Trustline结核分枝杆菌I_省略_试剂盒_胶体金法_的临床应用评价_吕冰
◇技术方法◇Trustline结核分枝杆菌IgG/IgM抗体检测
试剂盒（胶体金法）的临床应用评价
吕冰1，2，万李1，潘其林3，孙桂芝4，杨宝财5，王金峰6，刘姣1，万康林1
摘要：目的评价Trustline结核抗体IgG/IgM检测试剂盒临床应用效果。方法选用3家医院的1009份血清标本，其中628份为结核病患者血清（308例菌阳病例，320例菌阴病例）；对照组381份非结核病血清。采用Trustline 试剂盒及一种已上市的试剂盒（对照试剂盒）分别检测1009份血清，计算多项检测指标，从而评价试剂盒的检测效果。结果通过检测1009份临床血清标本，Trustline试剂盒检测血清抗体（IgG+IgM）的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、Youden指数分别为61.3%、79.8%、83.3%、55.6%和0.411，对照试剂盒检测血清抗体（IgG）的结果分别为53.7%、89.0%、88.9%、53.8%和0.426。经统计分析表明Trustline试剂盒的灵敏度显著优于对照试剂盒（P＜0.01），特异度低于对照试剂盒（P＜0.01），但阳性诊断效率和阴性诊断效率方面差异无统计学意义，Youden指数相接近。进一步分析显示Trustline试剂盒对菌阳样本及菌阴样本的检出率分别77.6%和44.7%，对照试剂盒则为67.9%和40.0%，对菌阳样本检出率的差异有统计学意义。检测1009份标本，Trustline试剂盒共得IgM阳性35例，其中结核组阳性30例（4.8%），非结核组阳性5例（1.3%）。结论Trustline试剂盒检测结核抗体的灵敏度显著优于对照结核抗体试剂盒，并可同时用于检测IgG/IgM抗体，可以应用于结核病的快速诊断。
关键词：结核病；血清学诊断；免疫层析胶体金
中图分类号：Ｒ52文献标志码：A文章编号：1003－9961（2013）10－0861－05
Evaluation of application of Mycobacterium tuberculosis antibody detection kit：Trustline TB IgM/IgG rapid test kit LYU Bing1，2，WAN Li，Charles Pan，SUN Gui-zhi，YANG Bao-cai，WANG Jin-feng，WAN Kang-lin．1．Institute for Communicable Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，State Key Laboratory for Communicable Diseases Prevention and Control，Beijing102206，China；2．Beijing Centers for Disease Control and Prevention and Centers for Preventive MedicalＲesearch，Beijing100013，China
Corresponding author：WAN Kang-lin，Email：wankanglin@icdc．cn
Abstract：Objective To evaluate the application of a newly approved serological diagnostic kit for tuberculosis（TB）diagnosis：Trustline TB IgG/IgM rapid test kit．Methods In this multiple center study，1009serum specimens were collected from three hospitals and tested with Trustline TB IgG/IgM rapid test kit and a commercial TB Ab（IgG）colloid gold test kit（control test）．Among the1009specimens，628were from TB patients and381were from non TB individuals．By gold standard bacteriological tests，308of the628specimens were positive and320were negative．Ｒesults The sensitivity，specificity，positive predict value，negative predict value and Youden index on the1009 specimen detection by the Trustline TB IgG/IgM rapid test kit was61.3%，79.8%，83.3%，55.6%and0.411 respectively，and53.7%，89.0%，88.9%，53.8%and0.426by the control test kit．The differences in sensitivity and specificity between the two tests were statistically significant（P＜0.01）．