临床分子诊断学：第十章 感染性疾病的分子生物学检验
临床分子生物学检验技术
概念临床分子生物学检验技术是一种通过检测核酸或蛋白质分子的特异性探针，结合PCR扩增等技术手段，对患者进行疾病诊断、评估和监测的生物学检测技术。
其主要原理是通过检测局部基因组的DNA序列变异或特定基因表达的差异，较快地、精准地检测出有关疾病的相关信息。
常见的临床分子生物学检验包括基因测序、实时荧光定量PCR、基因芯片、蛋白质组学等。
应用临床分子生物学检验技术在诊断和治疗疾病等方面有广泛的应用。
它包括以下方面：病毒感染检测病毒感染检测是临床分子生物学检验技术的最常见应用之一。
例如，病毒性肝炎、艾滋病等病毒可以通过PCR扩增等技术检测其DNA或RNA序列，快速、准确地诊断出相关病情。
遗传疾病检测临床分子生物学检验技术可以用来检测遗传疾病，例如囊性纤维化、血友病等。
通过测试特定基因的变异，可以帮助提供准确的诊断和治疗方案。
肿瘤检测临床分子生物学检验技术可以用于肿瘤的检测和治疗。
例如，可以通过检测特定基因的变异来确定病程、判断预后、评估生存率。
此外，分子靶向治疗可以根据肿瘤基因异质性搭配治疗，旨在找到更好的治疗方案。
发展趋势随着分子生物学技术的不断发展，临床分子生物学检验技术也有了新的发展方向，主要包括以下几个方面：个性化医疗个性化医疗是临床分子生物学检验技术的重要发展所趋，它利用分子层面的信息，识别和分析患者的基本和环境因素，以针对性和定制性地制定最佳治疗方案，提高临床疗效。
基于大数据的检测随着数据采集和处理技术的不断提高，数据已成为生物医学研究中最重要的资源之一。
临床分子生物学检验技术在未来还将集成可视化数据分析、机器学习等技术，打造更开放、高效、便捷的医学数据系统。
智能化诊断随着人工智能技术的崛起，临床分子生物学检验技术将融合人工智能技术，利用计算机进行大数据分析和诊断，打造智能化临床检测平台，大大改进诊断效率和准确性，从而进一步提升疾病的治疗效果和预测准确性。
总的来说，临床分子生物学检验技术在治疗、预防及生物医学研究方面持有巨大潜力。
临床分子生物学检验技术名词解释
临床分子生物学检验技术名词解释临床分子生物学检验技术是一种应用分子生物学原理和技术的方法，用于检测和诊断临床样本中的遗传变异、基因表达和蛋白质水平等。
它可以为临床医生提供有关疾病发生、发展和治疗反应的重要信息。
以下是一些常见的临床分子生物学检验技术及其解释：1.聚合酶链反应（PCR）：PCR是一种用于扩增DNA片段的技术。
它可以从极小的DNA样本中扩增特定的DNA片段，以检测和诊断遗传性疾病、感染和肿瘤等。
2.基因测序：基因测序是一种用于确定DNA或RNA序列的技术。
它可以揭示个体的遗传信息，检测基因突变和多态性，帮助诊断遗传性疾病、肿瘤和药物反应等。
3.核酸杂交：核酸杂交是一种用于检测目标DNA或RNA序列的技术。
它利用DNA或RNA探针与目标序列互补结合的原理，可以检测病毒感染、基因突变和融合基因等。
4.蛋白质电泳：蛋白质电泳是一种用于分离和检测蛋白质的技术。
它通过在凝胶中进行电泳，可以分离不同大小、电荷和亲和性的蛋白质，用于疾病标记和生物标志物的检测。
5.免疫组化：免疫组化是一种用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达和定位的技术。
它利用特异性抗体与目标蛋白质结合，通过染色或荧光信号来检测和定量蛋白质的表达水平。
6.质谱分析：质谱分析是一种用于分析和鉴定化合物的技术。
它可以通过将样本中的分子离子化，利用质谱仪测量其质量和电荷比，从而确定样品的组成和结构，用于肿瘤标记物和药物代谢产物的检测。
这些临床分子生物学检验技术在临床实践中起着重要的作用，可以帮助医生进行准确的诊断和治疗决策，为患者提供更好的医疗服务。
随着技术的不断发展和突破，我们可以预期未来将出现更多更精确的分子生物学检验技术，为临床医学带来更大的进步和革新。
