马尾松胚性细胞悬浮增殖培养体系的建立_史昆
V ol. 34 No. 1Jan. 2014
第34卷 第1期2014年1月 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology 收稿日期：2013-09-20
基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）课题（2011AA100203），湖南省自然科学基金项目（11JJ3038），国家自然科学基金青年项目（31200481），教育部博士点基金博导类联合资助项目（20104321110002）
作者简介：史 昆（1988-），男，山西大同人， 硕士研究生，研究方向：林木种苗培育与理论
通讯作者：杨模华（1974-），女，湖南常德人，副教授，博士，研究方向：林业生物技术、森林培育教学和科研；E-mail ：ymh163@https://www.360docs.net/doc/c04017817.html,
马尾松Pinus massoniana Lamb.是我国南方亚热带地区最重要的人工造林先锋树种之一，是南方营建用材林、松脂林的主栽树种[1]。近30年来马尾松的遗传改良一直得到广泛地关注[2]。林木
优良基因型的无性快繁及其利用在缩短林木育种周期，提高育种效率等方面具有绝对优势，体细胞胚胎发生植株再生是针叶树优良基因型无性扩繁的一种有效途径，马尾松无性快繁及体细胞胚
马尾松胚性细胞悬浮增殖培养体系的建立
史 昆1a,1b ，杨模华1a,1b ，李志辉1b ，张冬林1b,2，王 茜1b ，丁贵杰3
（1.中南林业科技大学 a.林业生物技术湖南省重点实验室；b.林学院，湖南 长沙 410004；2.乔治亚大学，美国 乔治亚州 30602；3.贵州大学 林学院，贵州 贵阳 550000）
摘 要：本研究利用马尾松未成熟胚诱导的胚性愈伤组织，首次建立马尾松胚性愈伤组织悬浮增殖培养体系。实验中定期对细胞生长参数沉淀细胞体积(SCV)、细胞活力进行了测定，研究了初始接种量，继代细胞密度对悬浮增殖培养体系建立的影响。研究结果表明：不同初始接种量、继代转接细胞密度显著地影响马尾松胚性细胞悬浮培养的效果；在悬浮培育过程中，胚性细胞的生长周期曲线呈“S ”型，细胞活力呈现先急剧上升，后缓慢下降的趋势；本研究建立的马尾松胚性细胞悬浮增殖培养体系为：在30 mL 的培养基中，初始接种1.0 g 胚性细胞（平均增殖系数达12.097），继代培育以1/6作为继代细胞密度，且继代周期为8～12 d 为宜。本研究为优化调控马尾松体细胞胚胎发生胚性愈伤组织 稳定增殖提供了技术支撑，同时为采用遗传转化及细胞融合等技术进行马尾松新品种选育奠定了研究基础。
关键词：生物技术；马尾松；胚性细胞；悬浮培养；生长曲线
中图分类号：S791.248 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2014)01-0064-05
Establishment of embryogenic suspension cultures in
somatic embryogenesis of Pinus massoniana Lamb.
SHI Kun 1a,1b , YANG Mo-hua 1a,1b , LI Zhi-hui 1b , ZHANG Dong-lin 1b,2, WANG Qian 1b , DING Gui-jie 3
(1a. Hunan Provincial Key Lab. of Forestry Biotechnology; b.College of Forestry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. University of Georgia, GA 30602, USA; 3. College of Forestry, Guizhou University, Guiyang
550000, Guizhou, China)Abstract: The objective of the study was to establish the embryogenic tissues suspension proliferation system using the embryogenic tissues initiated from immature zygotic embryos in Pinus massoniana Lamb. (masson pine). The effects of initial tissues weight and cell density in subculture were investigated through measuring the sediment cell volume (SCV) and cell viability during the establishment of suspension proliferation system. The results showed that the growth of embry o genic tissues was signi ? cantly in ? uenced by initial tissues weight and cells density in suspension cultures; the embryogenic cells growth basically accorded with the “S ” growth curve, while the cells viability sharply increased at ? rst and gradually decreased in later. A better suspension proliferation system in masson pine embryogenic cultures was established: 1.0 g tissues per 30 mL fresh liquid media were the appropriate initial tissues weight (the mean growth rate was up to 12.097); then the better cell density in subculture was 1/6 and the appropriate subculture period was identi ? ed as 8～12 days. This study provide basic information for optimization of mass propagation in masson pine somatic embryogenesis. The establishment of suspension system is also a basic technique for new variety breeding of masson pine through genetic transformation and cell fusion in masson pine breeding.
Key words: biological technology; Pinus massoniana Lamb.; embryogenic cultures; suspension culture; growth curve
65第34卷中南林业科技大学学报
胎发生也成为很多学者的研究热点[3-7]。本研究组在前期的研究中发现，马尾松胚性愈伤组织诱导率低（10%左右）[8-9]，成为当前把马尾松体细胞胚胎发生技术应用于育种实践的首个限制因子。因此，在马尾松体细胞胚胎发生研究中，一方面继续探讨提高马尾松胚性愈伤组织诱导率的方法，另一方面寻找能把现已得到的有限胚性愈伤组织进行高效增殖培养的方式，也是弥补胚性愈伤组织诱导率低的一个可选途径。在已报道的马尾松胚性愈伤增殖研究中，常常采用固体培养基继代培养，增殖效率有限[7-9]。在林木体细胞胚胎发生中，胚性细胞系液体悬浮增殖培养是有效扩大增殖倍数，提高增殖效率的理想途径[10-11]。在建立胚性细胞悬浮培养体系中，初始接种量[12-14]及继代细胞密度[14]常常是影响悬浮培养细胞生长的重要因素，沉淀细胞体积[14](sediment cell volume，SCV)和细胞活力[15-16]常常作为衡量细胞生长增殖与细胞新陈代谢的检测指标，同时，掌握培养体系中细胞生长参数还是优化调控悬浮增殖培养细胞体系的技术基础。
