第11组生物芯片技术
作物基因克隆技术应用进展
基因克隆技术是19世纪70年代初开始发展起来的一项研究技术。
它是研究某一特定基因的表达和功能研究的第一步。
基因克隆技术的发展为作物研究提供了新的技术方法和研究方向。
研究人员利用作物基因克隆技术，通过改变基因型实现了农作物产量、品质、抗性等多种性状的改良，显著提高了农作物的质量。
随着基因克隆技术的不断发展并投入实践应用，关于基因克隆的技术研究也在不断改进。
目前几乎作物研究的每个领域，都有基因克隆技术的身影。
作物基因的克隆技术是作物育种研究的重要组成部分。
主要内容是鉴别分离突变体特异基因并得到完整的基因序列种，进行基因定位，筛选有利性状，最后应用到作物生产实践中。
作物基因克隆技术通常分为两种。
相对比较传统的研究途径的是正向遗传学方式。
反向遗传学途径是新型研究方法，它是先获得遗传基因片段，反向研究基因。
本文主要从几种基因克隆技术的角度出发，来介绍作物基因克隆技术的研究进展，并展望了作物基因克隆技术的发展前景。
1.常用传统基因克隆技术1.1功能克隆功能克隆是出现最早的基因克隆技术之一。
它主要通过研究表达的异常蛋白质，在已知遗传损伤所引起的蛋白质缺陷信息的情况下，进行基因定位并克隆。
步骤的关键是先已知蛋白质，再将其的mRNA反转录成cRNA，然后作为探针，从而从基因组中克隆到所需基因。
更有趣的是，当获得某一个植株的相似基因，且核苷酸序列高度保守时，也可以通过利用这些已知基因片段，去筛选未知基因库，从而分离出未知新基因。
周兆斓等利用Kond等克隆和测序编码了水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组，之后将其导入甘薯、马铃薯、茄子等多个作物，极大地改善了作物的抗虫能力。
功能克隆是人们在克隆领域摸索出第一种最基本的克隆方法，它在作物基因克隆的研究中有重要地位。
功能克隆是简单实用的方法，但是它需要已知基因信息才能进行克隆，因此最初应用功能克隆方法的时候，具有很大的局限性。
1.2定位克隆定位克隆又叫图位克隆，是人们研究出的可以克服基因编码序列未知对功能克隆限制性的一种克隆方法。
2020年智慧树知道网课《临床分子生物学检验技术(哈尔滨医科大学)》课后章节测试满分答案1
绪论单元测试1【判断题】(20分)临床分子生物学检验技术学科建立在分子生物学学科之前。
A.对B.错2【判断题】(20分)临床分子生物学检验技术是从分子水平研究解决临床诊断与治疗问题。
A.对B.错3【多选题】(20分)现代临床医学的发展方向：（）A.预测医学B.预防医学C.个体化医学D.中西医结合4【多选题】(20分)下列技术为临床分子生物学检验常用检测技术的是（）A.基因测序B.SouthernblotC.分子杂交D.其余均不对5【判断题】(20分)临床分子生物学检验技术学科发展第一阶段的代表性技术为分子杂交技术。
A.错B.对第一章测试1【单选题】(20分)在人类基因组DNA序列中，DNA甲基化主要发生在（）A.鸟嘌呤的N-7位B.鸟嘌呤的C-5位C.胞嘧啶的C-5位D.胞嘧啶的N-4位E.腺嘌呤的N-6位2【单选题】(20分)下列DNA序列中的胞嘧啶（）易发生甲基化修饰的是。
A.5'-CGCGCG-3'B.5'-GGGGCC-3'C.5'-CCCCCT-3'D.5'-GCACAC-3'E.5'-CTCTCCC-3'3【单选题】(20分)某基因位点正常时表达为精氨酸，突变后为组氨酸，这种突变方式为（）A.移码突变B.动态突变C.无义突变D.同义突变E.错义突变4【单选题】(20分)由于突变使编码密码子形成终止密码，此突变为（）A.无义突变B.移码突变C.终止密码突变D.同义突变E.错义突变5【单选题】(20分)下列叙述哪项是的（）A.原核生物基因组具有操纵子结构B.原核生物结构基因是断裂基因C.原核生物结构基因的转录产物为多顺反子型mRNAD.原核生物基因组中含有插入序列E.