较狭窄，我可能等到最后在给它作些
蛋白纯化的一般原则及方法选择
随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易lIl。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1 蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可 以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2.各种蛋白纯化方法及优缺点 2.1蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸。在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白质最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保护蛋白的活性。硫酸铵分馏常用做纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG 和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果， 在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。
包涵体蛋白的分离纯化
包涵体蛋白的分离纯化 赵玲0743085096 包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH 值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%~95%,此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。 1. 包涵体的形成 重组蛋白不论在原核细胞还是真核细胞中表达时,都可形成包涵体。通常所说的包涵体是指重组蛋白在大肠杆菌中高效表达时形成的无活性蛋白聚集体,一般含有50%以上重组蛋白,其余为核糖体组分、RNA聚合酶,外膜蛋白等杂蛋白,以及质粒DNA、RNA片断、脂质、肽聚糖、脂多糖等成分]。由于包涵体在相差显微镜下为黑色斑点, 所以也称为折射体。包涵体形成的原因主要有以下几点: ⑴蛋白合成速度太快,以致于没有足够的时间进行折叠。蛋白折叠的动力学模型表明:蛋白质天然构象形成的速率取决于肽链的合成速率、折叠速率和聚集速率几个因素。中间体正确折叠是分子内的一级反应,而中间体的聚集是发生在分子间的二级或高级反应,因此,折叠中间体的浓度对聚集反应影响非常大];⑵重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺少真核生物的翻译后修饰系统(如糖基化等) ,致使中间体大量积累,容易形成包涵体;⑶培养条件不佳和重组蛋白所处的环境也可导致包涵体形成,如发酵温度高,胞内pH 接近蛋白的等电点等;⑷二硫键在蛋白折叠中有重要作用,而大肠杆菌胞内的还原环境不利于二硫键的形成;⑸包 涵体不溶可能由于分子间无活性的β2片层含量高于天然结构或盐沉淀蛋白。包涵体蛋白虽然不具有天然
蛋白纯化的基本思路
蛋白质的提取和纯化-- 选择分离材料及预处理蛋白质的提取和纯化-- 选择分离材料及预处理 以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。 蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。 蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（ 1 ）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体 含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 细胞的破碎 1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处， 开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料， 用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100 毫克菌体/毫升浓度，在1KG 至10KG 频率下处理10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。 4、反复冻融法：将细胞在-20 度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破 坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物 降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以
蛋白质纯化的方法选择
蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。
包涵体纯化液体配制
包涵体洗涤液I 50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 100 mmol/L NaCl 10 mmol/L EDTA（pH8.0） 0.5% (v/v) TritonX-100 包涵体洗涤液II 包涵体洗涤液I 2 mol/L尿素 包涵体洗涤液III（pH9.0） 包涵体洗涤液I 4 mol/L尿素 包涵体溶解液 50 mmol/L Tris-HCl（pH9.0~10.0） 100 mmol/L NaCl 1 mmol/L EDTA（pH8.0） 0.5%(v/v) TritonX-100 8 mol/L尿素 5 mmol/L DTT 包涵体复性缓冲液（pH 8.0） 1× PBS 1 mmol/L EDTA（pH 8.0） 2.2.2.6 VP1重组蛋白的纯化回收 2.2.2.6.1 包涵体洗涤 按最佳条件诱导表达基因工程重组菌400 mL，离心收集菌体。冰浴中进行超声裂解，裂解后离心收集沉淀。将沉淀悬浮于9倍体积的包涵体洗涤液I中，混匀后室温放置5~10 min，4℃ 12000 r/min离心20 min，分别收集上清与沉淀。接着，再将沉淀悬浮于9倍体积的包涵体洗涤液II中，混匀后室温放置5~10 min，同样12000 r/min离心20 min后收集上清与沉淀。最后将沉淀悬浮于9倍体积的包涵体洗涤液III中，混匀后室温放置5~10 min，4℃ 12000 r/ min离心20 min后收集上清与沉淀。取少量的洗涤上清和重悬的沉淀进行SDS-PAGE电泳，检查包涵体的洗涤情况。 2.2.2.6.2 包涵体溶解 用包涵体溶解液溶解沉淀，初始体积为100 mL的诱导菌约用10 mL包涵体溶解液溶解，室温作用1~2 h，其间不断振荡。