本研究着重考察初始接种量、继代细胞密度（旧培养液体积/新旧培养液体积和）对马尾松胚性愈伤组织悬浮增殖培养的影响，测定马尾松胚性细胞悬浮培养周期中SCV和细胞活力的变化，绘制生长曲线，确定最佳初始接种量、继代细胞密度以及最佳的悬浮培养继代周期，从而建立高效稳定的马尾松胚性细胞悬浮增殖培养体系，为马尾松体细胞胚胎发生胚性愈伤组织的增殖、大规模生物反应器生产、马尾松基因工程遗传转化以及细胞融合新品种选育等提供技术支撑和研究基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2012年7月中旬，采集湖南安化县国家及林木良种基地马尾松种子园自由授粉的马尾松球果，无菌剥取携带未成熟合子胚的雌配子体为外植体，诱导产生可稳定增殖、生长状态良好的马尾松胚性愈伤组织，作为悬浮培养的初始材料，期间分别对2个细胞系材料取样（即细胞系1-3-1和细胞系2-3-1）。基本培养基采用改良Litvay’s液体培养基[17-18]，添加0.5 mg/L 2,4-D，0.5 mg/l 6-BA，置于(23±1)℃暗培养，摇床转速100 r/min。试验在中南林业科技大学林学院森林培育实验室于2013年3月至2013年8月进行。
1.2 试验方法
以悬浮培养一定时间后测定的沉降细胞体积(sediment cell volume，SCV)作为衡量细胞生长量大小的主要参数。SCV的测定：将培养瓶悬浮培养体系中的细胞充分悬起，无菌倒出均匀悬液10 mL于刻度试管中，室温下静置30 min，待沉淀细胞体积不再发生变化，读取沉淀细胞体积，得到该10 mL悬浮培养液中的SCV，每个母瓶中的SCV按各自比例计算得到。
1.2.1 初始接种量对悬浮培养细胞增殖的影响
对生长状态良好的胚性细胞系1-3-1愈伤组织，分别取0.5、1.0、2.0 g，接种于含30 mL新鲜液体培养基的100 mL三角瓶中，充分振荡混悬，置于恒温摇床上培养。培养7 d后，测定记录沉降细胞体积SCV1，吸取3 mL该悬液并接种于27 mL的新鲜液体培养基中，继续培养14 d后测定记录SCV2，根据2次间隔悬浮培养时间的生长量计算不同初始接种量下胚性细胞的增殖系数(SCV2×10/SCV1)，每处理重复5次。
1.2.2 继代细胞密度对悬浮培养细胞增殖的影响
取生长状态良好的胚性细胞系1-3-1 1.0 g，接种于含30 mL新鲜液体培养基的100 mL三角瓶中，充分振荡混匀，置于摇床上暗培养7 d，测定并记录沉降细胞体积SCV3。随后，分别吸取该均一悬液(3、5、10 mL)，用新鲜的液体培养基补足30 mL，继代转接旧培养液所占培养基总体积的比例分别为1/10，1/6，1/3。继续培养至14 d后测定并记录SCV4，分别计算不同继代细胞密度下胚性细胞的增殖系数，增殖系数=SCV4/(旧培养液所占比例×SCV3)，每处理重复3次。
1.2.3 马尾松悬浮培养细胞活力的测定及其生长
曲线的绘制
对细胞系1-3-1和2-3-3，分别取生长状态良好的胚性愈伤组织1.0 g，接种于含30 mL新鲜液体培养基的100 mL三角瓶中，在20 d的悬浮培养周期中，每2天测定SCV值1次，同时，采用TTC法[15-16]测定细胞活力参数OD值。每处理重复5次，每2 d测定1次，共测10次；然后根据20 d培养周期中细胞生长量参数SCV与细胞活力的动态变化绘制马尾松胚性细胞悬浮培养的生长曲线。
1.2.4 数据统计与分析
采用SPSS17.0对不同接种量以及不同继代细
史昆，等：马尾松胚性细胞悬浮增殖培养体系的建立
66第1期胞密度（新旧培养液比例）处理下的胚性细胞增
殖系数进行方差分析，LSD多重比较。
2 结果与分析
2.1 初始接种量对悬浮培养细胞增殖的影响
研究表明，在30 mL液体培养基中培养14
天，胚性细胞的初始接种量显著地影响马尾松胚
性愈伤组织的增殖（见表1）。0.5 g的初始接种
量处理，其平均增殖系数最小(7.469±0.346)，初
始接种量为1.0 g的处理，其平均增殖系数最大
(12.097±1.754)，且0.5 g与1.0 g初始接种量的两
个处理间有显著性差异(P＜0.05)；当初始接种量
增加到2.0 g时，其平均增殖系数较1.0 g时有所
降低，但这两个处理间差异不显著。比较这3个
处理培养14天时在悬浮培养体系中细胞悬液的外
观表现，0.5 g的处理，其悬浮培养液呈白色、透
明状，1.0 g的处理其悬浮培养液呈乳白色，粘稠
状，而2.0 g的处理，此时悬浮培养液呈褐色、粘
稠状，已出现胚性愈伤的老化状态。因此，从增
殖系数的大小和悬浮细胞液外观表现来综合权衡，
确定在30 mL培养基中悬浮培养14 d时，1.0 g的
初始接种量是可取的，其单次重复的增殖系数最
大可达16.232，且细胞悬液的培养状态好。
表 1 初始接种量对马尾松胚性细胞系1-3-1悬浮培养增殖
系数的影响?
Table 1 Effects of initial embryogenic tissue weight on
proliferation coefficients of suspension cultures
of cell line 1-3-1
初始接种量/g
增殖系数平均值±
标准误差(se) 1*2345
0.5 6.6048.0008.6847.3247.6317.649±0.346 a**
1.09.1367.58815.97911.54816.2321
2.097±1.754 b
2.08.4079.84311.71112.35310.86410.636±0.698 ab
? *重复数，**小写英文字母代表显著性差异水平（0.05水平）。
2.2 继代细胞密度对悬浮培养细胞增殖的影响
细胞系1-3-1悬浮培养的细胞增殖系数随着转接细胞密度的增加(1/10、1/6、1/3)而增加（见图1），且3个处理的继代细胞密度对悬浮细胞的增殖培养有显著性的影响。LSD多重比较结果表明，1/10与1/6的两处理间的增殖系数无显著性差异，而1/10与1/3的2个处理间有显著性差异，而1/6的处理分别与(1/10、1/3)处理间无显著性差异。在培养的过程中发现1/6转接细胞密度条件下，悬浮培养细胞的状态好，表现为悬浮液为乳白色澄清，细胞分散性较好，而1/3转接细胞密度培养条件下的悬浮液呈淡黄色，培养液略微浑浊，且细胞分散性较差。因此，在继代转接细胞密度的处理中，选择1/6的转接细胞密度处理既能获得较好的增殖，又能保持较好的细胞增殖培养状态。
图上小写字母代表不同继代细胞密度下增殖系数间在0.05水平的多重比较
结果
图1 继代细胞密度对马尾松胚性细胞系1-3-1悬浮培养增殖系数的影响
Fig.1 Effects of cell density in subculture on proliferation coef? cients of suspension cultures of embryogenic
cell line 1-3-1
2.3 马尾松悬浮培养细胞活力测定及其悬浮培养
细胞生长曲线的绘制
在30 mL液体培养基中悬浮培养20 d，每2 d 定期测定细胞活力与沉淀细胞体积SCV，用其动态变化数据绘制2个细胞系（1-3-1和2-3-3）在该培养周期中的细胞生长曲线（见图2、图3），结果表明，悬浮培养细胞系的增殖生长基本上遵循“S”型生长曲线的规律。图2和图3中所示的SCV值（即悬浮细胞生长量）可以明显地划分为3个时期，缓慢生长期，快速生长期和稳定生长期，与此同时，细胞活力值（OD值）随着培养时间的推移，呈现出细胞活力先升后降的态势。这说明，悬浮培养继代初期，悬浮液培养环境中营养充足，细胞新陈代谢活动旺盛，细胞活力上升至一个峰值，随着细胞增殖，细胞数量增加，消耗培养基中的部分营养，此时培养细胞的新陈代谢活动受到一定程度的限制，表现为细胞活力OD值的降低，这也是细胞内外环境之间营养供给与生长动态平衡相适应的结果。
总体而言，在悬浮培养的前6 d期间，悬浮培养液中细胞数量和沉淀细胞体积逐渐增加，随之
细胞活力大幅度上升，指示此时悬浮培养液中胚
67
