实验二微生物培养基的配置与灭菌

实验报告

课程名称：环境微生物学实验 实验类型： 综合实验 实验项目名称： 微生物培养基的使用与灭菌

学生姓名： 专业： 环境工程 学号：

同组学生姓名：

指导老师：

实验地点： 实验日期： 2018 年 9月 23日

一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）

三、主要仪器设备（系统、软件或平台）

四、操作方法与实验步骤

五、实验数据记录和处理

六、实验结果与分析（必填）

七、讨论、心得

注：不同类型的实验课对实验报告可有不同要求，各个学科的实验报告可以根据自己的学科特点做适当的调整，但上述基本内容中的第一、二、六条为必须填写的内容。

装订

线

一、实验目的和要求

1.了解微生物培养基的种类及其配制原理，掌握微生物培养基的配制程序。

2.学习并掌握牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基和淀粉琼脂培养基的配制方法。

3.了解几种灭菌方法与手法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其操作方法。

二、实验内容和原理

1.培养基：

指由人工配制的、话合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养物质。一般要求:提供微生物正常生活所需的各种养料(如碳源、氣源、无机盐类、生长因子、水等)并保持养料间的平衡；具有适宜的pH、合适的渗透压、合适的氧化还原电位；保持无菌状态。

2.培养基的选择与设计原则

(1)目的明确原则:应根据微生物得种类以及培养的目的采用不同类型的培养基。对于不同的微生物，

培养目的不同，原料的选择和配比也不同。例如枯草芽胞杆菌，在一般培养时使用肉汤培养基、在观察培养时使用生芽胞培养基、在产蛋白酶过程培养中使用以玉米粉、黄豆饼粉为原料的产酶培养基。

(2)营养协调原则:微生物细胞组成元素的调查或分析，是培养基设计的重要参考依据。根据微生物的

营养物质要选用不同的培养基，例如细菌使用牛肉膏蛋白胨培养基、放线菌使用高氏一号合成培养基、酵母菌使用麦芽汁培养基、霉菌使用察氏合成培养基。同时培养基也需根据微生物的生长需要配置不同的营养物质浓度及配比的培养基，例如高浓度的糖类物质、重金属离子等不能促进微生物生长，反而起到抑制的作用。

(3)理化适宜原则:指培养基的PH值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件较为适宜。

(4)经济节约:配制培养基时应尽量利用廉价且易获得的原料作为培养基组份，特别是在发酵工业中，

以降低生产成本。可以工业生产中废弃物作为培养微生物的原料，如制糖工业中的含有蔗糖的废液、乳制品工业中含有乳糖的废液、豆制品工业的废液、造纸工业中含戊糖和己糖的亚硫酸纸浆等都可以是制作培养基的原料。在工业上甲烷发酵主要利用废水及废渣作为原料，而在农村中也普遍以粪便及肥草等作为甲烷发酵的原料。

3.培养基的种类

甲、按培养基组成物质的化学成分区分

根据对培养组成物质的化学成分是否完全了解来区分，可以将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。

（1）天然培养基。天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道，虽然不能确切知道它的化学成分，但一般来讲，营养是比较丰富的，微生物生长旺盛，而且来源广泛，配制方便，所以较为常用，尤其适合于配制实验室常用的培养基和大生产上的培养基。

（2）合成培养基。合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。

（3）半合成培养基。在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。如果在合成培养基中加入琼脂，由于琼脂中含有较多的化学成分不太清楚的杂质，故也只能算是半合成培养基。这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。

乙、按培养基的物理状态区分

培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。

（1）固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。用于微生物分离，鉴定，计数。如图，微生物分离成菌落、菌苔。

