蛋白质组学在鼻咽癌临床分型的应用

蛋白质组学技术及其在鼻咽癌临床分型研究中的应用

陈艳，田道法

（湖南中医药大学中西医结合学院，湖南长沙 410007）

摘要：蛋白质组学技术的应用日益广泛，并在向临床实际应用发展，包括临床标本的检测性研究及相关疾病的诊断与分型等。本文对于蛋白质组学技术及其在鼻咽癌临床分型研究中的应用情况进行综述，以介绍并推进该类技术在肿瘤临床上的应用。

鼻咽癌是来源于鼻咽上皮组织的恶性肿瘤，其死亡率约占全部恶性肿瘤死亡率的2.81％，居第八位；在头颈部恶性肿瘤中，鼻咽癌的发病率则居首位。早期转移是鼻咽癌的显著临床特征之一，是由鼻咽癌细胞的特殊生物学特性所决定的，是造成患者病情恶化的主要原因。尽管人们一直在探索鼻咽癌的发病机制，但鼻咽癌的发病机制还不十分清楚。大量的研究结果表明[2-3]，肿瘤的发生发展是多基因参与、多阶段发展的病理过程,涉及大量不同种类和性质蛋白质的功能活性。肿瘤发生发展过程中,细胞恶变前后的蛋白质组表达情况发生了非常复杂的变化，普通生化分析技术很难把握其全貌。应用蛋白质组学研究技术分析比较肿瘤发生过程中的蛋白质组变化,就可以比较全面地分析某一时间断面相关蛋白质总体变化趋势，有利于发现肿瘤相关特异性蛋白质,不仅为肿瘤诊断提供分子标志,也可能为肿瘤的治疗和药物开发提供可靠靶标。

蛋白质组是指某一物种、个体、器官、组织或者细胞基因组的全部蛋白质产物的表达谱，或称一种细胞内存在的全部蛋白质。澳大利亚的两位学者Wilkins和Williams在1994年首先提出了蛋白质组(proteome)的概念，即基因组所表达的全部蛋白质，是细胞、组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质。蛋白质组学(proteomics)是研究细胞内全部蛋白质的组成及其规律的科学。

蛋白质组学研究已广泛应用于肿瘤生物学标记物的筛选和鉴定、肿瘤分类、治疗及肿瘤发生机制等领域。利用功能蛋白质资料，可以解释肿瘤的癌变机理，且对

筛查可疑病例、早期诊断、病情监测、预后评估具有很大的临床意义。比较正常细胞与疾病细胞之间的差异表达蛋白质谱，寻找与疾病发生发展相关的关键蛋白质，有助于深人探讨疾病的发生机制；通过质谱分析等技术确认差异蛋白质，可以为疾病提供早期诊断标志物。

一．蛋白质组学技术

蛋白质组学的核心在于大规模地对蛋白质进行综合分析, 通过对某一物种、个体、器官、组织或细胞的全部蛋白质生物学特性(包括表达水平、结构、翻译后修饰、细胞内定位、蛋白质相互作用) 的研究, 可以对蛋白质所执行的生理性、病理性活动作出精细、准确、本质性的阐述[4]。蛋白质组学最有价值的优势，是它可以在一个实验中观察一个完整的蛋白质或蛋白质亚型在特定的时间下, 其生理或病理状态中所发生的相应的变化[5]。蛋白质组学的研究内容包括: ①针对已知基因及转录数据库的生物体、组织及细胞, 建立相应蛋白质组或亚蛋白质组数据库(蛋白质表达谱) 及其蛋白质组连锁群; 识别执行关键生命功能的多种蛋白质复合物并分析控制这些多蛋白质复合物的基因调控网络的特征; ②以重要的生命过程或人类一些重大疾病为对象, 进行重要的生理和病理体系或过程的研究, 即比较蛋白质组学研究；③蛋白质组学支撑技术平台和生物信息学的研究。

蛋白质组学研究的一般过程，首先是获取细胞或组织样品，然后进行样品制备；通过二维凝胶电泳(2D—PAGE)对样品蛋白质进行大规模的群体分离，借助计算机辅助分析软件，确认2D—PAGE图谱上的差异表达蛋白质；继而利用准确的切取技术，获得2DE胶上感兴趣的差异蛋白质斑点，再对此凝胶块进行酶解消化，分离纯化蛋白质，在质谱仪上进行质谱分析，获得肽指纹图及其相关数据；然后进行数据库检索，对蛋白质种类及相关理化特性和功能活性进行鉴定；最后分析蛋白质在细胞与组织中的表达及其生物学意义。