第34卷中 南 林 业 科 技 大 学 学 报性细胞新陈代谢活动逐渐旺盛；在6～10 d （图2细胞系1-3-1）或6～12 d （图3细胞系2-3-3）期间，尽管胚性细胞SCV 数量还在不断地增加，但细胞活力却由前期的活力峰值下降到与转接继代时几乎持平的细胞活力OD 值水平；在12～20 d （图2细胞系1-3-1）或14～20 d （图3细胞系2-3-3）期间，悬浮培养细胞的SCV 数量缓慢增加直至出现细胞SCV 的静止期，此时沉淀细胞体积的增加达到一个平台峰值，而培养液中细胞活力却并不随细胞SCV 量的增加而上升，反而出现低于初始继代培养时的细胞活力值水平，并保持逐渐降低的态势至较低的水平，这说明，在14～20 d 的悬浮增殖期间，尽管细胞SCV 值达到了该培养周期中的最高水平，但细胞的新陈代谢活动已经明显地受到了抑制，原培养液中的有效养分条件供给与细胞增殖与活力保持之间出现了不平衡，因此，综合分析，为既能较好的保持细胞活力，又能较好的维持细胞良好的增殖态势，8～12 d 应为马尾松胚性细胞系悬浮增殖培养适宜的继代间隔周期。
图2 细胞系1-3-1悬浮细胞生长曲线及细胞活力的动态
变化
Fig.2 Growth kinetic of cell line 1-3-1 and changes of cell
viability in suspension culture
图3 胚性细胞系2-3-3悬浮细胞生长曲线及细胞活力的动
态变化
Fig.3 Growth kinetic of embryogenic cell line 2-3-3 and
changes of cell viability in suspension culture
3 结论与讨论
建立一个稳定高效的马尾松胚性细胞悬浮培养体系，对马尾松体细胞胚胎发生快繁利用意义重大，也是进行马尾松基因工程遗传转化的良好平台。初始接种量、转接细胞密度，继代周期等都是影响一个细胞悬浮培养体系中的关键因子。初始接种量对悬浮细胞的生长和增殖产生显著性影响。马尾松胚性细胞悬浮培养细胞生长曲线的研究结果表明其增殖过程经历缓慢生长期，快速生长期，稳定生长期，甚至在细胞系2-3-3的后期出现了生长的衰退。本研究中在30 mL 培养液中，分别设置3个不同的初始接种量0.5、1.0、2.0 g ，结果表明，1.0 g 的初始接种量，胚性愈伤组织增殖系数达到最大，培养液呈乳白色，粘稠状，悬浮培养细胞的整体状态良好，从而确定30 mL 培养液中添加1.0 g 胚性愈伤为马尾松悬浮培养体系的最佳初始接种量。较小的接种量（如0.5 g ），悬浮细胞培养液呈澄清状，这说明细胞增殖的延迟期延长；而较大的接种量（如2.0 g ），悬浮细胞培养液粘稠、颜色发褐，说明细胞很快结束对数增长期而进入静止期和衰亡期，细胞衰老，这将不利于保持胚性细胞良好的增殖态势。悬浮培养过程中初始接种量的确定，还与悬浮培养体系的大小以及悬浮培养细胞的类型有关，如Salaj 等[14]在欧
洲黑松Pinus nigra Arn 胚性细胞悬浮培养研究中表明：25 mL 的培养液中1.0 g 或2.5初始接种量均有利于黑松胚性细胞的生长；杨金玲等[12]在白杄Picea meyeri Rehd. et Wils 胚性愈伤组织的悬浮培养研究中表明，50 mL 液体培养基中添加1.5 g (3%)白杄胚性愈伤组织最有利于其悬浮体系的建立；杨映根等[13]对青杄Picea wilsonii Mast 胚性细胞悬浮培养的研究结果表明，50 mL 培养液中添加2%的胚性愈伤组织为其最佳的初始接种量。
继代细胞密度对马尾松悬浮细胞培养体系的建立有显著性影响，增殖系数随着继代细胞密度（1/10、1/6、1/3继代(旧/新)营养液的体积比）的增加而增加。Salaj 等[14]对欧洲黑松的悬浮培养研究也表明，当继代SCV 体积从3 mL 增加到5 mL 时，可以有效地提高增殖缓慢细胞系的增殖效率。本研究中的结果表明，过高的继代细胞密度（如1/3），容易出现悬浮培养液变浑浊，颜色变褐的现象，不利于马尾松胚性细胞系的稳定增殖与胚性保持，而中等水平的继代细胞密度(1/6)，增殖系数高，且能维持细胞正常的生长状态，因此，本研究中选定1/6
水平为马尾松悬浮培养的继代细胞密度。
史昆，等：马尾松胚性细胞悬浮增殖培养体系的建立
68第1期
1983年Mosmam[19]首次提出TTC比色法快速检测悬浮培养体系中活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活性，测得细胞活力OD值，作为表征细胞生长、增殖，新陈代谢旺盛程度的一个相对衡量指标。马尾松胚性细胞悬浮培养生长周期中，细胞体积的增加呈“S”型，并达到一个稳定期，而细胞活力呈先上升后下降的趋势。这一规律性变化，反映了培养周期内胚性培养物对培养基中养分的吸收和利用情况。在悬浮培养初期，培养基中营养丰富，细胞增殖，细胞数量不断增多，细胞新陈代谢较旺盛，与此同时，逐渐消耗培养基中的营养，因此，细胞体积增加，细胞活力呈快速上升状态；而当细胞增殖一定时间，细胞数量达到一定量时，培养液中有害代谢产物增多，有效养分减少，细胞的生长和增殖受到一定的抑制，新陈代谢逐渐变慢，细胞活力下降；细胞因为得不到充足养分，部分细胞老化或液泡化，导致细胞体积增长高峰延后的出现，细胞活力持续下降，直至出现细胞生长的停滞，甚至老化，悬浮培养液外观表现上由乳白色变得粘稠，褐化。因此，结合马尾松悬浮培养的细胞生长周期规律，为了让悬浮细胞活力状态表现良好，选择悬浮培养继代周期为8～12 d比较适宜。另外，当把该马尾松悬浮培养体系作为马尾松转基因操作，胚性细胞融合的技术平台时，最好选择悬浮培养4～6 d的胚性细胞，此时其细胞活力值最高，新陈代谢最为旺盛。
本研究首次建立了马尾松胚性愈伤组织悬浮培养体系，确定了30 mL液体培养基中最佳初始接种量为1.0 g新鲜的胚性愈伤组织；在继代培养时，以1/6的继代细胞密度为宜，在增殖系数较高的同时细胞增殖状态俱佳；通过定期测定2个胚性细胞系悬浮培养细胞的SCV和细胞活力，绘制出马尾松胚性细胞悬浮培养生长周期曲线的动态变化，确定了8～12 d为马尾松胚性细胞悬浮培养的最宜继代周期。本研究在马尾松体细胞胚胎发生中，利用悬浮增殖体系进一步扩繁所获得的马尾松胚性愈伤，为马尾松优良无性系的规模化扩繁提供了技术基础，并为马尾松基因工程遗传转化，以及采用细胞融合进行马尾松新品种选育提供了技术平台。
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[本文编校：吴毅]
细胞增殖第一课时教学设计和反思
《细胞增殖》第一课时教学设计和反思 汉口铁中栾奕 教材分析 本节是现行人教社高中《生物》(必修本)第一册第二章第二节内容，“细胞增殖”是讲述细胞的一种生命现象，只有了解了这一生命现象，我们才能让学生逐步认识生物体的生命现象，例如，生物体的生殖和发育，生物体具有的遗传和变异，所以本节是我们学习生物学知识、了解生物生命现象的细胞学基础。“细胞增殖”之所以作为本章乃至本册的难点，就是因为这一知识非常抽象化，没有具体的实物模型，又不是我们生活中所见，因此，在讲解知识的时候，我们直接示意这是本章中的难点，引起注意。 教学目标 知识目标：细胞增殖的方式和意义。（A：知道） 有丝分裂周期的概念。（B：识记） 有丝分裂过程各时期的特点。（C：理解） 能力目标：凭借有丝分裂过程图，图文结合，培养学生的识图能力，形象思维能力。 情感目标：细胞分裂——运动是物质的根本属性，建立生命活动的唯物主义观点。 重点和难点 “细胞增殖”一节主要向学生展示的是有丝分裂──生物体普遍存在的一种分裂方式，结合学生认知的规律性，基础知识的讲解要重难点突出，有渗透力和感染力，本节重点内容就是让学生理解真核细胞有丝分裂的细胞周期的概念和特点，以及真核细胞有丝分裂过程，由于细胞分裂这一现象的特殊性──整个过程是一动态变化，要让学生具体把握这个过程中细胞内部所发生的变化，特别是遗传物质的变化，从而让学生明确细胞的周期变化，这一内容是本节课教学的难点。 学法指导 指导学生在学习本节知识的时候，准确识别分裂图像，观察染色体DNA在细胞有丝分裂各时期变化规律，利用口诀巧记各时期变化特征，由这几个方面的归纳总结，培养学生养成一种由观察现象→解决问题→总结体会→知识提升的学习习惯，另外我们可以使学生在这种环境中发展他们的思维能力。 教具准备 植物细胞有丝分裂周期挂图；自制教具染色体的复制及螺旋过程。 教学过程设计
第五章繁殖技术
