食源性致病菌检测现状与食品微生物危险性评估的研究进展

食源性致病菌检测现状与食品微生物危险性评估的研究进展

摘要:对食源性致病的现状及食源性致病菌的危害作了介绍，对食源性致病菌检测的主要技术现状和发展作了详述，概述了食品微生物危险性评估的研究进展。

关键词：食品安全；食源性致病菌；检测技术；危险性评估

近年来，随着经济全球化进程的加快，食品安全已成为当今世界性公共卫生热点。食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，食源性致病菌对人类健康造成极大危害，是食品安全的重大隐患。食源性疾病并不随经济发展和技术进步而减少或消失，世界范围内食品安全恶性事件接连发生，食源性疾病未能受到有效控制，食源性疾病发生率居高不下，食品安全形势严峻。

人类进入21世纪一些致病微生物的快速检测技术也得到了迅速地发展[1]，如免疫学中的放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)、化学发光免疫分析(CIA)、生物发光免疫分析(BIA)等足以检出临床标本中痕量的(10-18-10-21)微生物；抗原生物化学中的快速专有酶反应和细菌代谢产物的检测技术；分子生物学方面已经形成了核酸探针(Nuclear acid probe)[2]和聚合酶链反应(Polymerase chain reaction)[3]的检测技术，该技术以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物业，已逐步应用于食源性病原菌的检测。

1 食源性疾病的现状

近10年，全球食源性疾病发病率呈不断上升的趋势。据报道，发达国家每年约30%的人口患食源性疾病[4]。尽管没有关于发展中国家食源性疾病的系统性报道，但情况可能更严重。WHO报告表明，全球食源性疾病患者达数亿人，每年约有几亿腹泻病例，导致约300万5岁以下儿童死亡，其中约70%是因生物源性污染食品所致。在发展中国家，估计每年腹泻及其相关疾病有2.7亿病例，导致240万5岁以下儿童死亡[5],食源性疾病不但严重危害人们的健康，而且造成大量经济损失。据报道，全球每年发生40-60亿例食源性疾病，发展中国家每年约有180万人口死于食源性疾病，即使是在发达国家，每年亦有10%以上的人群感染食源性疾病[6].

2 食源性致病菌的监测技术概述

2.1 多聚酶链式反应PCR

PCR技术是由Kleppe等人在1971年首先提出的。该方法通过对人工难以培养的微生物相应DNA片段的扩增，检测扩增产物含量，从而快速地对食品中致病菌含量进行检测。检测时，首先在高温下(95℃)使得蛋白质变性，DNA双链变成单链;再迅速降温(55℃)，每条DNA单链退火，这就是所谓的热循环。之后温度重新上升到95℃，开始新的循环。经一套扩增循环(21到31次)将一个单分子DNA 扩增到107分子。整个过程可以在1h内通过自动热量循环器完成。理论上，只要样品中含有一分子沙门氏菌的DNA，通过PCR技术完全可以在短时间内检测到。这种测定方法的优点是测定结果迅速，灵敏度和特异性高，检测成本低。PCR技术采用DNA扩增和自动化程序对特定的致病菌进行检测，己经成功地对沙门氏菌川、大肠杆菌O157:H7、产单核细胞李斯特菌等致病菌进行了有效测定。

PCR技术最大的问题在于PCR产品的污染。例如前一次检测的呈阳性沙门氏菌的样品可能会进入下一次的检测体系，从而得出错误的分析结果。

2.2 实时定量PCR(real-time PCR)技术

实时定量技术是近年来发展起来的新技术，这种方法既保持了PCR技术灵敏、快速的特点，又克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点[7]。另外，还有重复性好、省力、低费用等优点。实时定量PCR技术是从传统PCR技术发展而来，其基本原理相同，但定量技术原理不同。实时定量技术应用了荧光染料和探针来保证扩增的特异性，并且荧光信号的强弱同扩增产物的量成正比，从而准确定量。该技术在基因突变的检测、基因表达的研究、微生物的检测、转基因食品的检测等领域均有重要的应用价值。