Further analysis showed that the detection rate of TrustlIne IgG/IgM test kit was77.6%for positive specimens and44.7%for negative specimens，while the related detection rates of the control test kit were67.9%and40.0%respectively；there was significant difference in positive specimen detection between the two kits．In addition，this study showed that35of the1009specimens were IgM positive by Trustline test kit，in which30（4.8%）were from TB patients，and5（1.3%）were from non TB individuals．Conclusion Trustline TB IgG/IgM rapid test kit is more sensitive in the detection of TB antibody in serum specimens compared with control test kit．The Trusline TB IgG/IgM test kit can detect both IgG and IgM in one test．It is recommended to be sued as TB screening test kit．
Key words：tuberculosis；serodiagnosis；colloid gold immunochromatographic assay
作者单位：1．中国疾病预防控制中心传染病预防控制所/传染病预防控制国家重点实验室，北京102206；2．北京市疾病预防控制中心传染病地方病控制所，北京100013；3．美国圣地亚哥CTK生物技术有限公司/北京健乃喜生物技术有限公司；4．北京老年病医院；5．华北油田公司总医院；6．河北省沧州传染病医院
作者简介：吕冰，女，黑龙江省人，副研究员，主要从事结核分枝杆菌及腹泻病原菌的病原学研究工作
通信作者：万康林，Tel：010－61739466，Email：wankanglin@icdc．cn
收稿日期：2013－05－09
据世界卫生组织（WHO）报道［1］，目前全球有近1/3的人已感染结核杆菌，也就是20亿人口感染了结核菌。全球有活动性肺结核患者约2000万，每年新发结核病患者约800 1000万，每年约有300万人死于结核病。结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。我国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第2位，近5年每年新发结核病100多万例。
结核病的诊断主要结合患者的临床症状、X线片及实验室痰检和细菌培养结果。其中传统的实验室诊断方法———痰检，虽然特异性高，但灵敏度极低，并且无法用于结核性胸膜炎及其他肺外结核的诊断；而细菌培养方法的灵敏度低，费时长而不能及时提供诊断结果。因此，人们一直致力于发展新型的快速检测技术，如免疫学检测技术［2］、核酸检测技术［3］等。
免疫胶体金技术是20世纪80年代继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术［4］。最初该方法仅用于免疫电镜技术，现在已经发展到被动凝集试验、光镜染色、免疫印迹、免疫斑点渗滤法以及免疫层析技术等［5－6］。它往往以条状纤维材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上预包被的该待测物特异性受体发生高亲和性免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域，通过可目测的标记物———胶体金而得到直观的实验结果。该技术由于无需特殊仪器，结果由肉眼观测，操作人员无需特殊的培训，结果可在10 20min内获得，产品可在室温下保存，且保存期长，特别适合于广大基层单位、医院、野外作业人员以及大批量时间紧的检测和大面积普查等，现已成为当今最快速敏感的免疫学检测技术之一［4，7－11］。
本研究采用大样本临床应用，以合格的同类产品作对照，对一种新研制的胶体金法结核IgG/IgM 检测试剂盒进行了临床检测效果评价。
1材料与方法
1.1结核病血清学检测试剂盒待评价试剂盒为Turstline结核分枝杆菌IgG/IgM抗体检测试剂盒（胶体金法）（Turstline试剂盒）；对照试剂盒为已获国家批准上市的结核分枝杆菌抗体（IgG）胶体金法诊断试剂盒［国药准字20030090］（下称对照试剂盒），该试剂采用渗滤胶体金法，具有上市较早，重复性好等优点，因此在此次临床试验中选其作为对照试剂。
表1选用的试剂盒规格信息表
Table1Basic information of selected kits
名称
规格
（人份/盒）
批号效期
保存条件
/?Turstline试剂盒30F0325B118个月2 30
对照试剂盒152********个月2 8
1.2临床样本1009份血清由北京老年医院（原北京胸科医院）、华北油田公司总医院和沧州传染病医院提供。入选病例标准，按中华医学会出版的《临床技术操作规范（结核病分册）》的要求，选择医院结核病例628例，包括继发性肺结核、急性血行播散型肺结核、血行播散型肺结核、急性粟粒性肺结核及其他结核，其中308份细菌学检测阳性，320份细菌学检查阴性；381份对照血清，为非结核病样品包括体检人员样品、非结核肺部感染样品（注：细菌学检查包括痰涂片、痰结核菌培养）。
