大学生科创基金申请书 野生大豆SNARE转运蛋白基因启动子克隆及表达特性研究

一、目的意义、国内外研究概况、主要创新 目的意义、国内外研究概况、 之处 主要研究内容、 二、主要研究内容、目标与技术经济指标 三、研究方法与技术路线 前期研究基础、 四、前期研究基础、实验条件 五、经费预算 六、年度研究计划及预期进展 七、主要项目组成员介绍
一、项目研究的目的意义、国 项目研究的目的意义、 内外研究概况、 内外研究概况、主要创新之处
2.2 基因表达分析的研究进展
2.2.1基因表达分析的内容 基因表达分析的内容 分析基因的表达特性， 分析基因的表达特性，对阐明基因的功能和作用机制 具有指导性的意义。对于基因表达情况的分析， 具有指导性的意义。对于基因表达情况的分析，主要 包括基因的表达模式分析、发育阶段依赖性分析、 包括基因的表达模式分析、发育阶段依赖性分析、组 织定位分析、亚细胞定位分析等。 织定位分析、亚细胞定位分析等。 基因的表达模式分析指基因在特定的处理条件下的表 达变化趋势， 达变化趋势，可一定程度上揭示该基因与处理条件之 间的关系。 间的关系。 发育阶段依赖性分析即指在植物发育的不同阶段基因 的表达情况，反映了基因与植物发育相关的信息。 的表达情况，反映了基因与植物发育相关的信息。 组织定位分析即基因在植物不同组织中的表达情况分 析。 亚细胞定位分析是指某种蛋白或表达产物在细胞内的 具体存在部位，如仅在核内存在，还是胞质内存在， 具体存在部位，如仅在核内存在，还是胞质内存在， 还是细胞膜上存在。 还是细胞膜上存在。
2.2.2 基因表达分析的内容
GFP融合蛋白是应用亚克隆技术，将目的基因与GFP 融合蛋白是应用亚克隆技术，将目的基因与 融合蛋白是应用亚克隆技术 基因构成融合基因，通过愈伤组织转化法、基因枪、 基因构成融合基因，通过愈伤组织转化法、基因枪、 显微注射、电激转化等方法转化到合适的细胞， 显微注射、电激转化等方法转化到合适的细胞，通过 GFP荧光观察分析基因在不同亚细胞结构中的表达。 荧光观察分析基因在不同亚细胞结构中的表达。 荧光观察分析基因在不同亚细胞结构中的表达 在荧光显微镜下，如果看到细胞内某一部位存在GFP 在荧光显微镜下，如果看到细胞内某一部位存在 信号，则说明和GFP融合的蛋白也存在于该部位，这 信号，则说明和 融合的蛋白也存在于该部位， 融合的蛋白也存在于该部位 样就达到了确定某物质亚细胞定位的目的。 样就达到了确定某物质亚细胞定位的目的。 启动子驱动GUS基因表达，是通过待分析基因的启动 基因表达， 启动子驱动 基因表达 子区，控制GUS报告基因的表达，从而分析该基因在 报告基因的表达， 子区，控制 报告基因的表达 不同组织、发育阶段等的表达。通过GUS染色的变化 不同组织、发育阶段等的表达。通过 染色的变化 区分基因在不.1.2植物 植物SNARE核心复合体的结构 植物 核心复合体的结构
囊泡膜与靶目标膜融合时， 囊泡膜与靶目标膜融合时，会形成 SNARE核心复合体 (称为 称为SNARE pin或 核心复合体 称为 或 SNARE core complex)，它是由 ，它是由QSNAREs和R-SNAREs 的4个SNARE 结 和 个 构域结合在一起形成的四螺旋束构成。 构域结合在一起形成的四螺旋束构成。 SNARE核心复合体的 核心复合体的SNARE蛋白通常包 核心复合体的 蛋白通常包 个突触融合蛋白(Syntaxin，含有 括1个突触融合蛋白 个突触融合蛋白 ，含有QaSNARE结构域 、1个SNAP25类蛋白 含 结构域)、 个 类蛋白(含 结构域 类蛋白 结构域)和 个 有Qb-和Qc-SNARE结构域 和1个 和 结构域 VAMPs(含有 含有R-SNARE 结构域 。 结构域)。 含有
2.1.3 SNARE蛋白参与植物非生物胁迫反 蛋白参与植物非生物胁迫反 应
NPSN是植物特有的 是植物特有的SNAREs成员，它在植物 成员， 是植物特有的 成员 应对各种非生物胁迫的过程中扮演着重要的角 进一步地分析证明， 色。进一步地分析证明，野生型植株在受到盐 胁迫时， 胁迫时，含有 H2O2 的囊泡与液泡的融合会 对植物造成毒害。另有研究证明， 对植物造成毒害。另有研究证明，囊泡运输的 调节基因也参与了植物对非生物胁迫的响应。 调节基因也参与了植物对非生物胁迫的响应。 囊泡融合在植物抵御非生物胁迫中的分子机制 还有待于进一步的研究， 还有待于进一步的研究，与之相关的 SNAREs 家族其他成员的鉴定将为此机理的揭示提供强 有力的论据。 有力的论据。
思路
本研究以模式植物拟南芥为试材， 本研究以模式植物拟南芥为试材，通过 GsSNARE基因启动子驱动 基因启动子驱动GUS基因的表达， 基因的表达， 基因启动子驱动 基因的表达 在转基因拟南芥中研究GsSNARE基因在不同 在转基因拟南芥中研究 基因在不同 组织中的表达特性、 组织中的表达特性、在植株不同发育时期的表 达特性、及在盐、 达特性、及在盐、ABA胁迫处理下的表达特性 胁迫处理下的表达特性 该研究通过对GsSNARE基因表达特性的研 。该研究通过对 基因表达特性的研 指导下一步GsSNARE基因在植物逆境胁 究，指导下一步 基因在植物逆境胁 迫下的功能分析及抗非生物胁迫机制研究， 迫下的功能分析及抗非生物胁迫机制研究，并 且为转基因育种提供重要的基因资源。 且为转基因育种提供重要的基因资源。