2.3 酶联免疫法ELISA

抗原-抗体反应法是测定特异性致病菌及其产生毒素最常用的方法。ELISA 是利用抗原和抗体之间的反应，在临床医学领域的许多方面都有应用。抗体在抗血清中可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。这两种抗体在ELISA技术中对于沙门氏菌、大肠杆菌0157:H7、李斯特菌等血清型细菌有很好的检测效果。检测时首先将抗体吸附到固体载体上，然后再加富集培养物，使抗体将样品中所有目的抗原结合到固体载体上。实际中常使用一种夹心模式，在该模式中，先将第二个酶标抗体加入样品中，然后加入一种能与第二个酶标抗体发生阳性颜色反应的反应底物。如果样品中没有目的抗原，酶标抗体就无法结合，也就不会发生颜色反应，反之就可以认为该样品呈阳性。

2.4 PCR-ELISA技术

常用的ELISA方法的检测时间包括加样、保温、洗涤、加抗体等时间。操作时间长，步骤烦琐。2002年美国生产的自动酶联荧光免疫检测系统(VIDAS)[8]。该系统根据ELISA的基本原理，采用“夹心技术”，检测基于PCR技术和ELISA技术各自的优缺点，M.Munch等报道了(2001年)采用PCR-ELISA技术完成了对鸟类感染病毒的快速检测，在临床、环境、流行病以及食品中致病性微生物和病毒的快速检测具有重要的意义。采用PCR-ELISA技术所测结果较通过凝胶电泳方法测得的结果灵敏度高一百倍。

2.5 直接表面荧光滤膜计数技术(DEFT)

这是一种能迅速且直接测定样品中微生物负荷量的生物化学检测法。最初英国科学家是为了对牛奶样品进行检测而开发设计，目前该方法已经应用到乳制品、肉类制品、饮料、水和污水等物质的检测中。该项检测技术需要使用膜过滤技术和表面荧光显微镜，将样品进行预培养后，利用DEFT计数。该项技术能在24h内预测5℃和11℃下保存的巴氏杀菌乳的质量是否一致。每个样品的检测时间约25min，费用较低。

2.6 生物感应器biosensor

生物感应器，既可以辨认一个分子的信号，也可以辨认大量分子的信号。整个细胞都可以用作生物感应器。在应用微生物领域游乐广阔的发展前景，检测对象包括毒素(葡萄球菌肠毒素、海豚毒素、贝类毒素等)、特定的致病菌(例如沙门氏菌、葡萄球菌、大肠杆菌0157:H7等)。其基本原理虽简单，但在实际应用中需要许多仪器共同完成。近几年来，人们普遍较为关注“生物芯片”和“微芯片”在食源性致病菌等微生物的检测。

2.7 最近似数测定方法MPN

MPN方法是对各种细胞的统计学检测来，该方法广泛应用于国内外水质的检测。该方法也列入了AOAC推荐使用的方法之列。瑞士科学家Walser报道，他曾采用全自动化系统的MPN方法对水质进行了检测操作时选用能够自动对样品稀释的无菌移液管[9]培养后，将平板置于微量滴定平板的读数仪，通过电脑实验结果，检测限为0-20000个/ml。该方法取代了常规微生物检测的费时和人工操作的误差，可以应用于食品中其他微生物的检测。MPN方法在食品中微生物细胞计数前景光明。其缺点为需要大量的玻璃器皿，也不能够观察微生物的菌落形态。

2.8 Dipstick

Dipstick近几年在医学上广泛应用于检测钩端螺旋体等病的诊断以及血吸虫

研究的快速检测[11]。它是将免疫分子亲和原理和免疫印迹法、薄层层析技术相结合的一种快速方法。Dipstick由于其操作简单，敏感性高和特异性好、无需专业人员及相关设备而日益受到人们的重视。S.B aumgartner等(2002年)研究了应用Dipstick来检测食品中鸡蛋蛋白的含量。研究结果表明，鸡蛋蛋白与抗体发生的反应并没有发生交叉反应，且检测限比采用显微照片测得的结果要低。但该方法潜在的问题为使用费用高。

3 食源性致病菌的监测体系概述

3.1 食源性致病菌监测网络

为有效地预防与控制食源性感染，必须明确食物链中的食源性病菌相关食品，确定食品污染的关键环节，通过大力发展和运用高新技术，建立和完善食源性疾病监测和预警系统，增强对食源性疾病暴发的反应和预警能力，降低食源性疾病的发生率。