原核生物基因组中含有重复顺序第二章测试1【单选题】(20分)DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的（）A.T－G含量B.A－G含量C.A－C含量D.A－T含量E.G－C含量2【单选题】(20分)Southern杂交通常是指（）A.DNA和RNA杂交B.DNA和蛋白质杂交C.蛋白质和蛋白质杂交D.RNA和RNA杂交E.DNA和DNA杂交3【单选题】(20分)下列哪些不是影响DNA复性的因素（）A.碱基组成B.DNA浓度C.温度D.DNA的分子量E.DNA的来源4【单选题】(20分)探针基因芯片技术的本质就是（）A.基因重组技术B.蛋白质分子杂交技术C.酶切技术D.聚合酶链反应技术E.核酸分子杂交技术5【单选题】(20分)DNA探针的长度通常为（）A.1000～2000个碱基B.400～500个碱基C.<100个碱基D.500～1000个碱基E.100～400个碱基第三章测试1【单选题】(20分)以mRNA为模板合成cDNA的酶是()A.DNA酶B.逆转录酶C.RNA酶D.限制性内切酶E.TaqDNA聚合酶2【单选题】(20分)有关PCR的描述下列不正确的是（）A.引物决定了扩增的特异性B.由变性、退火、延伸组成一个循环C.循环次数越多产物量就越大，可增加循环次数提高产物量D.是一种酶促反应E.扩增的对象是DNA序列3【单选题】(20分)下列关于TaqDNA聚合酶的描述，的是（）A.扩增的DNA片段越长，碱基错配率越低B.催化形成3´,5´-磷酸二酯键C.不具有3´5´外切酶活性D.使DNA链沿5´→3´方向延伸E.以dNTPs为原料4【单选题】(20分)PCR反应过程中，退火温度通常比引物的Tm值（）A.低15℃B.高5℃C.低5℃D.相等E.高15℃5【单选题】(20分)PCR反应中延伸的时间取决于（）A.待扩增片段的长度B.模板的含量C.模板的纯度D.TaqDNA聚合酶的量E.引物长度第四章测试1【单选题】(20分)关于TaqMan探针技术的描述，不正确的是（）A.解决了荧光染料技术非特异的缺点B.R基团与Q基团相距较远，淬灭不彻底，本底较高C.易受到TaqDNA聚合酶5′-3′核酸外切酶活性的影响D.无需进行寡核苷酸熔解曲线分析，减少了实验时间E.操作亦比较简单2【单选题】(20分)以下为比较Ct法的相对定量的描述，不正确的是（）。
液相蛋白芯片与酶免疫法检测4种肿瘤标志物的比较
基 于 WHM#&*V VA;. XL-,*M 的 液 相 蛋 白 芯 片 技术是新近发展起来的一种新的检测方法 " 用荧光 染料将微小的乳胶微球分别染成不同的荧光色进 行编码 " 在微球表面以共价方式连接蛋白 + 核酸等 物质 " 可用于免疫分析 ’ 核酸研究 ’ 酶学分析 ’ 受体 和配体识别分析等研究
Y>)2Z
所有测试血清标本均来自同济大学附属东方 医院临床送检样品 "77 份正常体检标本 " 其他分别 收 集 检 测 指 标 阳 性 的 血 清 标 本 &;<. 阳 性 C1 例 "
’=; 阳性 20 例 "’;>?!? 阳性 C@ 例 "’;>0@ 阳性 @1
例 ) 病种和年龄等其他临床医疗信息未进行分类 ) 二 ’ 方法
生物芯片技术是随着人类基因组计划的顺利 进行而发展起来的一种全新的技术 $ 能够同时检测 成千上万个基因的表达或结构等信息 $ 在人类全基 因组测序完成后的功能基因组研究上发挥着巨大 的作用 # 作为功能基因组研究相关的重要内容之 一 $ 蛋白质组学的研究正在兴起 $ 需要有新的类似 于基因组测序的高通量手段来满足对蛋白质表达 % 结构 %功能等研究的需要 $因此蛋白芯片的技术成为 人们研究的一个热点 # 以荧光微球为载体基质的液 相蛋白 ! 微球 " 芯片技术 $ 结合了基因芯片研究的微 阵列和蛋白质研究的酶联免疫分析 !?@ABC" 技术 $ 在现阶段的蛋白质抗原抗体检测中具有巨大优势 # 液相蛋白芯片最大的优势在于可达到高通量
