药物生物合成原理复习题1

基因工程、代谢工程部分：

名词解释：

1、基因工程的基本定义?

在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。

2、限制性核酸内切酶

识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链。主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵。

3、质粒

质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。

4、质粒的不相容性

任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。

5、分子杂交技术

不同来源的单链DNA或RNA，通过碱基配对形成异质双链核酸分子的过程。包括DNA与DNA、DNA与RNA，RNA与RNA之间的杂交。

6、鸟枪法

随机获得供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。

7、基因文库

从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式

存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：基因组文库（含有全部基因）和cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）8、cDNA文库用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA

用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA

9、包涵体

在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。

10、融合蛋白

除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。

11、宏观逃逸率

当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为称为重组质粒的宏观逃逸率。

12、初级代谢产物

是指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。

13、次级代谢产物

是指生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是该生物生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。

14、分解代谢阻遏

当微生物在含有两种能够分解底物的培养基中生长时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶的合成的现象。

15、营养缺陷型突变株:由于合成途径中某一步骤发生缺陷，终产物不能积累，这样就解除了终产物的反馈调节，使中间产物积累或另一分支途径的末端产物得以积累。

16、渗漏缺陷菌型突变株:渗漏缺陷型突变株（leakage mutant）是指遗传性障碍不完全的缺陷型。由于这种突变是使它的某一种酶的活性下降而不是完全丧失，因此，渗漏缺陷型能够少量合成某一种代谢终产物，能在基本培养基上进行少量的生长。由于渗漏缺陷型不能合成过量的终产物，所以不会造成反馈抑制而影响中间代谢产物的积累。

17、累积反馈抑制:在分支代谢途径中，任何一种末端产物过量时都能按一定百分比单独抑制共同途径中的第一个酶，而且各种末端产物的抑制作用互不干扰。当各种末端产物同时过量时，它们的抑制作用是累加的。各末端产物之间既无协同效应，亦无拮抗作用。

18、同工酶:具有不同分子形式但却催化相同化学反应的酶称为同工酶

19、操纵元:操纵元是指结构上、功能上、协同作用的相关基因组成的一个片段（区域），是基因表达和控制的一个完整单元。

20、代谢工程:采用重组DNA技术和高精度的分析生物学技术相关的遗传学方法，进行精确目标的基因操作，改变微生物原有调节系统，实现提高目的代谢活性和目的代谢产物量。