目前，只有美国、英国、加拿大和日本等少数国家建立了食源性疾病年度报告制度。但据WHO报告，世界各国食源性疾病实际发生的病例数要比报告的病例数多300-500倍，报告的发病率不到实际发病率的10%,漏报率相当高，全球食源性疾病发病率难以准确估计，所得报告病例数只是“冰山一角”。

3.2 我国食源性致病菌监测体系

我国对食源性致病菌的系统监测起步较晚，虽然拥有一套有效的食物中毒报告系统，但还缺乏一个健全的食源性疾病监测体系，难以准确

估计食源性疾病的发病状况。针对食源性疾病报告与监控体系的不足，2000年中国CDC建立了全国食品污染物监测体系，构建了国家级监控网络和数据库，将微生物危险性评估技术、DNA指纹图谱分型技术、病原微生物PCR快速检测技术作为食品安全关键技术进行攻关研究，运用到我国的食源性疾病监控体系上，该监测网的建立使我国疾病预防控制部门及时掌握食源性疾病的状况，快速应对重大食源性疾病突发事件，为食源性疾病监控提供了一个技术平台，为缩小我国食源性疾病监控技术与发达国家的差距莫定了坚实的基础。

4 食品微生物危险性评估的研究进展

食品中来自微生物性危害的危险性与人类健康密切相关，而危险性评估是一个系统程序，评估人体暴露于受污染的食品而产生的危害人体健康的可能性[9]。1995年国际食品法典委员会(CAC)对危险性评估的定义:对人体暴露于食源性危害而产生的危害人体健康的已知或潜在的作用的发生可能性及其严重程度的科

学评估，其框架包括4个主要步骤:危害的确定、危害特征的描述、暴露评估和危险性特征的描述，这些步骤构成了评估食用可能污染致病菌或,湘微生物毒素的食品而对人产生不良健康后果及其发生概率的系统过程。1998年CAC拟定的微生物危险性评估总则和指引草案都对此做出定义。微生物危险性评估在危险性评估中是一个较新的领域，至今还没有一个国内外公认的标准。

建立模型是进行危险性评估的重要内容，预测微生物模型属于暴露模型中的亚模型，这些模型以数学形式来描述细菌数量与时间变化的关系，受环境因素的影响，从而准确描述微生物行为。预测微生物模型可预测不同环境条件下微生物生长、存活及灭活等反应[9]。自20世纪80年代以来，已建立了许多用于微生物食品安全的预测数学模型，许多国家对预测微生物学的研究十分重视，但对致病菌的剂量反应模型却认识不足，所谓剂量反应关系评估，是指确定暴露于各种有害因子的剂量，与所产生的危害健康的反应之间的关系(包括该反应的严重程度)，但有关数学模型的方法尚未完全建立有关危险性评估已发表的文献，能够完全符合CAC的要求的正式研究还不多。据统计，1999年6月之前已发表的关于微生物性危险性评估的66篇文献，其中大部分属于综述(占53%)，而属于论文的只有7篇，针对某种特定病原菌或食品进行微生物性危险性评估，可用作为这个新领域的主要参考文献，如Cassin等对牛肉馅汉堡包中大肠杆菌0157:H7 进行了危险性评估，该论文运用场景分析和预测微生物学技术对加工全过程的卫生学特征提供了一个客观的评估，是一篇非常接近法典所定义的微生物性危险性评估的论文。来自美国的一项关于带壳鸡蛋及蛋制品中肠炎沙门氏菌的研究建立了一个从资料收集、分析，到定量危险性模型与危险性控制战略的概念性框架。荷兰的一项关于巴氏消毒牛奶中蜡样芽胞杆菌对消毒的危险性研究，就包含了对储藏时间与温度的研究。

5 结语

食品安全是一个全球性重大公共卫生问题。尽管科学技术已发展到了相当的水平，但食品污染和食源性疾病在发达国家和发展中国家仍普遍存在，发病率持续增高，新的病原体感染不断出现，食品安全形势变得更加严峻，公共卫生面临着许多新的挑战。因此，必须健全相关的法律法规，建立和完善食源性疾病报告制度和监测系统，推广和应用先进的食品安全控制技术，加大监管力度，对食品从业人员和消费者进行健康教育，提高其食品卫生意识和责任感。总之，要采取积极有效的措施，消除食品中的危险因素，预防和控制食源性疾病的发生。

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