感染性疾病的分子生物学检验
Molecular diagnosis for infectious diseases
感染的慨念
感染是病原体和人体之间的相互作用过程 病原体：衣原体、螺旋体、病毒、细菌、真菌、原虫、寄生虫 病原微生物：致病菌（条件致病菌）
共
生
微 生
状
物
态
人
体
微
生
物
不
人
同
体
的
感
染
状
态
HBV DNA检测（PCR） PCR 引物是PCR扩增的关键，决定扩 增的特异性和敏感度。PCR引物常根据 其S、C、P和X基因中的高度保守序列 来设计。
部分常用的引物序列
扩增位置 P、X基因特
异片段
Ｃ基因特异 片段
Ｃ基因特异 片段
引物序列 5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’ 5’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’ 5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’ 5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’ 5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’ 5’-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3’
扩增片段大小(bp) 278
477
258
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
进行HBV DNA检测的同时使其进行相对的量化 更直接了解乙肝患者体内HBV的复制及传染性，能 准确地反映出HBV DNA的复制水平、病程变化和治 疗恢复情况等。
其特异性高，灵敏度可达0.01fg，检测范围为 2.5×102～2.5×109copies/ml。
临床分子生物学检验技术
临床分子生物学检验技术临床分子生物学检验技术》旨在介绍和探讨分子生物学在临床诊断中的重要性和应用领域。
本文档将首先介绍该技术的背景和目的，为读者提供必要的背景信息。
分子生物学是研究生物体分子结构、生命过程和遗传信息传递的科学领域。
在临床诊断中，分子生物学技术的应用已经成为不可或缺的一部分。
该技术利用DNA、RNA和蛋白质等生物分子的特性进行检测和分析，可用于诊断疾病、筛查遗传变异、监测治疗效果等方面。
现代临床分子生物学检验技术的发展使得医学诊断更加准确、快速和个性化。
通过分子检验，医生可以通过分析个体的遗传信息来确定患者是否存在特定病理变化，从而提供更加精准的诊断和治疗方案。
此外，临床分子生物学检验技术还可以用于筛查遗传病、检测传染病和肿瘤标志物等。
本文档将进一步探讨临床分子生物学检验技术在不同领域的应用，以及近年来该技术的发展和趋势。
通过阅读本文档，读者将对临床分子生物学检验技术有一个全面的了解，并能够意识到其在临床诊断中的重要性和前景。
检验方法常见的临床分子生物学检验方法有以下几种：聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种高度敏感的技术，用于扩增DNA片段。
它通过循环性的变性、退火和延伸过程，扩增目标DNA的特定区域。
操作步骤主要包括试剂配置、DNA模板提取、引物设计、PCR体系配置、PCR程序设置和结果分析。
在操作时需要注意反应体系的无菌操作，以及适当的负对照和阳性对照的选择。
核酸杂交：核酸杂交是通过两个互补的DNA或RNA序列在适当的条件下结合形成双链结构，从而检测目标序列的技术。
操作步骤主要包括探针设计、标记、杂交条件优化和结果分析。
在操作时需要注意探针的特异性和灵敏度，以及杂交条件的控制。
DNA测序：DNA测序是确定DNA分子序列的技术。
常见的测序方法有Sanger测序和下一代测序。