图中为大肠杆菌菌落，适用涂布平板法得到。

（2）半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。常用于观察微生物运动特征。

（3）液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。

丙、按培养基的用途区分

(1)起础培养基。无选择性地满足一般微生物生长需要的培养基。如:牛肉旁蛋白胨培养基、LB培养基。

(2)加富培养基。在基础培养基中添加一些特殊营养物质。如血液。血清、组织液或生长因子等，用

以培养对营养要求苛刻的异养微生物。如:培养百日咳杆菌需要含有血液的培养基。

(3)选择培养基。利用某一种或某一类微生物的特殊营养要求或特殊环境要求，在培养基中加入某些

特殊物质。抑制非目的微生物生长。促进目的微生物生长。如:马丁氏CMartin)培养基。

(4)鉴别培养基。在培养基中加入某种化学试剂。某种微生物在该培养基上生长，其所产生的某种代

谢产物与化学试剂发生特征性反应，以此鉴定该种微生物。如: EMB培养基、醋酸铅培养基等。

4.凝固剂:

凝固剂必须具有的特点:不被微生物液化、分解和利用；在微生物生长的温度范围内保持固体状态凝固点的温度对微生物无害；不因消毒灭菌的高温处理而破坏；透明度好、粘着力强；配制方便、价格低廉。

5.消毒与灭菌

6.主要灭菌方法

(1)干热灭菌法。如：火焰灼烧(适用接种环)、热空气灭菌(适用玻璃器皿、金属用具等耐热物品)

(2)湿热灭菌法。如：高压蒸汽灭菌(适用含水分、不怕受潮的物品)、间歇灭菌(适用不耐热培养基)

(3)过滤除菌。如：蔡氏滤器、针式微孔过滤器(适用不能加热灭菌的也体物致，如维生素、血清等)

(4)紫外线灭菌。原理：诱导胸腺嘧啶二聚体的形成，抑制微生物DNA复制；辐射使空气中的氧气转

为臭氧、H2O转为H2O2此二者皆有杀菌作用。但由于紫外线穿透力弱，因此紫外线杀菌只适用于物体表面的除菌。

(4)仪器。干热灭菌器(160~170C，1.5~2h)、高压蒸汽灭菌器(121C、15~20min)

三、主要仪器设备（必填）

1.药品和试剂:干粉培养基(营养琼脂培养基、高氏一号培养基。马铃薯蔗糖培养基) .1mo1/L HC1，1mo1/L.

NaOH。

2.仪器：天平，电磁炉，高压蒸汽灭菌锅，电热烘箱。

3.破离器皿:培养山带硅胶塞的试管。带铝盖的试管。移液管，装有玻璃珠的三角瓶，涂布棒，量筒，

锥形瓶。玻棒等。

4.其它物品:刻度搪瓷杯，药匙，称量纸，PH精密试纸，线绳，牛皮纸，报纸，棉花，灭菌指示胶带等。

四、操作方法和实验步骤

1.培养基的制备

丙、马铃薯蔗糖琼脂培养基─真菌培养基

2.无菌操作

甲、棉花塞制作(1个1人);加塞时，应使棉塞长度的1/3在试管口外， 2/3在试管口内，如图1所示，做塞的棉花要选纤维较长的棉花。

乙、玻璃器皿的包装：培养皿包装;锥形瓶包装;移液管包装;三角玻棒包装

丙、培养基配制(1种/组)、培养基分装、包扎(4瓶/组，40mL/瓶;5支/组, 5m试管蒸馏水分装(4根/组; 9mL根) ;灭菌、斜面放置(2人大组)。

五、讨论、心得

本次的实验内容虽然简单却是微生物相关实验的基础。在培养基的配置上，我们小组负责的是年肉膏蛋白胨培养基的制作，加热培养基液体时因为来不及移开杯子导致有一两滴培养基洒落在台面上，因此下次配置时应注意，培养基液体一沸腾就要马上将搪瓷杯移开停止加热，另外在培养基分装时要尽可能的快速，以免培养基凝固在杯子中无法分装，最后再清洗搪瓷杯时要等残余的培养基液体干透后就能清液将凝固的培养基清除。而在移液管包装时一开始也不太顺手，包装用的报纸总是不够长，最后才抓到技巧，即一开始就要将报纸与移液管摆成小于30度的位置，因为之后再卷报纸时每卷报纸卷的间距会越来越小，因此使用这样的技巧可以比较容易的进行包装。

六、思考题

1.微生物生长与氧化还原电位的关系?