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12 生物芯片
生物芯片的定义
生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包 生物芯片（Biochip或Bioarray） 被在固相载体上的高密度DNA 抗原、 DNA、 被在固相载体上的高密度DNA、抗原、抗 细胞或组织的微点阵(microarray） 体、细胞或组织的微点阵(microarray）。 生物芯片包括DNA芯片、抗原芯片、抗体 生物芯片包括DNA芯片、抗原芯片、 DNA芯片 芯片、细胞芯片、组织芯片等。 芯片、细胞芯片、组织芯片等。 1998年世界十大科技突破之一。 1998年世界十大科技突破之一 年世界十大科技突破之一。 未来十年最具发展潜力的技术。 未来十年最具发展潜力的技术。
图象分析
复杂的杂交图谱一般需由图象分析软件 来完成。 来完成。 分析软件的功能：鉴定每个点阵、最大 分析软件的功能：鉴定每个点阵、 限度消除本底荧光的干扰、 限度消除本底荧光的干扰、解析多种颜 色图象、可标记或排除假阳性、 色图象、可标记或排除假阳性、识别和 分析对照实验是否成功、 分析对照实验是否成功、可将信号标准 化等。 化等。 图象处理软件必须具备提取基因库和数 据库的能力。 据库的能力。
分类（根据应用） 分类（根据应用）
基因变异检测芯片
–疾病检测(如HIV、P53基因、结核杆菌) 疾病检测( HIV、P53基因、结核杆菌) 疾病检测 基因 –法医鉴定(如DNA指纹图谱) 法医鉴定( DNA指纹图谱 指纹图谱) 法医鉴定
表达谱芯片
–肿瘤相关基因(正常与肿瘤组织表达差异) 肿瘤相关基因(正常与肿瘤组织表达差异) 肿瘤相关基因 –药物筛选(培养细胞药物刺激前后表达差异) 药物筛选( 药物筛选 培养细胞药物刺激前后表达差异) –发育(同一组织不同发育时期基因表达差异) 发育(同一组织不同发育时期基因表达差异) 发育 –组织发生(不同组织或器官的基因表达差异) 组织发生( 组织发生 不同组织或器官的基因表达差异)
生物芯片数据分析简介
一、基因芯片与基因表达 二、基因表达谱统计与分类分析 三、Ontology与基因功能注释 四、基于芯片数据的pathway分析
一、基因芯片与基因表达
什么是生物芯片？
一块指甲大小（1cm3 ）的有多聚赖氨酸包被的硅片或其 它固体支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维 素膜、尼龙膜等 ）。 生物芯片通过微加工和微流体系 统将生化分析中的样品制备、生 化反应、及结果检测有机地结合 集成在一起 。 具有高速度、分析自动化、及高 度并行处理能力 。
Subcellular components where a gene-product is found. Encompasses subcellular structures, locations, and macromolecular complexes
GO example
(Browser at /cgi-bin/go.cgi)
cDNA microarray
microRNA Chip
Biological question
Experimental design Microarray experiment
Image analysis
Normalization
Estimation
Testing
Clustering
Discrimination
13,601 Genes
Signal Transduction Ligand Binding or Carrier Motor Protein
GO Analysis—目标基因群显著性、靶向性基因功能分析。 Go Analysis对目标基因（差异基因等）进行GO分类，而后 对GO进行基于离散分布的显著性分析、误判率分析、富集度 分析，得出与实验目的有显著联系的、低误判率的、靶向性 的基因功能分类，该分类即导致样本性状差异的最重要的功 能差别，其所属基因是进一步验证的重要目标基因。 数据要求：标有上调和下调比值的差异基因列表。