21、柔性位点

简答题

1、质粒构建的步骤

质粒构建“切、接、转、增、检”五步①DNA的体外重组（切、接）

②重组DNA分子的转化和扩增（转、增）③转化子的筛选和鉴定（检）

2、细菌基因转移的方法

3、植物细胞基因转移的方法

DNA间接转化法：农杆菌介导基因转移

DNA直接转化法：（1）基因枪转化法（2）电击法（3） PEG介导基因转化法

4、质粒转入哺乳动物细胞的方法

①磷酸钙共沉淀法②电击转化法③脂质体介导法④哺乳动物细胞的病毒转染法⑤血影细胞介导法⑥显微注射法

5、基因工程的支撑技术

1、核酸凝胶电泳技术

2、核酸分子杂交技术

3、细菌转化/细胞转染技术

4、DNA序列分析技术

5、聚合酶链反应（PCR）技术

6、影响质粒转化率的因素

1、载体及DNA重组分子方面：

载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级

插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低

2、受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配

3、转化方法方面：受体细胞的预处理：影响最大, 供受体的比例, 转化方法

7、受体细胞应具备的条件

①限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷

②重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞

③具有较高的转化效率

④具有与载体选择标记互补的表型

⑤感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外

8、解决密码子偏爱性的两种策略:外源基因全合成:按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法

同步表达相关tRNA编码基因: 对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。

9、在一个宿主中同时表达两个基因的两种策略。

10、包涵体形式表达目的蛋白的优缺点

包涵体表达形式的优点：

①能简化外源基因表达产物的分离操作

包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来

②能在一定程度上保持表达产物的结构稳定

在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁

包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。

11、融合形式表达目的蛋白的优缺点

1、目的蛋白稳定性高尤其对分子量较小的多肽效果更佳

2、目的蛋白易于分离利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白

3、目的蛋白表达率高与受体蛋白共用一套完善的表达元件

4、目的蛋白溶解性好由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能

在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性

5、目的蛋白需要回收融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段

12、微生物代谢的主要特点

（1）代谢旺盛

（2）代谢极为多样化（微生物类型、产物、途径）

（3）代谢的严格调节和灵活性

13、微生物代谢调节的四个举措

酶合成的调节酶活性的调节能荷的调节细胞膜透性的调节14、许多具有工业重要性的酶都受分解代谢物阻遏的调节控制，如何克服此调节作用?

①生产培养基内不使用阻遏性碳源，将有利于对分解代谢物阻遏敏感的酶的生产。

②选育耐（抗）分解代谢阻遏的突变株。

15.反馈抑制作用的解除：实质是使代谢途径中的关键酶（别构酶）的调节亚基的结构基因发生突变，使末端产物或其类似物不再与别构中心结合，从而解除反馈抑制，积累末端产物；

16.反馈阻遏作用的解除：实质是使调节基因或操纵基因发生突变，使调节蛋白改变或不发生，调节蛋白不再与末端产物相结合，或结合后的复合物不能同操纵基因结合，从而解除了末端产物对酶合成的阻遏；

17、细胞内酶的种类及其特点；(一) 细胞内酶的种类:根据酶的生成

是否与环境中所存在的该酶底物或其有关物的关系，把酶划分成：组成酶（constitutive enzyme）：微生物的细胞中一直存在的酶，合成只受遗传物质的控制，它们的合成速度是恒定的。如：糖酵解途径的一些酶。

诱导酶（inducible enzyme）：只有环境中存在某种物质的情况下才能合成、存在的酶，它的合成受基因与诱导物共同控制。如：乳糖酶。

18、微生物代谢人工控制的目的和措施是什么:

目的人为地打破微生物细胞内代谢的自动调节，使细胞最大限度积累对人类有用的代谢产物。

措施改变微生物遗传特性——代谢控制育种

控制生产过程中各种条件——代谢控制发酵

19、发酵工业上用的菌株对细胞透性的要求；容许营养物质进入细胞 ;对中间产物的透性不大;目的产物形成后可以尽快透过细胞膜进入环境

20、提高细菌细胞膜通透性的方法

（1）抗Vp类衍生物突变株

（2）选育溶菌酶敏感性突变株

（3）选育二氨基庚二酸缺陷突变株

（4）选育温度敏感突变株

论述题

1、核酸的凝胶电泳技术的基本原理？

①带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。②电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。③电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。④摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。⑤如果电场强度一定(电压和电极距离)、电泳介质相同(电泳液和凝胶)：分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。

2、以pUC18质粒为例学习读懂质粒上各部分的所代表的功能区域。pUC18 / 19：

BamHI

EcoRI SstI KpnI SmaI XbaI SalI PstI SphI HindIII

装有多克隆位点（MCS）

正选择颜色标记 lacZ’

用于基因克隆和测序

3、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母分别作为宿主细胞的优缺点。

大肠杆菌：

遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定。

产生结构复杂、种类繁多的内毒素

适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌

枯草芽孢杆菌：

遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素

遗传欠稳定，载体受体系统欠完备

适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌酵母：

具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定

内源性蛋白产物种类繁多且含量高

适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌

4、基因工程菌遗传不稳定性的机制及其改善策略

不稳定的产生机制：①受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解②外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢③重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配（这是重组质粒

逃逸的基本原因）④受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排

改善基因工程菌不稳定性的策略：

1、做好细胞保藏工作：①建立原始细胞库②建立工作细胞库

2、施加选择压力：①根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素②根据载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份

3、控制目的基因的过量表达：①使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度②使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数

4、优化基因工程菌的培养工艺：①培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定②培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定

5、简述或者画图描述cDNA文库的构建流程。

6、叙述或者画图描述单克隆抗体的制备流程。

收集致敏的B淋巴细胞收集骨髓瘤细胞

↓

细胞融合→HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞→检测筛选阳性细胞→克隆化培养（反复3-5次）→获得稳定分泌McAb（单抗）的杂交瘤细胞株→McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）→ McAb 纯化及鉴定