第五章家畜繁殖技术 一、名词解释 发情发情周期发情持续期休情排卵排卵数自发性排卵诱发性排卵初情期性成熟体成熟人工辅助交配人工授精精子的果糖分解作用精液的云雾状精子活率精子密度受精冷冻精液输精精子获能透明带反应卵黄膜的封闭作用胚泡多精子受精双雌核受精卵裂桑葚胚期囊胚胚泡附植脐带胎盘妊娠诊断分娩预兆分娩难产诱导发情同期发情超数排卵公畜效应卵核移植基因导入胚胎移植繁殖力正常繁殖力适繁母畜受配率受胎率总受胎率情期受胎率第一情期受胎率不返情率分娩率产仔率仔畜成活率繁殖率产犊指数繁殖障碍流产 二、填空题 1.发情周期可分为和两个阶段。 2.家畜的排卵类型有和两种。 3.家畜的发情分为和两个类型。 4.目前发情鉴定的方法有、、。 5.母牛发情时最显著的特征是。 6.母牛的卵泡发育可分为、、、四个时期。 7.母马的直肠检查时，寻找卵巢和子宫的方法有和。 8.母马的卵泡发育可分为、、、、、六 个时期。 9.母马的卵泡发育常有、、、等异常现象。 10.家畜的配种方法有和两类。 11.自然交配有和两种形式。 12.精液主要有和两部分组成。精清是和的分 泌物 13.在电子显微镜下观察，精子主要由、、三部分组成。 14.精子的代谢有两种形式，即作用和作用。
15.精子的运动形式有、、三种。 16.最适合精子生存的PH为左右。 17.家畜的采精方法主要有和。 18.假阴道主要由、、三部分组成。 19.假阴道采精时应具备的条件有、、。 20.精液直观检查的内容包括、、。 21.精子活率检查的方法有和两种。 22. 精子活率的评定通常采用法。 23. 精子活率的评定的方法有和两种。 24.精子密度测定方法有和两种。 25.估测法来估测精子密度时其稠密程度划分为、、三级。 26.精子畸形主要有、、、四种。 27.精液保存的主要方法有、、。 28.液氮的沸点为。 29.颗粒精液的解冻方法有、两种。 30.牛输精常用法。 31.精子运行过程中，精子要经过、、三道栏筛。 32.受精时精子依次卵外围的、、三层结构。 33.家畜的异常受精有、、。 34.家畜的卵裂具有和特点。 35.胎膜由、、、四部分构成。 36.胎膜是由、、三个基本胚层形成的。 37.胎膜所形成的三个囊腔是、、。 38.胎水是内的羊水和内的尿水的总称。 39.胎盘是由和两部分构成。 40.胎盘根据形态可分为、、、四种类型。 41.胎盘根据结构可分为、、、四种类型。 42.家畜妊娠诊断的方法常有、、三种。
试论贴壁细胞悬浮培养的特点及其体系的建立
试论贴壁细胞悬浮培养的特点及其体系的建立 摘要：文章主要对贴壁细胞悬浮培养进行研究。本次研究中通过文献资料分析了贴壁细胞悬浮培养的特点，然后对培养中体系建立的要求进行明确。体系建立的过程中严格依照外植体培养标准及愈伤组织选取标准实施，体系建立非常科学。该体系的构建对细胞培养学的丰富具有一定的贡献性作用。 关键词：植物细胞；悬浮培养；特点；培养体系 1 贴壁细胞悬浮培养的特点 细胞悬浮培养主要指在培养的过程中将细小的细胞聚集在培养液上实施培养，该操作主要在摇床上完成，可以在短时间内获得大量细胞，培养效果非常显著。该培养的过程中主要选取植物细胞完成培养过程，通过将植物愈伤组织处理后放置在液体培养基上进行培养操作，可以有效改善愈伤组织的分裂和增殖能力，细胞生长速度大大提升。 植物细胞悬浮培养时一般不需要支持物，生长速度较快，对培养条件要求并不苛刻。这种培养的过程中植物细胞可以悬浮在培养基中培养，上述状况下植物细胞悬浮培养面积有效提升，培养效果较好。与此同时，这种培养的过程中植物细胞敏感性一般较低，培养操作中无需加入动物细胞培养过程中的血清、微生物培养过程中的有机物质等，整体培养成本较低，经济效益较好。其具体培养特点见表1. 表1 植物贴壁细胞悬浮培养中培养特点 性质微生物植物细胞植物器官大小（μm）1-10 10-200 ≥103 细胞聚集经常发生通常成团毛状根、芽、体胚等倍增时间≤1h 24-150h 几天不等 接种密度小整个体积的5%-20% 大剪切力敏感程度低高、敏感高、敏感 遗传稳定性强弱一般耗氧量一般低高 营养要求简单较复杂较为复杂 产物积累胞外，高常存于液泡中，浓度低多为胞内产物，较高通气量（L/(L.min)）高≥1 低≤0.6 略高，1左右环境敏感性适应范围广可浸没培养长期浸没易玻璃化传统变异筛选技术广泛使用有时使用有时使用 2 贴壁细胞悬浮培养体系的建立 2.1 培养流程 在实施植物细胞贴壁悬浮培养的过程中人员要严格依照培养原则要求，细化细胞培养流
人教课标版高中生物必修1第6章《细胞的增殖》教材分析
《细胞的增殖》教材分析 1.教学重点 （1）细胞生长和增殖的周期性。 （2）真核细胞有丝分裂的过程。 2.教学难点 真核细胞有丝分裂过程中，各个时期染色体行为和数目的变化，以及DNA数量的变化。 首先让学生了解细胞增殖的必要性，再来学习细胞增殖的方式。多细胞生物体的生长，既靠细胞的生长，还要靠细胞的分裂。这是因为细胞不能无限长大。教科书让学生通过探究细胞表面积与体积之比，与物质运输效率之间的关系，探讨细胞不能无限长大的原因。实验操作过程比较简单，但是实验后的讨论题却有相当的思维力度，教师应给予足够重视。 既然细胞越小，细胞的物质运输的效率就越高，细胞体积不是越小越好吗？学了这部分内容，学生可能会产生这样的疑问。逆向思维将有助于对问题的理解。因而教科书在旁栏的“批判性思维”中把这个问题提了出来，以培养学生批判性思考的能力。由于这个问题有一定的思维难度，因此，教科书给了一些必要的提示，如有人估计完成细胞的各项功能至少需要100种酶，每个酶促反应需占有直径约50 nm的空间，每个核糖体直径为10～20 nm等。 真核细胞分裂的方式有3种：有丝分裂、无丝分裂和减数分裂。有丝分裂是真核生物进行细胞分裂的主要方式，本节重点介绍有丝分裂，简要介绍无丝分裂。减数分裂是一种特殊方式的有丝分裂，它与有性生殖细胞的形成有关。有关减数分裂的内容安排在《遗传与进化》的相关章节中让学生学习。 关于有丝分裂，与原来的高中教材相比，新教材对这一问题的叙述，基本没有什么变化。仍然是分为前期、中期、后期、末期四个时期叙述，突出这四个时期中染色体行为和数目的变化。首先以植物细胞为例详细地介绍这一过程，然后再采取对比的方法，列举动物细胞有丝分裂的过程与植物细胞的不同点。最后归纳有丝分裂的重要意义。在以前的教学中，教师往往把重点放在对有丝分裂过程的详细介绍上，要求学生理解并熟记有丝分裂过程中染色体行为和数目的变化，这固然很重要。但是为细胞分裂进行活跃的物质准备的分裂间期也应该引起学生重视，以便学生对细胞的生命周期形成完整的认识。“图6-1有丝分裂细胞周期”和“表6-1不同细胞的细胞周期持续时间”，提示学生注意分裂间期在细胞周期中所占时间的比例，反映出分裂间期在细胞周期中的重要性。 无丝分裂的过程比较简单，这种分裂方式也不是很常见，因而教科书只用一小段文字和一幅图做了简单介绍。关于无丝分裂的问题，长期以来就有不同的看法。有些人认为无丝分裂不是正常细胞的增殖方式，而是一种异常分裂现象；另一些人则主张无丝分裂是正常细胞的增殖方式之一，主要见于高度分化的细胞，如肝细胞、肾小管上皮细胞、肾上腺皮质细胞等。有关无丝分裂的不同观点，教师可根据教学情况的需要，适当补充介绍。 《观察根尖分生组织细胞的有丝分裂》是一个经典的高中生物学实验，从实验要求来说与以前变化不大。为了便于学生操作，增强操作步骤的目的性和条理性，教科书的实验指导在装片制作这一步，把装片制作的过程、方法、所需时间和操作的目的用列表的形式展示出来。本实验增加的一个内容，是让学生学习记录细胞周期不同时期的细胞数，通过统计每一时期的细胞数与计数细胞总数的比值，比较细胞周期不同时期的时间长短。这里运用了间接转换的方法。因为学生并没有真正记录下细胞周期不同时期的时间，而是根据得到的每一时期的细胞数与计数细胞总数的比值，来比较细胞周期不同时期的时间长短。这种思维上的转换有一定难度，是对学生想像力的一种挑战。
细胞增殖教学设计
教案背景： 1，面向学生：高中 2，学科：生物 3，总课时：2 教学课题：细胞增殖 教材分析： “细胞增殖” 是《分子与细胞》这一模块第六章第1节的内容。是学生在学习了细胞生命系统的物质组成、结构之后，来认识细胞这个系统的产生、发展和消亡的过程。其中有丝分裂是教学的重点也是教学的难点,有丝分裂是学生以后学习减数分裂和遗传规律的基础，也是学习DNA复制及遗传信息传递的重要基础，甚至是生物班的学生学习选修模块的基础。 细胞分裂的三种方式中，有丝分裂是最主要、同时也是最重要的方式。多细胞生物的生长发育过程中，体细胞的增多就是通过有丝分裂实现的。无论是单细胞真核生物还是多细胞生物他们各种形式的无性生殖也是通过有丝分裂完成的。有丝分裂还是学习减数分裂的基础，而减数分裂知识又是学习遗传变异规律的基础。由此可见有丝分裂是非常重要的基础知识。因此在教学过程中一定要讲透，要让学生真正掌握有关知识。可以通过不同方式；从不同的角度进行分析，要充分调动学生参与整个学习过程。通过学习使学生了解到认识和分析一个生命现象可以有多种不同的方法——除了一般的文字描述外，还可以用图形描述特点；用图解和表格突出重点；用曲线描述量的变化规律和趋势；通过实验观察、验证生物学知识等……。使学生在掌握知识的同时了解一些常用的生命科学研究的基本方法。 教学方法： 本节课教学内容理论性强、抽象复杂，所以课前我指导学生做好预习，课堂上充分利用多媒体辅助教学，增强教学的直观性和形象性性通过上一节课的模拟探究使学生了解了细胞增殖的必要性，明白了生物体的生长还要靠细胞增殖增加细胞数量。 在讲有丝分裂各时期的主要特点时，我采用了FLASH动画逐步演示有丝分裂各时期，很好地让学生感受细胞分裂过程的动态性和连续性。黑板粘贴模型克服了多媒体手段转瞬即逝的弊端，较好地化难为易，化抽象为形象。 《细胞增殖》教学设计 教学目标： 知识目标： 1、了解真核细胞增殖的方式及意义。 2、理解细胞周期的概念。 3、准确描述细胞有丝分裂各阶段的重要特征。了解动、植物细胞有丝分裂过程的异同。 4、掌握有丝分裂的过程、特征和意义。尤其是DNA和染色体的规律性变化。