中国生物技术的发展现状
中国生物技术的发展现状我国第一个生物制品研究所始建于1919年，在北平天坛成立了中央防疫处--即今天的北京生物制品研究所，迄今已有80多年的历史。
我国自七十年代未开始了现代生物技术的研究。
国家高度重视生物技术的发展，不仅被列为863计划之首，而且纳入七五、八五、九五国家重点攻关计划。
这一系列的举措，大大促进了我国医药生物技术的发展，并形成了一定的产业规模。
我国基因工程多肽药物、单抗和新型诊断试剂在仿制的基础上向创新发展，已能生产目前国际上市的大多基因工程多肽药物，基因工程干扰素α-1b-系国际首创，重组人肿瘤坏死因子、bFGF已申请专利，首创的免疫PCR胃癌诊断试剂已获得新药证书，有望开发出一系列的高灵敏度癌症诊断试剂。
基因工程疫苗的研制取得明显进展，基因工程乙肝疫苗投放市场，对乙肝的预防起到了非常重要的作用。
双价痢疾疫苗、霍乱疫苗获准试生产，血吸虫疫苗。
出血热疫苗等正在进行临床试验。
基因治疗取得突破，研制成功具有高效导入功能的靶向性非病毒型载体系统，动物试验表明，该系统能在体内将基因高效导入肿瘤细胞，明显抑制肿瘤生长；血管表皮生长因子基因缝线等3种基因治疗方案已基本完成临床前试验。
获得了一批转基因动物，已获得生长激素转基因猪的第2、3、4代。
获得手乳腺表达外源基因的转基因羊等。
通过研究出现一批创新性成果，克隆了大量人、动物、植物的新基因，创造了具有多种用途的新型表达载体等。
据统计，我国现有456个单位从事生物技术的研究、开发和生产，其中医药领域的有165个，占36%，专业人员约6800人，已有近二十种基因工程药物、疫苗获准进入市场，数十种医药生物技术产品正在进行临床或临床前研究。
当今世界生物技术迅猛发展，呈现出巨大活力。
特别是九十年代以来，随着人类基因组计划等各类生物基因组研究工作的展开，新基因不断被发现，新技术、新手段不断涌现，生物技术进入了大发展的新时期。
与此同时，生物技术产业迅速崛起，并已成为国际市场竞争的第二个热点领域。
生物化学实验原理与方法
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2020/11/26
生物化学实验原理与方法
二、有机溶剂沉淀法
n 原理：有机溶剂对许多溶于水的小分子生化物质以及核酸、 多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉淀作用。有机溶剂 的沉淀作用主要是降低溶液的介电常数从而 增强分子之 间的相互作用，使其溶解度降低。对于具有表面水层的生 物大分子来说，有机溶剂可破坏溶质分子表面的水膜，使 这些大分子脱水而相互聚集析出。不同溶质要求不同浓度 的有机溶剂，因此可用有机溶剂进行分步沉淀。
n 提取是在分离纯化前期，将样品研磨，把被破碎的细胞置于一定的溶剂（提 取液）中，使某一类分子目的物释放到提取液中的过程。提取液应具备的条 件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质溶解度小或不溶解；来源广 泛、价格低廉、操作安全等。
n 生物分子可以分为生物大分子和生物小分子。生物小分子的结构由较强的共 价键决定；生物大分子中除共价键外，还含有较弱的共价键和次级键，故需 温和的条件才能保证生物大分子的活性不被破坏。因此，这两类生物分子的 提取液成分和操作条件差别很大。
n 1、生物小分子的提取 n 2、生物大分子的提取
蛋白质和酶的提取 核酸的提取
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生物化学实验原理与方法
溶剂提取法
n 原理:利用溶剂的溶解作用把所需物质从细胞中转移出来 n 影响溶剂提取效率的因素（影响溶解度的的因素）