氧化还原电位反映了水中所有物质表现出来的宏观氧化还原性，单位一般用EV表示，通常以pH=7时为标准，记为Eh。氧化还原电位主要受环境中氧的影响，同时也受环境的pH值以及环境中的具有氧化还原性质物质的影响。氧化还原电位对微生物的生长繁殖及存活有很大影响。随着氧化还原电位的降低，各种微生物的活性随之发生改变，首先表现在氮呼吸，产生氨氮、亚硝酸盐;继续降低，是铁锰呼吸，三价铁逐渐被还原成二价铁，这个过程耗氧产酸，pH下降;若继续降低便是硫呼吸，原本存在的硫酸根被还原成硫化氢，硫化氢跟亚铁离子反应，黑臭现象凸显;最后极度缺氧情况下，有机质分解产生甲烷，也就是俗称的“沼气”。一般好氧微生物在Eh值+100mV以上均可生长，+300~+400mV 的最合适。厌氧性微生物只能在Eh值低于+100mV以下生长,在-100mV以下生长较好。兼性厌氧微生物在+100mV以上时进行好氧呼吸，在+100mV以下时进行发酵。

2.培养基中加琼脂的作用是什么?配制固体培养基加入琼脂加热熔化时要注意哪些问题?

在制作微生物的培养基的过程中，可以通过添加琼脂作为凝固剂来将液体培养基转化为固体培养基或半固体培养基。

加热熔化时要注意1.加热器功率不能太高，也不能太低。太高，容易沸腾和把培养基烧焦；太低，培养基容易凝固。2.受热要均匀，可以垫上石棉网，要用玻璃棒不停缓慢搅拌。3.加热完毕后，要在合适的温度（60℃左右）倒平板，防止凝固。

3.干热灭菌、高压蒸汽灭苗和间歇灭菌的原理有何不同，各适用于哪些场合和物品?

三者皆是属于加热灭菌，指利用高温使蛋白质凝固变性的方法。

(1)干热灭菌是利用干热空气或火焰使细菌的原生质凝固，并使细菌的酶系统破坏而杀死细菌的方法。

多用于容器及用具的灭菌，条件温度为160~170度加热1.5~2h，如火焰灼烧(适用接种环)、热空气灭菌(适用玻璃器皿、金属用具等耐热物品)。

(2)高压蒸汽灭菌系指在密闭的高压蒸汽灭菌器内，利用压力大于常压的饱和水蒸汽来杀灭微生物的

方法。具有灭菌完全可靠、效果好、时间短、易于控制等优点，能杀灭所有繁殖体和芽胞，条件是加热到121度15~20分钟，常用于普通培养基、生理盐水、手术器械、玻璃容器及注射器、敷料等物品的灭菌。

(3)间歇灭菌是在常压下，于不密闭的灭菌箱内，用 100 ℃流通蒸汽 30-60 分钟来杀灭微生物的方

法来杀灭微生物，必须待二至三天芽胞开始繁殖的时候再次灭菌如此反复三次就可。本法适用于1-2ml 注射剂及不耐高温的品种如血清等物质，但不能保证杀灭所有的芽胞，所以最好要加抑菌剂。

4.如何检查培养基灭菌是否彻底?

把灭菌后的培养基按灭菌锅内的不同位置，每处抽取数管，标上记号，置25℃～30℃培养一周左右进行检查，如果是固体培养基则无任何菌落生长，如果是液体培养基则不浑浊。如果培养基没有什么变化，说明灭菌效果良好；或使用灭菌指示剂来判断。

5.为什么湿热灭菌比干热灭菌优越?

湿热灭菌利用空气和水蒸汽的作用，导热快，穿透力强，能透入菌体，使菌体胞膜膨胀破裂，原浆流出，受热凝固变性。同时蒸汽具有潜热，能迅速提高灭菌物品的温度，加强灭菌效果。而干热是相对湿度在20%以下的高热，由空气导热，速度较慢，必须提高温度和适当延长消毒时间，才能达到灭菌目的。所以在同一温度条件下湿热灭菌较干热灭菌效果好。