7、叙述利用大肠杆菌重组表达人胰岛素的构建流程。

胰岛素的结构及其生物合成

人胰岛素的生产方法

重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建

A链和B链分别表达法:基因工程菌的构建战略：化学合成A链和B 链的编码序列

表达产物的后处理路线：B链中第22位上的Arg和第29位上的Lys 由于良好折叠的原因，对胰蛋白酶不敏感

分泌型重组人胰岛素表达法上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只能以包涵体的形式存在于胞质中。一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列与b-內酰胺酶基因拼接，b-內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。

8、合成代谢与分解代谢的定义及相互关系

分解代谢：指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系的催化，产生简单分子、腺苷三磷酸（ATP）形式的能量和还原力（或称还原当量，一般用[H]来表示）的作用。

合成代谢：指在合成代谢酶系的催化下，由简单小分子、ATP形式的能量和还原力一起合成复杂的大分子的过程。

微生物通过分解代谢从环境中吸收的各种碳源、氮源等物质降

解，为生命活动提供能源和小分子中间体。合成代谢所利用的小分子物质来源于分解代谢过程中产生的中间产物。分解代谢与合成代谢是互相关联、互相制约，是生命活动的基础。

9、初级代谢与次级代谢的主要区别

1、存在范围及产物类型不同

不同的微生物可产生不同的次级代谢产物，相同的微生物在不同条件下产生不同的次级代谢产物

2、对产生者自身的重要性不同

初级代谢产物，是机体生存必不可少的物质。次级代谢产物对产生者本身来说，不是机体生存必需的物质。

3、同微生物生长过程的关系明显不同

初级代谢自始至终存在于一切生活的机体中，同机体的生长

过程呈平行关系；次级代谢则通常是微生物的对数生长期末期或稳定期产生的，它与机体的生长不呈平行关系，一般可明显地表现为机体的生长期和次级代谢产物形成期两个不同的时期。

4、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同

初级代谢产物对环境条件的变化敏感性小（即遗传稳定性大），催化初级代谢产物合成的酶专一性强，相对较为稳定。次级代谢产物对环境条件变化很敏感，其产物的合成往往因环境条件变化而停止。

5、某些机体内存在的二种既有联系又有区别的代谢类型

10、酶合成调节和酶活性调节的比较

11、微生物反馈控制体系的调节分为反馈抑制和反馈阻遏，简述二者的区别和联系。

（1）定义上的区别

反馈抑制：是指代谢途径的终产物对催化该途径中的一个反应（通常是第一个反应）的酶活力的抑制。其实质是终产物结合到酶的变构部位，从而干扰酶和它底物的结合。与此相反为酶活性的激活。

反馈阻遏：是指终产物（或终产物的结构类似物）阻止催化该途径的一个或几个反应中的一个或几个酶的合成。其实质是调节基因的

作用。与此相反有酶合成的诱导。

12、为什么选育抗代谢类似物的突变株能提高产物浓度？

13、能够解除微生物正常代谢控制机制的突变株具体有哪些？

（1）营养缺陷型菌株。由于合成途径中某一步骤发生缺陷，终产物不能积累，这样就解除了终产物的反馈调节，使中间产物积累或另一分支途径的末端产物得以积累。

（2）抗反馈调节的突变株。突变株不再受正常反馈调节作用的影响，使终产物得以积累。

（3）细胞膜通透性突变株。终产物在细胞内不能积累到引起反馈调节的浓度。

（4）营养缺陷型回复突变株或条件突变株，解除终产物对关键酶的

调节。

（5）应用遗传工程技术，创造理想的超微生物，即构建目的工程菌株。

14、试述该调节模式的类型及其调节特点。

顺序反馈抑制

分支代谢途径中的两个末端产物，不能直接抑制途径中的第一个酶Ea，而是分别抑制分支点后的Eb和Ec，造成中间产物C的积累，高浓度的C再反馈抑制Ea。因此，只有当两个末端产物都过量时，才能对途径中的第一个酶起到抑制作用。