基因工程基因表达

2.1鉴定DNA分子上蛋白的结合位点
结合蛋白质后分子将增加重量
凝胶滞后 gel retardation。 首先酶切结合区域。
调控区域可能小于10bp，很难精细的定位。
2.1鉴定DNA分子上蛋白的结合位点
Footprinting with DNase I （ DNase I足迹法）
原理：结合蛋白后，可以保护该段分子免受 核酸酶的降解。
沉默子
启动子
增强子
2.2 通过deletion分析鉴定控制序列
报告基因将模仿原有基因的表达模式。
报告基因的选择原则：
首先它控制的是寄主生物体所没有 的性状；
报告基因必须容易检测； 可定量分析。
Reporter genes
Fig.10.13 Deletion analysis. A reporter gene has been attached to the upstream region of a seedspecific gene from a plant.
sequence 方框内表示起始密码子（ATG）和终止密码子（TAG）；下划 线表示引物位置
2 研究基因表达的调控
鉴定DNA分子上蛋白的结合 位点
通过deletion分析鉴定控制 序列
2.1鉴定DNA分子上蛋白的结合位点
结合蛋白质后分子将增加重量 结合蛋白质后，将保护DNA分子免
受核酸酶的降解。 修饰干扰实验（Modification
3.2 体外突变分析蛋白质
将重组的分子转染感受态E. coli，由
于DNA的半保留复制，转染的噬菌体在 固体培养基上形成噬菌斑，一半是突 变的，另一半是未突变的。 利用寡聚核苷酸作探针进行菌落杂交， 在非常严格的条件下，可以筛选突变 的分子。
Point mutation
3.3 研究突变体
DNA/DNA DNA/RNA
Intron detection
1.2 利用核酸酶分析DNA-RNA杂交分子
原理：单链特异核酸酶，如S1核酸酶， 可降解单链DNA或者RNA，对双链的 DNA或者DNA-RNA杂交分子不起作用。
1.2 利用核酸酶分析DNA-RNA杂交分子
方法：
含有基因的DNA分子与RNA转录物进行 杂交，未杂交的DNA将被降解，产生完 全的双链杂交分子。
during floral bud dormancy releasing by northern blot.
PsPII PsDHN PsARP PsMPT PsCXE PsSERK1 PsPOB EF
.
RT-PCR: 是以RNA为 初始模板的PCR技术， 先通过逆转录酶将 mRNA反转录成cDNA， 然后通过PCR扩增 cDNA片段。
Figure 10.5 Locating a transcription start point by S1 nuclease mapping
1.3 研究RNA转录的其他技术
引物延伸反应 RNA印迹法（Northern blotting） 逆转录PCR(RT－PCR） cDNA末端快速扩增（rapid
M13侵染的细胞并不裂解，而是正 常的分裂。因此克隆到M13的基因 可以正常的表达，产生重组蛋白， 并纯化出来，研究其特性。因此可 以研究单核苷酸的变异对蛋白活力 的影响。
3.4 Oligonucleotide-directed mutagenesis的潜力
Oligonucleotide-directed mutagenesis的意义。
chapter 10 研究基因的表达
三种情况：
学习内容：
转录的分析方法，基因内是否含有内 元，以及起始位点和终止位点的位置。
基因表达调控 鉴定克隆基因的表达产物。
1 克隆基因的转录
方法：
电子显微镜观察 利用单链特异的核酸酶。
1.1 电子显微镜观察
如果基因内含有内元，DNA序列部 分区域就不能与其mRNA配对杂交。
system）
酵母单杂交系统可鉴定与启动子顺式调 控元件结合的转录因子（反式作用因子）
思考题
鉴定基因内元的方法 鉴定蛋白质结合位点的方法 研究基因表达调控的方法 报告基因的原则 名词： Oligonucleotide-directed
mutagenesis; Footprinting with DNase I； gel retardation；S1核酸酶作图法
Real-time PCR技术
5’ M 3’
3’ M 5’
5’ M 3’
373bp
303bp 303bp
373bp 373bp
3
A
B
C
图4-3 PsARP 3’ 和5’端RACE扩增产物及其鉴定
Fig. 4-3 the RACE products of 3’ or 5’ cDNA of PsARP and further confirmations
例如生化学家可以研究蛋白结构对酶活 性的影响。也产生了蛋白质工程。