操作步骤主要包括DNA提取、建库、测序反应和数据分析。
在操作时需要注意测序平台的选择，以及数据质量的评估和校正。
10-感染性疾病的诊断
五、感染性疾病分子诊断的临床应用 及评价
▪ 用于感染性疾病治疗的监控和预测、病情 发展过程的危险性评价及疾病预后等。
▪ 耐用性的检测 ▪ 细菌的分型 ▪ 流行病调查
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第二节 病毒的基因检测
人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝 炎、脑炎、流行性感冒等等，占人类传染疾 病的75%左右。400多种不同病毒。
第三篇 应用篇
▪ 分子诊断以DNA、RNA和蛋白质为材料， 通过应用分子生物学技术，检查基因的存 在、结构缺陷或表达异常，从而对人体状 态和疾病作出诊断。
▪ 着重介绍感染性疾病、遗传性疾病、复杂 疾病等的分子诊断基本策略和方法。
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分子诊断的临床意义在于不仅能够对疾 病作出早期诊断、确切诊断，而且还能确 定个体归于疾病的易感性以及疾病的分期 分型、疗效监测、预后判断等。随着分子 诊断学的发展，分子诊断的原理和方法不 仅适用于遗传性疾病，而且也广泛应用于 感染性疾病、肿瘤等医学领域。
病毒结构：大 小：20-300nm 核心区：核酸（DNA或RNA） 外周衣壳：蛋白质 包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）
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一、 乙型肝炎病毒
我国是HBV高流行区，50%－70%的人 受过感染，8%－10%是HBV携带者，肝 炎患者中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬 变，HBV又与原发性肝癌密切相关。 外壳（HBsAg): 外壳蛋白成分为表面抗原 核心（HBcAg)： DNA
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2. 完整检出策略和方法
按照诊断→分型→亚型→耐药性检 测的思路，利用多种分子诊断手段对感 染性病原体进行分析。
基因芯片、基因测序等
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二、感染性疾病分子诊断的常用方法
根据目的基因是否被放大， 可分为杂交法和扩增 法。 ▪ 信号放大技术检测方法 靶分子数目不变，而检测的探针信号放大 采用多酶、多探针或二者结合等方法来增加探针 标志物的浓度使检测信号得到放大。 ▪ 靶分子扩增技术检测方法 靶分子（RNA、DNA或探针）的扩增 ▪ PCR、替代扩增、LCR等
感染性疾病的分子生物学检验
THANKS.
免疫治疗
利用患者自身的免疫系统，通过免疫调节和免疫细胞治疗等方法，提 高患者的免疫力，控制感染性疾病的发展。
加强国际合作与交流
跨国合作研究
加强国际间的合作与交流，共同开展 感染性疾病的分子生物学研究，共享 研究成果和技术资源。
学术交流平台
建立国际性的学术交流平台，促进各 国学者之间的学术交流和技术合作， 推动感染性疾病的分子生物学检验领 域的快速发展。
耐药性分析
对于已经产生耐药性的病原体，分子生物学检验可以帮助分析其耐药机制，为 临床治疗提供参考。
展望与未来发展方
05
向
新技术的研发与应用
1 2 3
基因组学技术
利用新一代测序技术，对感染性疾病的基因组进 行全面解析，为疾病的诊断、治疗和预防提供更 精确的信息。
蛋白质组学技术
研究感染性疾病发生发展过程中蛋白质的表达和 功能变化，为药物研发和个性化治疗提供有力支 持。