病例血清分组如下，总检测1009例病例血清分为2组，结核病确诊病例组628份，对照组381份。其中病例组血清包括细菌学检测阳性308份，细菌学检查阴性320份。三家不同医院临床样本情况见表2。
表2三家医院研究人群血清样本分布
Table2Population distribution of the samples collected
from three hospitals
医院
合计
临床样本
结核病
患者数
非结核
患者数
结核病患者
百分比/%
北京老年医院3312419072．8
华北油田公司总医院35018816253．7
河北省沧州传染病医院32819912960．7合计100962838162．2
1.3实验方法血清学检测：分别用Trustline试剂盒、对照试剂盒按厂家操作说明书检测三家医院收集的血清，观察记录结果，并计算检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、Youden指数、菌阳及菌阴样本检测率，比较两种试剂盒的诊断效果。
细菌学检查：收集所有临床诊断结核病例的痰标本，采用常规涂片抗酸染色检查和常规LJ培养基细菌培养方法［12］进行检查，涂片和/或细菌培养检查阳性或阴性者判断为细菌学阳性（菌阳）或阴性（菌阴）。
1.4统计学分析两种方法的等效性检验采用
Cohen's Kappa等效性检验，Kappa值≥0.75，两者等效性较好，Kappa值≥0.4，两者等效性一般，Kappa值＜0.4，两者等效性差。分析两种试剂对一系列样本检验结果的差异是否有统计学意义，使用标准Z检验，P≤0.01，差异有显著统计学意义，P≤0.05，差异有统计学意义，P＞0.05差异无统计学意义。
2结果
2.1两种试剂盒总体检测结果比较同时对1009份血清抗结核抗体进行了检测，以临床诊断为标准，Trustline试剂盒（IgG+IgM）的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Youden指数分别为61.3%（385/628）、79.8%（304/381）、8
3.3%（385/462）、55.6%（304/547）和0.411（385/628+ 304/381－1）；对照试剂盒（IgG）检测结果分别为53.7%（337/628）、89.0%（339/381）、88.9%（337/379）、53.8%（339/630）和0.426（337/628+ 339/381－1）。
两种试剂盒的检测结果经过Z检验，灵敏度Z 值2.71，特异度Z值3.5，均＞Z0.01。表明两种试剂盒的灵敏度及特异度差异有高度显著的统计意义（P＜0.01），但阳性诊断效率、阴性诊断效率方面二者差异无统计学意义，Youden指数相似，见表3、4。
表3两种试剂盒检测1009份血清结果
Table3Detection result of1009serum samples
with two kinds of kits
试验分组Trustline试剂盒
阳性阴性
奥普试剂盒
阳性阴性
合计
结核病例组385243337291628非结核病例组7730442339381合计4625473796301009
表4Trustline试剂盒与奥普试剂盒检测
1009份血清抗结核结果比较
Table4Comparison of1009serum sample detection
results between two kinds if kits
试剂盒敏感度
/%
特异度
/%
阳性预测值
/%
阴性预测值
/%
Youden
指数
Trustline试剂盒61．379．883．355．60．411奥普试剂盒53．789．088．953．80．426
2.2两种试剂盒与细菌学检测结果比较临床诊断为结核病的病例中，根据细菌学检测结果将病例组血清分为308份细菌学检查阳性（菌阳）病例和320份细菌学检查阴性（菌阴）病例。Trustline试剂盒和对照试剂盒检测菌阳抗结核IgG抗体的阳性率分别为77.6%（239/308）和67.9%（209/308）、菌阴病例抗结核IgG抗体的阳性率分别为44.7%（143/320）和40.0%（128/320），统计学显示P＜0.05，检测结果见表5。
表5两种试剂盒检测菌阳/菌阴病例血清抗体结果
Table5Detection results of positive and negative
samples with two kinds of kits
试验分组
Trustline试剂盒
阳性阴性
对照试剂盒
阳性阴性
合计
菌阳病例组2396920999308
菌阴病例组143177128192320合计382246337291628 2.3Trustline试剂盒与对照试剂盒检测IgG抗体结果比较分析以对照试剂盒IgG抗体检测结果作参照，Trustline试剂盒检测IgG抗体结果的阳性符合率为70.8%（269/380），阴性符合率为70.4%（443/629），总符合率为70.6%（712/1009），见表6。
表6Trustline试剂盒与对照试剂盒检测
IgG抗体结果比较分析
Table6Comparison of IgG detection
results between two kinds of kits
对照试剂盒
Trustline试剂盒
阳性阴性
合计阳性269111380
阴性186443629
合计4555541009
Cohen's Kappa等效性检验的结果显示Kappa 值=0.4，两者对结核IgG抗体的检测有一定的等效性。
2.4三家医院Trustline试剂盒检测IgG/IgM抗体结果以临床诊断为金标准，北京老年医院（原北京胸科医院）、河北省沧州传染病医院和华北油田公司总医院三家医院采用Trustline试剂盒检测血清IgG/IgM抗体的灵敏度分别为61.8%、67.3%和54.3%；特异度分别为61.1%、8