1、溶剂的性质：（根据相似相溶原理） 2、离子强度：离子强度是影响物质溶解度的主要因素，但离子强度 对不同物质溶解度的影响不同，如高离子强度下DNA-核蛋白溶解度增 加，而低离子强度下RNA-核蛋白溶解度增加；绝大多数蛋白质和酶， 在稀盐溶液中溶解度增加（盐溶）。 3、PH值：溶剂的PH值影响溶质分子的解离状态，离子状态的物质， 不能是阳离子还是阴离子都易溶于水，而非离子状态的物质易溶于有 机溶剂。 4、温度：温度的升高可以增加物质的溶解度。 5、去垢剂：去垢剂是一类既有亲水基又有疏水基的物质，可以分为 阴离子、阳离子和中性去垢剂等，如SDS，Tween20，Triton X-100。
生物科学创新实验40个
生物科学创新实验40个以下是一些生物科学创新实验的例子：1. 遗传工程：通过基因编辑技术将外源基因导入物种中，实现生物体的特定目标改造。
2. 组织工程：利用多种生物材料和细胞培养技术，重建组织和器官。
3. 基因表达调控：通过研究基因调控机制，探索基因网络和信号通路的相互作用。
4. 纳米生物技术：利用纳米材料和纳米尺度工具，开发用于生物研究和治疗的新技术和产品。
5. 单细胞测序：利用高通量测序技术，对单个细胞进行遗传物质的分析，深入了解细胞和细胞群体的功能和特性。
6. 生物芯片技术：研发新型的生物芯片平台，用于生物分子的检测、筛选和分析。
7. 人工合成生物学：利用化学合成方法，设计和构建具有新功能的生物分子和系统。
8. 基因组学：应用高通量测序技术，对整个基因组的序列进行研究，揭示基因组的结构和功能。
9. 癌症免疫疗法：利用免疫细胞、抗体等生物分子，激发机体的免疫应答，治疗和预防癌症。
10. 人工智能与生物学：利用人工智能算法和技术，对大规模生物信息进行分析和挖掘，加速生物学研究进程。
11. 植物遗传改良：通过基因编辑技术和遗传分析方法，改良植物基因组，提高农作物的产量和抗病性。
12. 蛋白质工程：通过蛋白工程技术，设计和改造具有特定功能的蛋白质。
13. 病毒工程：利用病毒作为载体，传递外源基因至宿主细胞，用于基因治疗和疫苗研发。
14. 克隆技术：利用体细胞核移植等技术，复制生物体并获得同种或同源个体。
15. CRISPR/Cas9技术：利用CRISPR/Cas9系统进行精准的基因编辑，用于治疗遗传性疾病和研究基因功能。
16. 寄生虫研究：利用遗传学和分子生物学方法，研究寄生虫的寄生机制和宿主相互作用。
17. 神经科学研究：通过光遗传学、功能磁共振成像等技术，研究神经系统的结构和功能。
18. 微生物群落研究：通过高通量测序和生物信息学分析，研究微生物群落的组成和功能。
19. 人造细胞研究：利用合成生物学方法构建人造细胞，探索生命起源和细胞功能的基本原理。
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（3）耐药性检测 结核分支杆菌耐药性检测芯片等。
生物芯片的优、缺点
优点： 1）高通量性：可同时并行分析成千上万种分子。
节省时间。 2）微型化，实验所需试剂用量少。 3）高度自动化。
缺点：在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不同。
生物芯片于一般分子杂交比较
基因芯片(gene chip)又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA micro-array)。 基因是载有生物体遗传信息的基本单位，存 在于细胞的染色体上。将大量的基因片段有 序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载 体上，称之为基因芯片。
基因芯片发展历史
Southern & Northern Blot Dot Blot
信息通量
生物芯片
Southern 等
高，几千-几十万点/cm2 低
自动化程度 高
低
研究的速度 快
慢
实验结果的 好
低
平行性