繁育技术
草 食 动 物 繁 育 技 术 班级：xxxxxxxx 姓名：xxxxxxx 学号：xxxxxxxxxxx
草食动物繁育技术 牛的育种 牛的育种工作是养牛生产中的基本任务和重要环节，它关系到养牛业的兴旺与发展。牛的品种选育就是使优良基因在群体内得到巩固和提高，从而创造出生产性能优越的个体，并使优秀个体数量扩大的过程，是围绕品种而进行的各种育种活动，它包括本品种选育、杂交育种、引种、品种资源的保存及利用。 本品种选育 本品种选育指某一个牛品种基本上能满足生产及市场需求，不必进行品种改造，保持该品种的基本特征，使优良基因巩固，增加品种内优秀个体的数量，克服该品种的某些不足而进行改良所实施的育种方法，从而使品种的生产性能和纯度不断提高。 本品种选育的基础是品种内个体差异，通过选择阻止突变、自然选择和漂变作用所引起的品种的品质下降，以提高品种性能。 本品种选育必须遵守3个原则： 第一，巩固和提高本品种的优良性状和原有的独特性能。例如，晋南牛的选育中，要保持体格高大，适应性广，耐粗饲的优点，克服尻部短的缺陷。 第二，严格选种选配。选种选配是本品种选育的主要手段，选配上依据选育目标和计划，采用不同的选配方式。核心群的繁育可采用适当程度的近交。 第三，加强饲养管理工作，只有在适宜的饲养水平和管理条件下，良种才有可能发挥其高产性能。在选育的同时，加强饲草、饲料基地建设，改善管理条件，发挥选育的作用。 本品种选育的方法主要有近亲育种、品系育种和远亲育种。 近亲育种，选择具有亲缘关系的个体进行选配，以固定优良性状，增加后代继承相同性状概率的选育方法。品系育种，品系是指一群具有生产性能优秀突出，表现整齐一致，并能稳定遗传的种用类群。牛的品系育种中建系方法有系祖建系法和群体继代选育法。杂交育种就是应用杂交方式改良牛品种和通过杂交育成新品种。杂交改变基因型，产生杂种优势并将不同亲本的优良特性结合在一起，杂种后代体型得到改善，产乳、产肉性能获得提高。杂交育种方法在我国养牛生产中发挥了巨大作用，我国培育的新品种如中国荷斯坦牛、三河牛、新疆褐牛、中国草原红牛都是杂交育成的新品种。在做好育种工作同时好要做到保种，保种就是保存种群，保存了有一定特性、特征的种群，也就是保存了品种、性状、基因和资源，也就是说保种就是保存种质资源。不同的品种具有不同的适应范围，而
细胞悬浮培养
细胞悬浮培养 摘要： 悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。 关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化
1．细胞悬浮培养的定义 定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。 应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） 定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。 应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法 2.1 机械法 早期用机械法分离叶组织单细胞。Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。 2.2 酶解法 酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。由于果胶酶不仅能降解细胞之间的中胶层，而且还能软化细胞壁，因此在用酶解法分离细胞的时候必须对细胞给予渗透压保护，即在酶液中加入一定浓度的渗透压稳定剂。 酶解法一般利用叶片作为分离细胞的材料，但此法不能分离单子叶作物如小麦、大麦和玉米的叶肉细胞[3]。 2.3 愈伤组织诱导法 以愈伤组织作为细胞悬浮培养的细胞来源，首先必须诱导出适宜的愈伤组织。用于建立悬浮系的愈伤组织必须有较好的松散行，使之在悬浮培养的起始阶段细胞容易打散。同时，愈伤组织还必须具备较强的增殖和再生能力。诱导符合这些要求的愈伤组织，首先，必须选择适宜的植物外植体材料。其次，培养基的附加成分对建立疏松易散的愈伤组织具有较大的影响。
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立
基金项目:河南省科技厅“烟草细胞和发状根培养中茄尼 醇的合成研究” (524420033)项目和郑州大学青年骨干教师资助项目“烟草中萜烯类次生代谢物的合成研究”资助。 作者简介:岳彩鹏(1974-),女,博士,郑州大学讲师,主要从事烟草生理研究。E 2mail:yuecai peng@zzu .edu .cn 收稿日期:2007-05-21 责任编辑:董志坚 E 2mail:yckj2256@yahoo https://www.360docs.net/doc/c04017817.html, 电话:0371267672650 烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立 岳彩鹏,李 品,黄象男,朱大恒 郑州大学生物工程系,郑州市科学大道100号 450001 关键词:烟草;愈伤组织;悬浮培养;白肋烟;鄂烟1号 摘要:以鄂烟1号无菌苗的叶为材料进行愈伤组织的诱导,筛选出生长培养基的最佳激素配比,初步建立了烟草细胞悬浮培养体系。结果表明,愈伤组织诱导的最优基本培养基为MS 培养基,以MS +NAA 110mg /L +6-BA 0.5mg/L 为最佳配方;愈伤组织最佳生长培养基为MS +2,4-D 011mg/L +NAA 115mg/L +6-BA 013mg/L,愈伤组织培养第6天进入对数生长期,第14天干重增至最初干重的12.536倍,并以此配方建立了烟草细胞悬浮培养体系。中图分类号:S572.01 文献标识码:B 文章编号:1002-0861(2007)10-0056-04Tobacco Ca llus I nducti on and Est ablish m en t of Cell Suspen si on Culture Syste m Y UE CA I 2PENG,L I P I N ,HUANG X I A NG 2NAN,and Z HU DA 2HENG B i oengineering Depart m ent,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China Keywords:T obacco;Callus;Sus pensi on culture;Burley t obacco;E ’yan 1 Abstract:The callus inducti on was carried out with the leaves of asep tic seedling of t obacco E ’yan 1,and the op ti m al hor mone p r oporti on in culture medium was screened out,and the syste m of t obacco cell sus pensi on culture was established p reli m inarily .The results showed thatMS was the op ti m al basic mediu m for callus inducti on,and the op ti m al f or mula was MS +NAA 1.0mg/L +62BA 0.5mg/L;while the op ti m al f or mula for culture mediu m of callus wasMS +2,42D 0.1mg/L +NAA 1.5mg/L +62BA 0.3mg/L.On the 6th day of callus culturing,the l ogarith m gr owth peri od started;and on the 14th day,the dry weight increased t o 12.536ti m es of its initial dry weight .The syste m of t obacco cell sus pensi on culture was established based on this f or mula . 