蛋白质相互作用研究方法的概述

蛋白质相互作用研究方法的概述

摘要：蛋白质是生命活动的执行者，细胞内的生理生化反应都有蛋白质来参与完成。但生命活动中各种功能和行为不是由单一的蛋白质分子来完成的，蛋白质需要与蛋白质、核酸等相互作用形成一个复杂的网络来完成各种功能。蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。因此，蛋白质之间的相互作用成为国内外竞相研究的重点，而研究方法的快速发展为蛋白质间相互作用的研究奠定了基础。本文将介绍一些研究蛋白质之间相互作用的常用方法。

关键词蛋白质相互作用Y2H PDT FRET 免疫共沉淀

引言：随着生命现象的研究由获取基因序列转向研究基因功能，一门新的科学——蛋白质组学应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体，其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间的相互作用来实现的，这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中，相互交叉形成网络，构成细胞中一系列生命活动的基础。因此，对蛋白质相互作用的研究就成为蛋白质组学中最重要的研究内容之一，而对其研究必不可亏的就是选择适当的方法，生物化学技术也就成为了能否成功研究蛋白质相互作用的关键。

在蛋白质相互作用研究过程中，首先确定某一个蛋白质可以与那些蛋白质发生相互作用，目前称之为蛋白质--蛋白质相互作用的图谱化；然后在蛋白质—蛋白质相互作用图谱的基础上，制作一幅蛋白质-蛋白质相互作用的网络图。因此，蛋白质相互作用的研究也称分为两个步骤：蛋白质—蛋白质相互作用的图谱化和蛋白质组的网络化。蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法较多，目前比较成熟的有酵母双杂交技术（Y2H）、噬菌体展示技术（PDT）、融合蛋白沉降技术、亚细胞共定定位、免疫共沉淀技术、荧光共振能量转移技术、表面等离子共振、蛋白芯片技术（抗体与蛋白质整列技术）以及融合蛋白亲和色谱法等。

1、酵母双杂交技术（Y2H）

酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。是由Fields等在1989年初步提出并建立的，主要用于研究真核生物的蛋白质。酵母双杂交系统的建立是基于人们对酵母半乳糖苷酶基因的转录激活因子GAL4的详细了解。GAL4包括两个可以独立的结构域：N末端的DNA结合域（DNA-BD）和C末端的转录激活域(DNA-AD)。DNA-BD可以与DNA分子的上游激活系列结合，DNA-AD则可以激活下游基因的转录，只有当两者在空间上充分接近时才会共同作用激活转录活性。基于此，在酵母双杂交中，两个蛋白质（一个是研究者感兴趣的已知蛋白质，另一个是与这个已知蛋白发生特异性相互作用的目标蛋白）分别与酵母转录激活因子Gal4的DNA结合域和转录激活域融合。如果这两个蛋白质可以发生相互作用，那么与他们融合的AD，BD结构域可以介导Gal4转录因子获得功能，即BD结构域识别DNA上的特异序列并使AD结构域定位于所调节的基因上游，AD结构域同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因转录。因而酵母双杂交可以检测两个独立的蛋白是否可以发生相互作用，此外，也可以利用该系统在蛋白质文库中筛选与已知蛋白相互作用的蛋白或蛋白结构域，探索和发现新的相互作用的蛋白。

2、噬菌体展示技术（PDT）

噬菌体展示技术是在噬菌体展示肽库建立之后才开始广泛应用到蛋白质相互作用研究的，是研究蛋白质-配体相互作用的有利技术。1985年，美国Smith 博士等人将RI核酸内切酶基因片段连接到丝状噬菌体fd编码的次要外壳蛋白的

基因3中，成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体颗粒。这一实验的成功标志着噬菌体展示技术的诞生。

这种方法的一般过程是：将肽或蛋白质融合到M13丝状噬菌体的外壳蛋白质—基因Ⅲ或Ⅷ编码的蛋白质g3p和g8p的N端。噬菌体展示技术最大的特点在于被展示在噬菌体表面的多肽或者蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物活性，建立起基因型与表现型之间的一致性。

噬菌体展示技术是在深刻理解噬菌体遗传学和生理学特性的基础上产生的，其基本原理是：将待筛选的蛋白基因插入到噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因8或基因3之间，构建成融合蛋白噬菌体文库，表达的融合蛋白可以呈现在噬菌体表面，而不影响噬菌体的完整性。每个噬菌体粒子只展示一种序列的外源肽链，不同噬菌体粒子展示不同序列的外源肽链。利用目的蛋白与特异配基的亲和力，筛选和配基特异结合的蛋白质。

3、免疫共沉淀技术

免疫共沉淀是以抗原和抗体特异性结合为基础，用于研究蛋白之间相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。单细胞在非变形条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质--蛋白质间的相互作用被保留下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。蛋白质Y的沉淀是基于与X的物理性相互作用，被称为免疫共沉淀。