常用样品来源有：体外培养细胞、活体组织标本、血清和体液等等。

样品制备与蛋白质分离：双向凝胶电泳2-DE于1975年由O’farrll等[6]创立，主要应用于蛋白质的大规模分离。2D-PAGE主要过程包括样品制备、水化与等电聚焦、胶条的平衡及SDS-PAGE等步骤。其基本原理，是先从组织和细胞中获得蛋白质，通过pH梯度(immobilized pH gradient)凝胶电泳，根据蛋白质电荷差异分离出不同pI

值的蛋白质条带，再将此胶条经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，按蛋白质分子质量大小而加以分离。固相pH梯度凝胶电泳技术的发展，使得2-DE的稳定性和可重复性得到明显改善[7]。

SDS-PAGE运行结束后，蛋白质样品经过双向电泳而得以分离，然后就要凝胶进行染色，再于凝胶图象分析仪上进行蛋白质分离结果的分析。常用染色方法有考马斯亮蓝染色、银染色。染色完毕后，利用计算机软件对2-DE凝胶图像进行分析，如PD-QUEST软件、LIPS、HERMES、GEMINI等，并对凝胶图像上的蛋白质斑点进行匹配，经过对图像进行的数字化处理等程序，最后获得差异表达蛋白质的相关数据，然后就可以对感兴趣的蛋白质斑点进行质谱分析。

生物质谱分析：对于双向电泳中感兴趣的差异表达蛋白质斑点，可以将其从聚丙烯酰胺凝胶中切下，经过酶解纯化后，采用生物质谱进行分析鉴定而获得肽指纹图。其基本原理，是在样品分子离子化后，根据不同离子之间的荷质比（M/E）的差异来分离并确定其分子量。对于经过双向凝胶电泳分离的目标蛋白质，先采用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的－C端形成肽健）成肽段，再应用质谱技术分别对这些肽段进行鉴定与分析。

目前常用的质谱分析技术包括两种，即基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALD1-TOF-MS）和离子阱质谱（ESI-MS）。其基本原理，是将大分子待测样品与基质混合，通过基质分子吸收激光能量，转化为系统的激发能，导致大分子样品的电离和气化，生成的离子在真空无场区飞行并到达检测器，不同荷质比的离子到达检测器的时间不同从而得到该蛋白质的肽质指纹PMF[8]。实验所得肽谱数据与数据库进行匹配，再采用一定的方法对匹配结果进行打分和排序，最后根据分值高低，利用系列相应软件在序列信息库查找并鉴定蛋白质，以确定其种类及相关数据[9,10]。

二．蛋白质组学技术在肿瘤学研究领域中的应用

在后基因组学时代, 现代医学面临着严峻的挑战, 即如何在分子水平剖析肿瘤发生发展过程中的相关事件。与基因组学不同, 蛋白质组学的目的是研究蛋白质的表达和蛋白质的功能, 以使研究者更好地探索肿瘤的生物学本质及相关分子机制

[11]。目前的研究表明,有大量的蛋白质分子参与了肿瘤细胞周期、凋亡及转移的调控

[12]。实践证明, 蛋白质组学研究将为肿瘤的早期诊断、肿瘤标志物的筛选与鉴定、

抗肿瘤药物的筛选及开发探索新的治疗靶标, 提供新的平台[13]。近年来蛋白质组学在肿瘤标志物的筛选和鉴定中应用最为广泛。蛋白质组学在肿瘤的诊断与治疗方面具有广泛的临床应用前景，它主要通过运用蛋白质分离分析技术比较正常组织和肿瘤组织的差异，从中发现肿瘤的早期标志蛋白分子，并建立相应的疾病诊断模型 [14]。

蛋白质组学研究已在多种肿瘤中展开，已经涵盖了包括乳腺癌[15]、肺癌[16]、膀胱癌[17]、肝癌[18]、卵巢癌[19]、等的大多数肿瘤，获得了大量有用的蛋白质组数据，并建立了一些相应的数据库。

三．蛋白质组学技术在不同类型鼻咽癌细胞生物学行为特性研究中的应用

鼻咽腔位于鼻腔后方﹑第1和2颈椎的前方﹑蝶骨底或枕骨基底部的下方，呈不规则的立方体，垂直径约5.5～6.0 cm，横径约3.0～3.5 cm，前后径为2.0～3.0 cm。鼻咽与其周围组织的关系密切而又复杂。鼻咽上邻颅底，下接口咽，侧联中耳，前通鼻腔，后贴颈椎，可谓四通八达。因此，鼻咽癌引起的症状比较多样化[1]。鼻咽癌的局部生长方式是以浸润性蔓延为主，但在不同个体，其发展有一定的倾向性。在临床上，肿瘤局限于鼻咽部即为鼻咽型；病变向上发展，出现Ⅱ﹑Ⅲ﹑Ⅳ﹑Ⅴ﹑Ⅵ对颅神经损害和/或颅底骨质破坏，但不伴有颈淋巴结转移，此为上行型，亦称颅神经侵犯型；往下发展，可以表现单侧或双侧颈部单个或多个淋巴结转移性肿大，不伴有前组颅神经受累或颅底骨质破坏，但可以出现Ⅶ、Ⅷ--Ⅻ颅神经受损症状，此为下行型，亦称颈部肿块型或颈淋巴结广泛转移型；既表现有前组颅神经受累和/或颅底骨质破坏，又出现单侧或双侧颈淋巴结转移，兼有上行、下行两型情况者, 为上下行型，也称混合型。