组织培养不仅是一种植物快速繁殖的手段,同时也是植物改良、种质保存和次生物质生产的 理想途径[1] 。有关烟草组织和细胞培养已有不 少报道[225] ,近年来在抗性研究、基因转化和次生 物质生产等方面也取得一些进展[629] 。有研究表 明 [10] ,以植物悬浮培养细胞为材料生产次生代谢 物具有培养周期短、材料均一、重复性好等优点。烟草中含有大量次生代谢物,因此,建立稳定而具 有高活力的烟草悬浮培养细胞体系对次生代谢物的生产有重要意义。到目前在白肋烟的愈伤组织培养和细胞悬浮培养方面的研究报道较少。本试验以白肋烟鄂烟1号的叶为材料进行了愈伤组织的诱导,确定获得脆散性愈伤组织的最佳激素配比,并以此为基础建立起烟草细胞悬浮培养体系,旨在为烟草中次生物质的生物开发利用提供依据。
植物细胞悬浮培养技术
植物细胞悬浮培养技术 一、基本原理 利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。 一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。 在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。 二、器材 超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子 三、操作步骤 1．配制培养基 按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL 的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。 2．水稻种子的消毒 （1）将种子置于无菌的培养皿内，以体积分数95％的酒精消毒1～2min。 （2）取出后用无菌水冲洗2～3 遍。 （3）将种子放入25.0g/L 的次氯酸钠溶液中轻轻摇动后，浸泡60min 。 （4）取出后用无菌水冲洗，将次氯酸钠溶液充分洗净。 3. 接种 在超净工作台内，将灭菌后的水稻种子接到诱导愈伤组织的固体培养基上，每个培养瓶接5～10 粒种子。接种完毕后用封口膜将培养瓶封好，放在26℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。 4．悬浮培养的开始： 当得到愈伤组织后，将其转人到AA 液体培养基中。注意愈伤组织块应小于3mm . 若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在250mL 的锥形瓶内．接种完毕后将瓶口用封口膜封好，把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。调整摇床的旋转速度，使之为120r/min。培养温度为26℃，在黑暗中培养。 5．悬浮培养物的保持 进行悬浮培养后要不断进行观察，由于培养物的继代培养与培养瓶内培养物的密度及细胞
细胞增殖教学设计教案
教学准备 1. 教学目标 1.简述细胞的生长和增殖的周期性。 2.描述细胞的无丝分裂。 3.概述细胞的有丝分裂过程。 2. 教学重点/难点 教学重点： 真核细胞有丝分裂的细胞周期和有丝分裂的过程。 教学难点： 真核细胞有丝分裂的细胞的染色体形态、数目、位置和运动的变化是一个动态而又微观的过程。 3. 教学用具 教学课件 4. 标签 教学过程 教学过程设计 （一）、导入新课 [师]从细胞水平来看，一个蛙的受精卵需要怎样的途径才能成为一只成蛙呢？ 学生小组讨论、代表回答：需要不断进行细胞体积的扩大与细胞分裂，还要细胞的分化等。 [师]细胞生物学的研究也证明了以上观点，生物体的体积增大，即生物体的生长，既靠细胞生长增大细胞的体积，还要靠细胞分裂增加细胞的数量。事实上，不同生物同类器官或组织的细胞大小一般无明显差异，器官大小主要决定于细胞数量的多少。 （二）、细胞不能无限长大 [师]细胞为什么不能无限长大？什么因素限制了细胞的长大？
[生]细胞体积越大，需要的营养物质越多，需要排出的代谢废物也越多，物质的输入和输出也会遇到困难。 [师]随着细胞的长大，细胞膜的面积不是也在扩大吗？下面通过模拟实验来探讨这个问题。 学生分组实验：①将实验桌上准备好的琼脂块（内含酚酞）切成边长分别为25px、2 cm、3 cm的立方体；②将以上三种琼脂块样品，同时置于盛有适量0.1%的NaOH溶液的烧杯中，处理10 min；③取出琼脂块样品，吸干浮液后，分别将每一样品切成两半，观察切面，测量每一切面上NaOH扩散的深度并记录数据。 学生活动：各小组对实验采集的数据进行讨论分析，小组代表陈述观点。 分析： （1）琼脂块的边长越长，NaOH在琼脂块中的扩散效率越差。 （2）边长为3 cm、2 cm、1 cm的琼脂块分别看作三个植物细胞的话，那么细胞表面积与体积的比值是依次增大的。 （3）因而，我们有理由相信，生物的异常旺盛的代谢与其细胞的S/V相对直接有关。细胞体积越大，其相对表面积越小，细胞的物质运输的效率就越低。 [师]细胞表面积与体积的关系限制了细胞的长大。可见，生物体的长大主要靠细胞的数量增多，即细胞的增殖来实现。 （三）、细胞周期 [师]细胞以分裂的方式进行增殖。 [师]像草履虫、变形虫这些单细胞生物，细胞分裂有什么作用呢？ [生]通过细胞分裂可以产生后代，起到生殖和繁衍种族的作用。 [师]对多细胞生物来讲，细胞分裂又有什么作用呢？ [生]细胞分裂可以增加体细胞的数目，是细胞分化、组织与器官形成的基础。 [师]细胞的增殖是生物体生长、发育、生殖和遗传的基础。 [师]下面我们就来探讨细胞增殖的问题。我们先以动物细胞为例，看看细胞是如何增殖的。 呈示多媒体信息：播放一段草履虫有丝分裂的视频。 [师]大家看到了一个动物细胞经过一系列复杂的变化，最后形成两个完全一样的子细胞，也就是说它完成了一次细胞增殖。并且这样的增殖具有周期性。科学家采用放射性同位素标记法，用32P标记蚕豆根尖细胞并观察它的有丝分裂过程，揭示了细胞周期的基本规律。
一、林木无性繁殖技术
一、林木无性繁殖技术 1.1扦插 近年来，随着树种扦插繁殖理论及技术研究的不断发展，林木扦插生根的技术不断完善，树种扦插技术成熟度达到了生产实用的水平。影响扦插繁殖成活率的关键因子有： （1）穗条年龄（年幼化）、位置（位置效应)。张应中等*[1] 研究表明，国外松杂种(湿地松×洪都拉斯的加勒比松)扦插时，采穗母株年龄在2年以下，穗条长度为6.0～14.5 cm，顶端次生叶长5.5～13.0 cm的穗条容易生根。对于成龄优树扦插，母树年龄可因插条再生能力强弱而异，如马尾松树龄在10年以下的母树枝条，扦插均可获得生根成活的植株，但5年生以下母树插穗生根率高。并有学者指出，马尾松扦插繁殖的母树年龄效应在4年以上是明显的，表现为生根性状退化。而辐射松，母树年龄有时可达60年。对于腰果来说，由于其成龄树上的插条已丧失了生根潜力，只有采用幼龄实生苗的插条才容易生根、成活。 （2）扦插季节（发育期）。在林木扦插试验时发现，林木的发育阶段、发育时期、生活力直接影响到插穗的成活率。在哥斯达黎加恩塞讷斯热带农业研究中心(CATIE)，筛选了15种中美刺桐无性系原株进行生根试验，结果发现，无性系原株之间在生根能力及生活率上存在明显的季节差异，其中中美刺桐在干季扦插的生根率明显高于在湿季扦插的成活率。龙启德等对南方山区银杏扦插试验表明，在南方山区，银杏扦插在4～5月份成活率最高(达90%以上)，9月份扦插成活率为0。刘本大等将白榆在不同时期进行扦插，发现休眠期硬枝扦插生根率仅为30.2%，而生长期嫩枝扦插生根率则达95%。 （3）穗条规格（大小）与状态。在银杏扦插时发现，条长对生根率影响不大，
悬浮细胞培养技术课件