免疫共沉淀研究蛋白质相互作用的基本原理是：首先，根据抗原与相应抗体的特异性结合原理在细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱得到免疫复合物；其次；对收集到的蛋白质免疫复合物进行SDS—PAGE及蛋白质印记分析。

4、融合蛋白亲和色谱法

为了更有效地利用蛋白质亲和色谱，可以将待纯化的蛋白以融合蛋白的形式表达，即出现了融合蛋白亲和色谱法。融合蛋白亲和色谱法的基本原理是首先将“诱饵”蛋白吸附在相应的亲和柱上，当细胞抽提液经过该柱时，与“诱饵”蛋白有相互作用的“猎物”蛋白被吸附，进一步利用洗脱剂将吸附的蛋白复合物洗脱进行鉴定。通常将“诱饵”蛋白与一种利于纯化的蛋白标签融合表达。

融合蛋白亲和色谱法具有高通量、高选择性的特点，由于融合蛋白的多样性以及表达系统的多样性，该方法能够研究蛋白质在复杂体系中的相互作用。但该方法能否成功的应用取决于是否能够得到足够多的保持蛋白质活性的重组融合蛋白，以及如何避免内源性诱导蛋白的干扰。

5、融合蛋白沉降技术（pull—down技术）

融合蛋白沉降技术是一种体外研究两个或多个蛋白质之间相互作用的方法。根据“诱饵”蛋白的标签不同，pull—down通常分为GST pull—down分析、MBP pull—down分析和His pull—down分析等。pull—down通常用来验证两个蛋白质是否有相互作用，往往是对其他研究方法如酵母双杂交、噬菌体展示等筛选出的带白纸相互作用，进行进一步的鉴定。

Pull—down技术是一种亲和层析技术，为沉降或纯化潜在的结合蛋白提供了技术平台。pull—down技术与免疫沉淀技术很相似，区别是前者使用的是“诱饵”蛋白而后者使用的是抗体。在进行pull—down分析时，带有标签的“诱饵”蛋白通过该标签与固定于亲和介质的配体特异性的结合，构建一个可捕获和沉降与“诱饵”蛋白相互作用的蛋白的“二级亲和介质”。含有固定“诱饵”蛋白的“二

级亲和介质”可以和各种各样的捕获蛋白样品孵育，然后洗脱诱饵—捕获物蛋白复合物，进行SDS—PAGE凝胶电泳分离，通过免疫印记的方法进行检测或通过质谱鉴定捕获蛋白。

6、荧光共振能量转移（FRET）

1948年Forster首次提出荧光共振能量转移理论，即一堆合适的荧光团可以构成一个能量供体和能量受体对，它们之间由于偶极-偶极耦合作用，激发供体分子的光子能量可被传递至受体分子，而后受体分子通过发射出光子而松弛。其直观表现为：如果两个荧光团相距在1~10nm之间，且供体的发射光谱与受体的吸收光谱有重叠，当供体被入射光激发时，可将其能量传递给受体分子，供体分子衰变到基态而不发射荧光，受体分子由基态跃迁到激发态，再衰变到基态同时发射荧光。这一过程称为荧光共振能量转移。

与酵母双杂交、免疫共沉淀及质谱技术相比，FRET方法的特点是适用于活细胞和固定细胞的各类分子，灵敏度和分辨率高，并能清晰成像，可直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息。

7、表面等离子共振（SPR）

表面等离子共振技术已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。

8、蛋白芯片技术

作为规模化功能蛋白质组学研究的手段的蛋白质芯片技术，是DNA芯片技术的扩展，记载固体支持表面高密度地固定化排列探针蛋白点阵，以特异地捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测对靶蛋白进行定性或定量分析。蛋白质芯片技术主要用于进行自动化分析，支持高通量快速筛选。

9.展望

集体细胞内蛋白质之间相互交叉作用形成网络，构成各项生理活动的基础。因此了解，阐明蛋白质之间相互作用机制意义重大。从近期国际上蛋白质研究的发展动向可以看出，揭示蛋白质之间的相互作用关系，建立相互作用的网络图，已成为蛋白质研究领域中的热点，覆盖了从微生物到动植物的各个领域。出于研究的需要，各种新的研究技术不断涌现，尤其随着生物信息学的出现，多种方法技术并存，相互间交叉互补，已愈来愈成为研究蛋白质相互作用研究方法的主要特点，对于准确理解蛋白质功能，解开各种细胞活动的奥秘具有重大的意义，势必会推动蛋白质研究方法的进一步发展。

参考文献

王玉飞，张影，贾雷立.2010.蛋白质相互作用实验指南.北京：化学工业出版社

李玉华.2011.蛋白质分析实验技术指南.北京：高等教育出版社

王克夷.2007.蛋白质导论.北京：科学出版社