4℃ 12000 r/min离心20 min后收集上清和沉淀。取少量溶解上清和重悬的沉淀进行SDS-PAGE电泳，检查包涵体的溶解情况。 2.2.2.6.3 包涵体的复性 将溶解的包涵体上清装入已处理的透析袋内，置复性缓冲液中4℃条件下进行梯度透析，复性缓冲液中尿素浓度依次递减4.5 mol/L、3.5 mol/L、2.5 mol/L、1.5 mol/L、0.5 mol/L和0 mol/L，（ 6M 4M 2M 0M PBS H2O）换液间隔时间为10~12 h。取出透析后的蛋白溶液于4℃ 12000 r/min离心20 min，收集上清。分别取少量的上清和重悬的沉淀进行SDS-PAGE电泳，检查包涵体的复性情况。 2.2.2.6.4 SDS-PAGE电泳及电洗脱 参照分子克隆实验指南的方法配制12%的分离胶，按Bio-RAD产品说明书装好制胶板，加入分离胶（使梳子到胶面的距离约1 cm），胶面上加一层水，室温放置待胶充分聚合后吸干水份，加入配好的浓缩胶，装上梳子，胶充分聚合后拔出梳子即可上样进行电泳。收集复性后的包涵体加入等体积2×SDS上样缓冲液，混匀，煮沸5 min，12000 r/min离心2 min，取上清10 上样，同时设标准蛋白对照孔。恒压130 V电泳1~1.5 h，电泳完毕后用适量染色液
蛋白质纯化与结晶的原理获得蛋白质的晶体结构的第一个
中国试剂网 3.15.2.19 蛋白质纯化与结晶的原理 获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈，就是制备大量纯化的蛋白质（>10mg），其浓度通常在10mg/ml以上，并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术，将特定基因以选殖（clone）的方式嵌入表现载体（expression vector）内，此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中，如大肠杆菌（Escherichia coli），在菌体快速生长的同时，也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体，因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。 在取得高纯度的蛋白质溶液后，接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似，是在饱和溶液中慢慢产生的，每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异，影响晶体形成的变量很多，包含化学上的变量，如酸碱度、沉淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等；物理上的变数，如溶液达成过饱和状态的速率、温度等；及生化上的变数，如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等，皆是养晶时的测试条件。截至目前为止，并无一套理论可以预测结晶的条件，所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后，才可能得到一颗完美的单一晶体。 蛋白质晶体的培养，通常是利用气相扩散法（Vapor Diffusion Method）的原理来达成；也就是将含有高浓度的蛋白质（10～50mg/ml）溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态时，蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说，我们将蛋白质溶于低浓度（~1.0M）的硫酸铵溶液中，将它放置于一密闭含有高浓度（~2.0M）硫酸铵溶液的容器中，由气相平衡，可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度，进而达成结晶的目的。 蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处，但在晶体的内部，却有很大的差异。一般而言，蛋白质晶体除了蛋白质分子外，其他的空间则充满约40%至60%之间的水溶液，其液态的成分不仅使晶体易碎，也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现，造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性，让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态，极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构，基本上可视为自然状态下的结构。
蛋白质的分离纯化方法(参考资料)
蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
包涵体纯化方案
包涵体纯化方案 缓冲液配方： 1.变性复性缓冲液 缓冲液A：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA ① , 100mM NaCl ② ,1%Triton X-100 ③ 缓冲液B：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100，2M脲素 ④ 缓冲液C：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100缓冲液D：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100，2M盐酸胍 ④ 溶解缓冲液E：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，10mM β-巯 基乙醇/DTT ⑤ ，2mM脱氧胆酸钠 ⑥ ，8M脲素 复性缓冲液：50mM Tris-HCl (pH8.5)，100mM NaCl ，6M/4M/2M脲素,1%甘氨酸 ⑦ ，5%甘油⑧ ，0.2%PEG ⑨ ，1mM氧化型谷胱甘肽，1mM还原型谷胱甘肽 ⑩ 2.纯化缓冲液 Binding buffer：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM 咪唑，pH8.5 Elution buffer：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 不同浓度梯度咪唑, pH8.5 具体实施步骤： 1.大量诱导表达的菌液7000rpm离心10min。弃上清，用1×PBS重悬，洗涤菌体细胞，7000rpm，离心10min。再用PBS重复洗一遍。离心后留菌体沉淀。 2.将菌体细胞用缓冲液A重悬，液氮中反复冻融后，超声破碎。13000rpm离心10min，弃上清，收集包涵体沉淀。