悬浮细胞传代及细胞计数 一、细胞传代 实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。进一步掌握细胞培养的操作技术。 实验原理： 培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。 实验用品： （一）仪器 净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱； （二）玻璃器皿 吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、 （三）塑料器皿 吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架 （四）其他物品 微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪 （五）试剂 1640培养液、PBS 操作步骤： 1.准备： 打开培养液，PBS； 取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。从吸管筒中依次取出吸管，装上吸 头，插入离心管备用。 2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。 3.首先观察培养板孔中培养液量。用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液， 转入离心管中。再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，
吸出转入离心管。 4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。 5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。吸取培养液约7ML放入离心管， 轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。 6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。 7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。 8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。 9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。 二、细胞计数及生长曲线测定 培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期 潜伏期(latent phase) 细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期.原代培养细胞潜伏期长，约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24 小时。 (2) 指数增生期(logarithmic growth phase) 这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数（Mitotic index, MI）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3％－5％。指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3－5 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contact
细胞悬浮培养
植物细胞悬浮培养 一、实验目的及意义 植物悬浮培养的细胞具有生长迅速、代谢均匀一致的特点，同时生长环境易于控制。由于培养的细胞对外界的各种反应比较灵敏，植物悬浮培养细胞已成为代谢、生理生化、分子生物学研究的理想材料，同时还可用于突变体筛选、次生代谢产物的生产等领域。通过学习，使学生了解和掌握植物细胞悬浮培养的原理和操作技术。烟草（Nicotiana tubacum Linn.）为茄科经济作物，同时也是植物分子生理生化研究一种重要的模式植物。丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科药用植物，建立悬浮体系，对构建分离纯化其药用物质体系具有重要意义。 二、实验原理 植物细胞悬浮培养（plant cell suspension culture）是将游离的单细胞和小细胞团在不断震荡的液体培养基中进行培养。用于悬浮培养的细胞和细胞团既可来自培养的愈伤组织，也可以通过物理或化学方法从植物的组织或器官中获得。本实验所用的悬浮培养细胞来自疏松的愈伤组织。 植物细胞悬浮培养系统要求：①细胞培养物分散性好，细胞团较小；②细胞形状和细胞团大小均匀一致；③细胞生长迅速。所采用的液体振荡培养具有以下重要作用：①振荡可以对培养液中的细胞团施加一种缓和的流变力，使它们破碎成小细胞团和单细胞；②振荡有利于细胞在培养基中均匀分布，有利于培养基与细胞间的物质交换；③培养液的流动有利于培养基和容器内的空气通过气液界面之间进行气体交换，保证细胞呼吸所需的氧气，使细胞能迅速生长，同时也有利于二氧化碳的排除。 三、实验仪器与药品 超净工作台，恒温振荡器（摇床），高压灭菌锅，培养室（培养箱），封口膜，油性标记笔，无菌蒸馏水 四、实验材料 烟草愈伤组织 五、操作步骤与方法
专题1-1-非洲紫罗兰悬浮细胞系的制备20120216
非洲紫罗兰悬浮细胞系的制备（初稿） 一、实验目的和要求 1. 了解植物细胞悬浮培养的基本原理，通过实验掌握植物细胞悬浮培养的方法和技术。 2. 通过实验熟悉无菌操作技术，培养无菌操作技能。 二、实验原理 将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术，称为植物细胞悬浮培养。它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术。从50年代起，米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究，得到了万寿菊，烟草单细胞和细胞团的悬浮液。1958年斯图尔德（F.C.Steward）等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养，并得到了完整的再生植株。 三十多年来，从试管的悬浮培养发展到大空量的发酵罐培养，从不连续培养发展到半连续和连续培养。80年代以来，作为生物技术中的一个组成部分，正在发展成为一门新兴的产业体系。悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料，也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础。此外，还在育种、快速繁殖、原生质体培养，体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用。 利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在植物遗传实验中已经得到广泛的应用。但这种方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。 由于植物细胞具有聚集在一起的特性，因此，在分裂后，往往不能像细菌细胞那样各自分开，而是大多以细胞团的形式存在，至今还不能培养完全是单细胞的县浮液。要进行单细胞培养或选择细胞无性纱，需要进行平板培养，微室培养和看护培养。本实验仅介绍最常用的悬浮培养技术。 植物离体培养可产生愈伤组织。将疏松型的愈伤组织县浮在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时间后，可形成分散县浮培养物。良好的县浮培养物应具备以下特征：（1）主要有单细胞和小细胞团组成；（2）细胞具有旺盛的生长和分裂能力，增殖速度快；（3）大多数细胞在形态上应具有分生细胞的特征，它们多呈等径形，核质比率大，胞质浓厚，无液泡化程度较低。
细胞培养技术问题整理题库