存在问题
基因芯片的缺点在于其不能对待检测基因在多细 胞类型组织中的精确定位进行判断,在这点上， Northern也一样，而原位杂交技术可以克服此缺 点。另外很多蛋白质调节其功能不主要是依赖其 是否表达或表达量高低，而是依赖蛋白质磷酸化去磷酸化等方式。在这种情况下，用核酸类生物 芯片就没有什么意义了，正在研究开发中的蛋白 类芯片可能会有所作为的。
（一）芯片制备
1.合成探针 基因组探针 cDNA探针 寡核苷酸探针
2.探针在载体表面的固定 固相载体 固体片状：主要有玻片、硅片和瓷片等； 薄膜状：有硝酸纤维素膜、尼龙膜以及聚丙烯膜等。
探针在载体表面的固定可分为两大类方法： ➢ 合成后点样，多用于大片段DNA，有时也
用于寡核苷酸，甚至mRNA。 ➢ 原位合成（即在支持物表面原位合成寡核苷
谢谢了解！
2004年9月24日
第31页
计算机
基因芯片扫描结果
不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记 的核酸分子数的差异。红〉黄〉绿〉兰〉紫
GENERAL SCANNING - ScanArray System
三、基因芯片的应用
（一）寻找和发现新基因 （二）基因表达分析 （三）DNA序列测定与序列间比较 （四）突变体和多态性的检测
酸探针），适用于寡核苷酸。
（二）样品制备
常见的基因芯片实验样品有DNA、 mRNA(cDNA)两种。根据样品来源、基因 含量及检测方法和分析目的不同，采用的基 因分离、扩增及标记方法各异。
（三）杂交反应
杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进 行的反应产生一系列信息的过程。 过程类似于一般的杂交法。 把要杂交的分子的溶液覆盖芯片的探针，用盖玻 片覆盖，即可杂交。
表达谱芯片实例
PCR法从外周血淋巴细 胞cDNA扩增产物扩增产物点样于 包被的玻片上
热击T细 胞cDNA
DNA芯片
杂交
杂交 激光共聚焦扫描
未处理的 细胞 cDNA
发现17个差异表达基因,11个被热诱导,6个 被热抑制,发现其中3个为未发现的新基因
（五）在疾病诊断的应用
（1）感染性疾病的诊断 性传播疾病、肝炎等。
（四）信号检测和分析
在杂交反应完成后，将矩阵插入扫描仪中。 主要为荧光法，其重复性较好，不足的是灵敏 度仍较低。 目前正在发展的方法有质谱法、化学发光法、 光导纤维法等。
基因芯片杂交结果要用专用的扫描系 统读取。
D
B
E
A
B
放大器
数模转
C
换器
A:激光器 B:滤光片 C:二色镜 D:反光镜 E:关栅
Macroarray
MicroarrBiblioteka y一、基因芯片的原理基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术 上的一种高效、快速的核酸序列分析手段。
基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、 样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析。
•基因芯片研制的总体蓝图
图11-1 基因芯片技术主要步骤
二、基因芯片技术
基因芯片技术本身有一些关键问题亟待解决： (1)基因芯片的特异性的提高 (2)样品制备和标记操作的简化 (3)增加信号检测的灵敏度 (4)高度集成化样品制备、基因扩增、核酸标记
及检测仪器的研制和开发。
制约基因芯片技术发展及应用的最主要的因素是这 种技术的成本较为昂贵，目前只有制药公司和少数研 究所才能承受。
三、生物芯片在医学中的应用
分子生物学、生物进化（生物起源及新物种鉴定） 生物医学（新药的筛选与合成，疾病诊断和治疗，如癌症、
早年性痴呆症等的病因研究）
农林科学（农作物育种改良、食品卫生监督、微生物检测） 环境科学 生化武器侦检 司法鉴定等
基因芯片
一、基因芯片的原理 二、基因芯片技术 三、基因芯片的应用