枯草杆菌蛋白酶是一种生化洗涤剂，用 来洗涤机器。通过位点突变产生的新的 工程酶，对高温和漂白（氧化）具有极 高的耐受力。
4 蛋白与蛋白之间的相互作用
噬菌体展示（phage display） 酵母双杂交系统（yeast two hybrid
A——RACE扩增结果 B——菌液PCR鉴定结果 C——质粒酶切鉴定结果
5’——5’RACE扩增产物（373bp） 3’——3’RACE扩增产物（303bp）
M——DL2000 marker
图4-4 PsARP 基因的全长cDNA序列及其编码的蛋白质氨基酸序 列
Fig. 4-4 The full-length cDNA of PsARP and the deduced amino acid
amplification of cDNA ends，RACE） RNA测序：效率很低，通常采用测定RT-
PCR产物的方法了解RNA序列。
28S rRNA 18S rRNA
5S rRNA
图3-1 内休眠解除过程中不同时期提取的牡丹花芽的总RNA电泳图谱 Fig. 3-1 Ethidium bromide-strained 1.2% agarose formaldehyde gel of total RNA isolated from tree penoy buds in different
利用不同的策略可以删除基因上游的 任何区域。
如果表达量增加，说明删除了抑制区 域
表达减少说明删除了增强子 组织特异性的变化表明组织反应序列
被删除。
3.1 HRT和HART鉴定基因的翻译产物
释放转移杂交法（HRT, Hybrid-release translation）和阻断转移杂交法（HART, Hybrid-arrest translation）可以鉴定克隆 基因的翻译产物。两种方法都利用纯 化的mRNA通过细胞外翻译系统直接合 成蛋白质。
表10-1 高等生物中应用的部分报告基因
基因 lacZ neo cat dhfr aphlv lux uidA
基因产物
分析
β-半乳糖苷酶
组织化学检测
新霉素磷酸转移酶 Kan抗性
氯霉素乙酰基转移酶 氯霉素抗性
二氢叶酸还原酶 氨甲蝶呤抗性
潮霉素磷酸转移酶 潮霉素抗性
荧光素酶
生物荧光
葡糖醛酸酶
组织化学
2.2 通过deletion分析鉴定控制序列
人工基因合成（artificial Gene synthesis）
PCR 构建突变体
见课本207页
3.2 体外突变分析蛋白质
在克隆的基因中引入突变
纯化单链DNA，并通过测序鉴定DNA序列。 然后合成一段与相关DNA互补的核苷酸，但在
特异的位点碱基已经改变，这一小段核苷酸 可作为引物引导互补链的合成，利用DNA聚合 酶I的Klenow片段，形成重组的双链DNA分子。
加入DNase I，保证DNA分子的部分降解。 如果DNA片段未与蛋白结合，将产生一系 列的标记的片段。然而结合蛋白区域将 不被酶切，这样产生的系列片段是不完 全的，受到保护的片段在电泳中是不存 在的。在放射性自显影中呈现足迹。
修饰干扰实验（modification interference assay）
硫酸二甲酯等甲基化试剂修饰核苷酸，甲 基化的DNA不能再与蛋白结合
哌啶试剂断裂甲基化的位点 见课本199页
2.2 通过deletion分析鉴定控制序列
原理：删除控制序列，可以改变克 隆基因的表达调控方式。
报告基因 缺失分析
Figure 10.6 Possible positions for control sequences in the region upstream of a gene.
periods during dormancy releasing by CTAB
PsARP
PsMPT
PsCXE
PsDHN
rRNA
图3-2 花芽内休眠解除过程中部分差异基因表达模式的Northern blot分析 Fig. 3-2 Expression patterns of 8 clones (PsPII, PsDHN, PsGA20, PsARP, PsMPT, PsCXE, PsSERK1 and PsPOB) selected from the subtractive cDNA library
Fig. 10.9 A bou
from degradation by a nuclease such as Dnase I
Footprinting
(足迹法）
Footprinting with DNase I
对DNA片段的一端放射性标记，然后再与 调节蛋白混合。
该部分自学
Using mutation in the coding region to determine protein function