1.细胞培养：用酶消化法讲组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适 宜的条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。 2.BSS溶液：平衡盐溶液，是人工合成培养基的基础成分，也常用来洗涤组织细胞，其主 要成分是无机盐和葡萄糖，无机盐构成细胞的生命成分，维持细胞渗透压既其生存环境的稳定。葡萄糖供给细胞生存所需的能量。其中含少量酚红作为溶液酸碱度的指示剂。 Hank’s液是常用的BSS液。 3.原代细胞培养：又称为初代细胞培养，从机体去的材料（细胞、组织或器官），在培养 瓶内培养到第一次传代前。 4.传代培养或传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 5.组织块培养法：将组织块剪切成小块，直接送入培养瓶（皿）中，贴附一段时间后，细 胞从组织块长出，最终形成单层细胞。 6.细胞系：原代细胞首次传代成功后即可成为细胞系 7.细胞株：通过筛选或克隆化，且有特殊性质或特异标记的细胞，这些特性在以后的培养 中必须存在。这些特性包括：具有一定的标记染色体，对某种病毒的敏感性或抗性，以及具有特殊的抗原性等。 8.接触抑制：当一个细胞被其他细胞阻挡而无去处时就停止移动，接触区域的细胞膜皱褶 样活动停止，这样保证了细胞不会重叠生长。 9.密度抑制：正常细胞生长汇合成单层时，细胞密度达到一定程度时，细胞即停止分裂的 现象。 10.合成培养基（synthetic medium）是通过顺序加入准确称量的高纯度化学试剂与蒸 馏水配制而成的，其所含的成分（包括微量元素在内）以及他们的量都是确切可知的。合成培养基一般用于实验室中进行的营养、代谢、遗传、鉴定和生物测定等定量要求较高的研究 11.有丝分裂指数：mitotic index一个细胞群体中正在进行有丝分裂的细胞的百分数。 12.悬浮培养：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培 养方法。细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。 二、细胞培养技术的优缺点？ 优点：1.得到的是活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态结构、生命活动 2.可控制：选择对象、性质、调节条件。 3. 应用广，学科多：对象广。各种动物：低等动物--高等动物--人类一种动物：不 同年龄不同组织: 正常或异常（肿瘤） 4.较经济：花钱较少但可得到大量、同时、重复性好的生物学性状相似的实验对象 5. 不易污染环境 缺点：1. 现人工无法完全模拟体内环境a. 失去彼邻关系b.失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 2. 细胞趋向单一化 3.失去原有组织结构和细胞形态 4.分化减弱或不显要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。 5. 某些类型细胞还很难培养 6.大规模培养难度大
第五节 细胞增殖周期
第五节细胞增殖周期 重点难点解析 本节讲述细胞周期的概念、细胞周期各时相的特点、有丝分裂各期的特点、细胞周期的调控。要求重点掌握细胞周期的基本概念、细胞周期各时相的物质变化和分裂各期细胞的形态特征；了解细胞周期的调控。建议结合实验《有丝分裂》学习，把实验室形态观察同理论描述结合起来，加深对知识的理解和记忆。 一、细胞周期的一些概念 1．细胞周期(cell cycle)：指细胞从上一次分裂结束开始到下一次分裂终了所经历的过程。是细胞生长、分裂的循环过程。包括间期和分裂期，间期分为G1期(合成前期)、S期（合成期）和G2期（合成后期）；分裂期分为前期、中期、后期、末期四个时期。 2．细胞周期时间（Tc）：一个细胞周期的全过程所需的时间称为细胞周期时间（Tc）。Tc的长短主要由T G1所决定。 3．细胞的分类：根据细胞的增殖情况可以将细胞分为三类： ⑴连续分裂的细胞（周期性细胞）：这类细胞可以不断的进入细胞周期进行分裂增殖，如：小肠绒毛上皮隐窝细胞、表皮基底层细胞和部分骨髓细胞等。 ⑵暂时不分裂细胞（G0期细胞）：这类细胞暂时从G1期退出细胞周期，不进行分裂增殖，但在适当刺激下可重新进入细胞周期进行分裂增殖。如：某些免疫细胞和肝、肾细胞。 ⑶终末分化细胞：这类细胞不可逆的脱离细胞周期，丧失分裂增殖能力，但保持其生理功能活动。如：神经、肌肉细胞、多形核细胞等。 二、细胞周期各时相的动态及特点 细胞周期的中心事件简单来说就是：间期遗传物质复制；分裂期遗传物质平均分配到两个子细胞中。为实现这一过程，细胞会进行一系列结构和功能上复杂的变化。而细胞周期各时相都有其各自的特点。 （一）G1期（合成前期） 是指分裂期结束到S期DNA合成开始前的细胞生长发育时期。是为进入S期准备必要的物质基础的时期。 主要特点： 1．细胞体积增大，RNA、核糖体及大量蛋白质合成。 2．合成DNA复制所需的酶和蛋白。如DNA聚合酶、触发蛋白、钙调蛋白及G l期周期蛋白及周期蛋白依赖激酶、S期活化因子（S－phase activator factor，SPF）等。 3．限制点（R点)。在G1期存在1－2个R点，决定细胞进入S期，或者停止于G0期。 4．在Gl期末，中心粒开始复制。 （二）S期（合成期） 是指从DNA合成开始到DNA合成结束的整个时期。 主要特点： 1．进行DNA复制，组蛋白、非组蛋白合成，并组装成染色体。 2．复制需SPF的启动信号，必须处于感受状态的染色质DNA才能开始复制。 3．复制有一定的顺序：一般常染色质和富含C—G的碱基片段先复制；异染色质和富
重点分析无性生殖和有性生殖的特点
生殖的类型 重点分析：无性生殖和有性生殖的特点 这部分内容是理解生殖方式进化的知识基础。分析两类生殖方式的特点，阐明二者对于物种生存发展的不同意义，有助于培养学生辩证思维能力。无性生殖和有性生殖的特点分别与细胞的有丝分裂和减数分裂密切相关，加强这一知识点的教学，将巩固有丝分裂的知识，引出减数分裂的知识，做到温故知新。 难点分析：分析两类生殖方式的特点 一方面，无性生殖产生的后代保持亲代的性状，有性生殖产生的后代具有丰富的变异性，这两类生殖方式的特点分别与细胞有丝分裂和减数分裂相关，而教材中未加以充分说明，加之还没有学习减数分裂和遗传物质基础等关键知识，造成学生理解上的先天不足；另一方面，无性生殖和有性生殖特点的差异极大，都普遍存在于生物界，甚至很多物种在生活史的不同时期，分别具有无性或有性生殖方式，这在学生看来似乎有些矛盾和难以解释。教师应充分估计学生理解这些知识的难度，阐明这两类生殖方式各自的重要的生物学意义及在生物进化中的作用。 课时安排：一课时。 教学方法：以讨论为主的综合课。通过对不同生物生殖类型典型案例的分析和讨论，学习生物生殖的类型；通过典型案例分析，学习无性生殖技术。 教学设计方案： 引言：有生就有死，生物个体死亡，依靠生殖产生新个体来保证种族的延续，通过个体发育而成成熟的生物体。生殖：生物体产生新个体的过程。发育：生物体从一个细胞开始，经过细胞分裂、组织分化和器官形成，直到发育成性成熟个体的过程。 一、生殖的类型 1．通过设问“生物通过什么方式来传宗接代？不同生物的繁殖方式有何不同”，引出本节要研究的问题，即生殖的种类。 2．复习高等动植物的有性生殖过程。请学生举例说明桃的自然繁殖过程。注意要尽可能让学生多次参与，教师充分调动学生的积极性，做到相互启发、互相补充、互相完善。学生回答中如有遗漏、错误和模糊的问题，教师应注意补充和纠正，并提供有关图片如桃的生活史图。桃开花结实进行有性生殖，开花、传粉、受精，果实和种子的形成等，非常复杂，复习时应突出生殖细胞及所在位置、受精过程及特点。还应注意复习子房和胚珠的结构、果实和种子的形成等，这些内容是学习被子植物个体发育的基础。 3．指出低等生物也存在有性生殖方式。利用挂图讲解团藻的卵式生殖。 4．要求学生归纳：上述两种生殖方式中共同的核心过程是：产生精子和卵细胞；精子和卵细胞结合形成受精卵。指出这类生殖方式属于有性生殖。 5．由教师引导总结有性生殖的概念：通常有父方、母方；产生两性生殖细胞；经过两性生殖细胞的结合；生活史的某一阶段发生减数分裂。进行这部分内容的教学时，应注意补充下列内容： * （1）有性生殖的“性”在这里不仅是指性别，而且还指两性生殖细胞的结合，这种 生殖方式产生的后代通常有父方、母方。（若有同学提出有关“雌雄同体”的问题，应指出雌雄同体的生物也常常是异体受精，如水螅、蚯蚓、大多数开花植物等，只有极少数开花植物进行自花传粉，而自体受精）在师生分析、总结的基础上，指出，有性生殖的后代具有亲代双方的遗传特征，会产生丰富的变异，有利于生物的进化。