大量的研究资料表明，鼻咽癌的发病具有一定的遗传倾向，是一种多基因遗传相关性疾病。应用蛋白质组学技术，直接从蛋白质表达谱角度入手来研究鼻咽癌的相关问题，并与鼻咽癌细胞基因组的相应变化情况相印证，将更全面、真实地揭示鼻咽癌变的过程和本质。

Guo等[20]应用SELDI-TOF-MS及人工神经网络技术分析了上行型及下行型鼻咽癌58例患者的血清蛋白质，得到11个潜在的生物标记物，对不同类型肿瘤的区分率达到90%。此外，Cho等[21]通过对鼻咽癌复发患者、肺癌患者、单纯性甲状腺肿大患者及正常人的血清进行蛋白质谱分析，识别出两种分子量分别为11.6 kDa和11.8 kDa

的同型血清淀粉样A蛋白，它们与鼻咽癌的复发倾向呈正相关，可以作为一种有效监测鼻咽癌复发趋势的肿瘤标志物。王晖[22]等观察不同类型鼻咽癌细胞系中蛋白质表达的差异，认为放射生物学特性不同的鼻咽癌细胞系中，存在差异表达蛋白，其中p73可能成为预后预测的侯选标志物。孙懿[23]等用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析和电喷雾串联质谱。在鼻咽癌细胞中验证鉴定了22个差异表达蛋白质。并认为它们可能作为p53功能相关蛋白质，为阐明鼻咽癌中p53蛋白聚集及失活的机制提供了重要依据和线索。向亚莉[24]等运用蛋白质组学技术，建立了5-8F和6-10B分泌蛋白质的2-DE图谱，质谱分析鉴定出14个非冗余的分泌蛋白质，作为研究NPC转移机制以及筛选NPC转移分子标志物的实验依据。张文静[25]等用蛋白质组学技术筛选鼻咽癌的甲基化失活基因，认为15个5-aza-2-dC处理后表达上调蛋白质的编码基因可能是5-8F细胞的甲基化沉默基因。周异群[26]等研究人鼻咽癌细胞CNE一2L2恶性生物学行为相关的蛋白，认为高与低恶性生物学行为细胞间有l2个差异表达蛋白质，CD44表达减弱与As细胞的恶性行为减弱相关。但是，这些结果或现象，都还需要组织蛋白质组学的进一步证实。刘宇勤等对下行型鼻咽癌原发灶组织细胞核的亚细胞蛋白质组学特征及其中医证型之间的关系研究下行型鼻咽癌不同中医证型差异蛋白表达核蛋白点的质谱分析，正常分析了气血凝结型组织样本223号核蛋白二维电泳凝胶斑点和火毒困结型组织样本20号核蛋白二维电泳凝胶斑点，并初步验证了223号和20号蛋白质的相关生物学意义。

四．结语

利用蛋白质组学技术，可以全面、动态地分析肿瘤患者血清样品、肿瘤细胞分泌物、肿瘤组织间隙中混合蛋白质的种类及数量的改变，并通过探讨其在肿瘤发生、发展过程中的动态变化及分子作用网络，有利于进一步阐明肿瘤的发病机制，寻找可以应用于肿瘤诊断、治疗及预后评估的特异性标志物，并可以促进抗肿瘤新药的开发[27,28]。不同类型的的鼻咽癌细胞，其细胞生物学特性显然差异极大，预后与应该采用的治疗方式也应该有所不同。应用蛋白质组学技术深入探讨其分子基础，将有利于早期诊断和个体化治疗。

参考文献：

[1] 闵华庆,洪明晃,郭翔.鼻咽癌[M].北京:中国医药科技出版社,2003; 92

[2] Jones P A．Epigenetics in carcinogenesis and cancer prevention[J]．Ann N Y Acad Sci，2003，

983：213-219．

[3] Herman J G，Baylin S B．Gene silencing in cancer in association with promoter

ypermethylation[J]．N Engl J Med，2003，349(21)：2042-2054．

[4] Blackstock W,Mann M. A boundless future for proteomics.Trends iotechnol , 2001 , 19 (suppl) :

s1-s2.

[5] He QY, Chiu J F. Proteomics in biomarker discovery and drug develoment . J Cell

Biochem ,2003 ,89(5) :868286.