3.7%和87.3%；阳性预测值分别为81.0%、86.5%和83.0%；阴性预测值分别为37.4%、62.4%和62.1%；Youden指数分别为0.23、0.51和0.42，在可接受的取值范围，三家医院结果表明该试剂盒有较好的诊断性。检测结果见表7。
2.5Trustline试剂盒检测血清抗结核IgM抗体结果381份非结核病患者样本的IgM检测结果5例（1.3%）阳性，628份临床结核病患者样本30例（4.8%）IgM阳性，见表8。IgM阳性的30例临床患
表7三家医院Trustline试剂盒检测IgG/IgM
抗体结果比较分析
Table7Comparison of IgG/IgM detection results with Trustline kit in three hospitals
试验分组北京老年医院
阳性阴性
沧州医院
阳性阴性
华北油田总医院
阳性阴性
总计
阳性阴性
病例组149921346510286385243非病例组3555211082114177304合计184147155173123227462547
表8Trustline试剂盒检测1009份血清抗结核IgM抗体结果Table8IgM detection result of1009serum
samples with Trustline kit
对照试剂盒Trustline试剂盒检测结果
阳性阴性
总计
结核病确诊病例30598628
对照组5376381
合计359741009
者中有2例为急性血型播散型结核、28例继发肺结核；IgG与IgM同为阳性的有26例（87%）。
3讨论
长期以来，结核病微生物学检验技术主要限制于病原体的直接检测［13］，如涂片染色镜检、分离培养等。这些技术有其优点，特异性高，一直是结核病诊断的金标准。但这些方法检测临床标本阳性率比较低，耗时长，需费时2 8周，特别是对涂阴、培阴、无痰的肺结核或肺外结核病患者更难以诊断，影响到治疗方案的确定，无法满足临床的需要。而检测血清中结核抗体的方法却具有早期辅助诊断价值，对肺外结核也具有辅助诊断意义［13－14］。所以各地的专家学者希望通过血清学方法快速诊断结核病，该方法也成为众多学者研究的方向之一。
目前国内生产的用于诊断结核抗体的血清学检测试剂盒产品逐渐增多，多采用胶体金法及酶联免疫法。在本次试验中，采用已批准上市的结核分枝杆菌抗体胶体金试剂盒［国药准字20030080］作为对照试剂盒进行对比试验研究。这种对照试剂盒主要应用斑点金免疫渗滤试验（DIGFA）方法，用纯化的结核分枝杆菌膜蛋白38?103抗原包被硝基纤维膜，38?103抗原可捕获血清标本中的IgG结核抗体，被捕获的结核抗体可以与葡萄球菌A蛋白（SPA）胶体金缀合物相结合呈现红色斑点［15］，共有5步繁琐的操作过程。而本次实验研究用的Trustline结核分枝杆菌IgG/IgM抗体检测试剂盒采用免疫层析胶体金法，联合使用包括结核抗原6?103、14?103、16?103及38?103在内的4个结核重组抗原检测，提高了诊断灵敏度［16－17］，只有一个简便的操作步骤、快速出结果、更能检测结核IgM抗体的产品，更适于各级各类实验室使用。
本次实验研究显示两种试剂盒总体检测阳性及阴性诊断效率差异无统计学意义，IgG检测Kappa 值=0.4，表明在总体临床诊断上两种试剂盒性能无明显的差异。但是进一步分析显示Trustline试剂盒的抗体检测灵敏度为61.3%，显著高于对照试剂盒53.7%（P＜0.01）；Trustline试剂盒的高灵敏度要在于对菌阳的检测高于对照试剂盒（77.6%vs．67.9%）。而Trustline试剂盒特异度明显低于对照试剂盒（P＜0.01）。众所周知，中国人群结核病感染率高（达44.5%）［1，18］，而感染者中的5% 10%会表现出活动性结核的症状，其他大部分感染者呈隐性感染［1，19］。随着检测方法的灵敏度增高，检出潜伏感染率增高，以致阴性对照人群中“假阳性”增多，特异性下降。因此，我们认为特异度低的原因是由于该试剂盒比对照试剂盒更敏感，能够检测到更多的隐性感染个体，可能更适合于健康体检或人群肺结核感染的筛查。
Trustline检测试剂盒是目前唯一上市的可检测IgM的试剂盒。对1009份标本测试共得IgM阳性35例，其中结核病组阳性率4.8%，对照组阳性率1.3%。作为慢性传染病IgM的检出率很低，可能与样本采集的时间有关。而一个现象是大部分（26/30=87%）病例的IgM与IgG同时出现，这些患者属于继发性结核病例。提示结核病患者痊愈后经过较长时间再发病，无论是内源性复燃或是外源性再感染，均有可能重新诱导抗结核IgM抗体的产生。此外，如果这些患者的结核分枝杆菌出现突变现象，也会诱导新的抗结核IgM抗体的产生。我们还观测到有5例IgM阳性出现在非结核病患者中，很可能也与结核病的隐性感染有关。
本研究通过临床大样本检测，Trustline试剂盒抗体检测的灵敏度显著优于对照试剂盒的检测灵敏度，而且操作简单，检测时间短，可在10min内检测出人体血清或血浆中的抗TB IgG抗体和IgM抗体。对细菌学检测阴性的结核病患者样品，Trustline检测试剂盒可有44.7%的灵敏度，因此与结核金标准方法（如痰涂片抗酸染色显微镜检查）联合可以增加结核的诊断效率。此外，Trustline试剂盒能够检测抗结核IgM 抗体，这是对照试剂盒所不具有的功能。
虽然本次实验结果Trustline试剂盒检测结核抗体的灵敏度仅为61.3%，结核抗体检测方法在结核病的鉴别诊断中价值有限，但是该Trustline试剂盒优于对照试剂盒，可以应用于我国的结核病实验室检验。
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