2．国内外研究概况 ．
2.1 SNARE转运蛋白基因研究进展 转运蛋白基因研究进展
2.1.1植物 植物SNARE蛋白的分类 植物 蛋白的分类 2.1.2植物 植物SNARE核心复合体的结构 植物 核心复合体的结构 2.1.3 SNARE蛋白参与植物非生物胁迫反应 蛋白参与植物非生物胁迫反应
2.2 基因表达分析的研究进展
2. 项目研究目标与技术经济指标
(1) 获得GsSNARE基因启动子植物表达载体 1个； (2) 获得GsSNARE基因启动子转基因拟南芥 株系3-4株； (3) 初步阐明GsSNARE基因的表达特性； (4) 发表相关学术论文1篇。
三、项目研究方法与技术路线
1. 项目研究方法 (1) GsSNARE基因启动子序列分析采用 基因启动子序列分析采用PLACE 软件； 软件； (2) GsSNARE基因启动子克隆采用常规分子生 物学方法； 物学方法； (3) GsSNARE基因启动子表达载体构建采用酶 切连接常规方法； 切连接常规方法； (4) GsSNARE基因启动子转基因拟南芥的获得 采用花序侵润法； 采用花序侵润法； (5) GsSNARE基因表达特性研究采用 基因表达特性研究采用GUS染色 染色 方法。 方法。
2.2.1基因表达分析的内容 基因表达分析的内容 2.2.2 基因表达分析的内容
2.1 SNARE转运蛋白基因研究进展 转运蛋白基因研究进展
2.1.1植物 植物SNARE蛋白的分类 植物 蛋白的分类 植物细胞囊泡运输过程中的膜融合主要是由 SNARE蛋白介导的，通过比较了人和酵母的 蛋白介导的， 蛋白介导的 多个SNARE蛋白序列， 发现不同 蛋白序列， 多个 蛋白序列 发现不同SNARE蛋白 蛋白 尽管在氨基酸长度和结构上有所区别, 尽管在氨基酸长度和结构上有所区别 但有一 段序列(长度为 个氨基酸)是高度保守的 长度为55个氨基酸 是高度保守的， 段序列 长度为 个氨基酸 是高度保守的，称 之为“SNARE结构域 结构域(SNARE-domain)”，是 之为 结构域 ， SNARE核心复合体 核心复合体(core complex)形成时各 核心复合体 形成时各 个成分相互作用的部位。根据位于SNARE结 个成分相互作用的部位。根据位于 结 构域中间的氨基酸残基是精氨酸， 构域中间的氨基酸残基是精氨酸，还是谷氨酰 家族成员分为R-SNAREs和Q胺，将SNAREs家族成员分为 家族成员分为 和 SNAREs两类。 两类。 两类
关于SNAREs 关于
在真核生物细胞中， 在真核生物细胞中，各细胞器间物质和信息的 交流是细胞生命活动的基本保证， 交流是细胞生命活动的基本保证，而囊泡转运 是细胞器之间物质和信息交流的主要方式。 是细胞器之间物质和信息交流的主要方式。植 物的SNAREs (Soluble N-ethyl物的 maleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptors) 是一个多 功能的蛋白家族，介导大多数的囊泡转运， 功能的蛋白家族，介导大多数的囊泡转运，在 植物的许多生理过程， 植物的许多生理过程，尤其植物对非生物胁迫 的响应中发挥着重要的作用。 的响应中发挥着重要的作用。
1．研究的目的意义 ．
作物在生长发育的整个时期都会不同程 度的受到多种逆境胁迫的危害， 度的受到多种逆境胁迫的危害，由此造 成作物严重减产， 成作物严重减产，这已经成为世界性的 问题。近年来， 问题。近年来，随着分子生物学的飞速 发展和基因工程技术的日趋成熟， 发展和基因工程技术的日趋成熟，通过 基因工程手段改良作物的耐盐碱能力已 成为提高作物产量的一种高效的途径。 成为提高作物产量的一种高效的途径。
二、项目主要研究内容、目标与 项目主要研究内容、 技术经济指标
1. 项目主要研究内容 (1) GsSNARE基因启动子序列的获得及生 物信息学分析； 物信息学分析； (2) GsSNARE基因启动子的克隆； 基因启动子的克隆； (3) GsSNARE基因启动子植物表达载体构 建； (4) GsSNARE基因启动子转基因拟南芥的 获得； 获得； (5) GsSNARE基因表达特性分析。 基因表达特性分析。
3. 该研究创新之处
本研究以模式植物拟南芥为试材， 本研究以模式植物拟南芥为试材，通过 GsSNARE基因启动子驱动 基因启动子驱动GUS基因的表达， 基因的表达， 基因的表达 在转基因拟南芥中研究GsSNARE基因在不同 组织中的表达特性、 组织中的表达特性、在植株不同发育时期的表 达特性、及在盐、 达特性、及在盐、ABA胁迫处理下的表达特性 胁迫处理下的表达特性 相对于半定量RT-PCR、Real-time PCR或 。相对于半定量 、 或 Northern Blot分析基因表达，该方法通过 分析基因表达， 分析基因表达 GUS染色，能够直观、简便、可视化的研究基 染色， 染色 能够直观、简便、 因的表达情况。 因的表达情况。