[6] O’FARRELL PH，GOODMAN HM．Resolufino of simian virus 40 proteins in whole cell

extracts by two-dimensional electrophoresis：heterngeneity of major capsid[J]．cell，1976，9(2)：289—298．

[7] GLLESPIE M．Allfordable proteomics：the two-hybird systems[J]．Curr Opin MolTher，2003，

5(3)：266-270．

[8] Zhang W，Czemik AJ，Y ungwirth T,et a1．Matrix-assisted laser desorption mass

spectrometric peptide mapping of proteins separated by tw o-dimensional gel electrophoresis：Determination of phosphorylation in synapsin I[J]．Prote／n Sci，1994，3(4)：677—686．[9] Chamrad DC，Korting G，Stuhler K，et o2．Evaluation of algorithms forpmtein identification

from sequence databases using mass spectrometry data[J]．Proteome．2004．4(3)：619—628．[10] V on Eggeling F，Davies H，Lamas L，et a1．Tissue-specific microdissection coupled with

proteinchip array technologles：applications in cancer research[J]．Biotechniques，2000．29：

1 066— 1 070．

[11] Mocellin S , Rossi CR , Traldi P , et al . Molecular oncolo－gy in the post2genomic era : the

challenge of proteomics. Trends Mol Med , 2004 , 10 (1) : 24－32

[12] Livingston DM , Shivdasani R. Toward mechanism2based cancer care. JAMA , 2001 , 285 :

588－93.

[13] Petricoin EF ,Liotta LA. Clinical applications of proteomics. JNutr , 2003 , 133 (7 Suppl) : 2

476S－84S.

[14] HoebenaA，Landuyt B，Botrus G，et a1．Proteomics in cancer research：Methods and application

of array—based protein prefiling technologies [J]．Analytiea Chimica Acta，2006，564(1)：19—33．

[15] Zhang GQ，DU J，Pang D．Detection and clinical significance of serum proteomic patterns of

breast cancers by surface enhanced laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry．Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2006，28(3)：204 —207．

[16] Wu X，Xiao Z，Chen Z，et a1．Differential analysis of two—dimension gel electrophoresis

profiles from the normal—metaplasia1—dysplasia—carcinoma tissue of human bronchial

epithelium[J]．Pathol Int，2004，54(10)：765-773．

[17] 吴登龙,张元芳,关明,等.蛋白质芯片技术筛选膀胱癌尿液标记物的研究.中华泌尿外科

杂志，2004，25(7)；453—455．

[18] Fung ET,Yip TT,Lomas L,et al.Classification of cancer types by Measuring variants of host

response proteins using SELDI serum assays.IntJ Cancer,2005,115(5):783-789

[19] Yokoyama Y，Kuramitsu Y，Takashima M，et a1．Proteomic profiling of proteins decreased in

hepatocellular carcinoma from patients infected with hepatitis C virus．Proteomics，2004，4(7)：21ll-l6．

[20] Guo X，Cao SM，Y u JK，et al．Distinct serumal proteomic patterns between ascending and

descending types of loco-regionally advanced nasopharyngeal carcinoma assessed by surface enhanced laser desorption ionization and analyses．Chin Med J (Engl)，2005，118：1912-1917．[21] Cho WC，Yip TT，Yip C，et al．Identifi cation of serum amyloid a protein as a potentially useful

biomarker to monitor relapse of nasopharyngeal cancer by serum proteomic profi ling．Clin Cancer Res，2004，10：43-52．

[22] 王晖,柳亦松,曾亮,等.用蛋白质组学技术分析鼻咽癌细胞系放射生物学特性的初步结果.

中华放射肿瘤学杂志,2007,16(4):294-296.

[23] 孙懿,易红,杨铁轩,等.应用蛋白质组学和RNAi技术筛选鼻咽癌细胞中p53功能相关蛋白质.

生物化学与生物物理进展,2007,34(7):760-769.

[24] 向亚莉,易红,李茂玉,等.鼻咽癌转移相关的分泌蛋白质的筛选.国际病理科学与临床杂

志,2007,27(5):369-373.

[25] 张文静,易红,李茂玉,等.5-aza-2-dC处理鼻咽癌细胞前后的差异蛋白质组学研究. 国际

病理科学与临床杂志,2007,27(4):277-283.

[26] 周异群,时岩,田云,等.与鼻咽癌细胞CNE-2L2恶性生物学行为相关的蛋白质.基础医学与

临床.2007,27(4)364-371

[27] Xiao Z，Luke BT，hmirlian GO，et a1．Serum proteomic profiles suggest celecoxib—modulated

targets and response predictors[J]．Cancer Res，2004，64(8)：2904— 2909．

[28] Petricoin EF，Rajapaske V，Herman EH，et a1．Toxieoproteomies：serum proteomie pattern

diagnostics for early detection of drug induced cardiac toxieities and cardioprotection[J]．Toxieol Pathol，2004，32(Suppl 1)：122 130．