VS
详细描述
蛋白质组学技术包括蛋白质分离、质谱分 析和功能研究等方面。通过对感染性疾病 患者体内蛋白质的表达谱进行分析，有助 于揭示感染性疾病的发病机制、疾病进程 和耐药性机制。蛋白质组学技术为感染性 疾病的诊断和治征
细菌性感染的分子生物学特征
详细描述
PCR技术利用特定的引物和耐高温的DNA聚合酶，通过循环加热和冷却的过程， 将特定的DNA片段进行指数级扩增，从而实现对微量DNA的检测。PCR技术在 感染性疾病诊断中具有高灵敏度和特异性，可检测出极低浓度的病原体DNA。
基因测序
总结词
基因测序是通过测定DNA序列，对感染性疾病进行诊断和溯源的技术。
详细描述
基因测序能够测定病原体全基因组的序列，提供关于病原体种属、基因型、耐药性等重要信息。通过比较不同病 原体基因组的序列差异，有助于追踪疾病的传播途径和溯源。基因测序在感染性疾病的防控、诊断和治疗中具有 重要意义。
分子生物学检验技术课程教学大纲
《分子生物学检验技术》课程教学大纲一、课程说明课程编码03110452 课程总学时32周学时2 学分2课程性质专业必修课适用专业医学检验1、教学内容与学时安排（见下表）：教学内容与学时安排表2、课程教学目的与要求:本课程着重介绍分子诊断学的基础理论、技术方法和临床应用，及其有关的基本概念、原理和方法；并详细介绍了一些新近发展的重要技术及其应用，充分反映了分子诊断学的发展趋势。
包括三大内容：第一部分主要介绍：生物大分子（基因）的结构与功能、基因组的结构与功能、基因与基因组学等基本理论；第二部分培养学生的基本操作技能，掌握分子生物学常用技术（核酸的分离纯化技术、PCR，分子杂交、核酸序列分析等），基因重组技术。
第三部分应用介绍：在探讨分子诊断的基本策略与方法的基础上，详细介绍了感染性疾病的分子诊断、单基因疾病的分子诊断、复杂性疾病的分子诊断、生物信息学在分子诊断中的应用等。
3、本门课程与其它课程关系：分子诊断学是生命科学领域中最具有活力的前沿科学。
其理论、技术和方法不断地被应用于临床，在疾病的预防、预测、诊断、疗效的评价等诸方面发挥着愈来愈重要的作用，产生了一个新的学科方向——分子医学，分子诊断学是分子医学的重要组成，为疾病病因诊断提供信息和依据，是一门具有广阔前景、并逐渐走向独立的学科。
4、推荐教材及参考书：教材：《分子诊断学》（第二版），吕建新主编，中国医药科技出版社。
参考书：Harper’s Illustrated Biochemistry.《医学分子生物学》，冯作化主编，人民卫生出版社。
5、理论课程考核方法与要求：考核方法：闭卷考试，期末闭卷考试占90%,小论文或综述平时成绩共占10%。
要求：考核内容，掌握占70%,熟悉占20%,了解占10%。
6、实践教学内容安排：二、教学内容纲要模块1 绪论一、目的和要求（一）掌握：分子诊断学的定义和研究的主要内容（二）熟悉：分子诊断学的历史（三）了解：分子诊断学在医学中的应用二、教学内容（一）重点讲解：分子诊断学的定义及其研究范畴（二）一般介绍：分子诊断学发展的历史、特点及其展望；分子诊断学在医学中的应用模块2 基因与人类基因组计划一、目的和要求（一）掌握基因的概念和功能类别，基因组、DNA多态性和SNP的概念（二）熟悉人类基因组多样性（三）了解基因概念的发展和人类基因组计划二、教学内容（一）重点讲解：基因的概念，基因组的定义；人类基因组多样性（二）一般介绍：基因概念的发展；人类基因组计划模块3 基因组的结构与功能一、目的和要求（一）掌握真核生物基因组的结构与功能特点（二）熟悉原核生物和病毒基因组的结构与功能特点二、教学内容（一）重点讲解：原核生物、真核生物和病毒基因组的结构与功能特点模块4核酸分子杂交技术一、目的和要求（一）掌握：核酸分子杂交的基本原理；Southen/Northen印迹杂交（二）熟悉：核酸探针的设计（三）了解：其他杂交技术二、教学内容（一）重点讲解：核酸分子杂交的基本原理，核酸的变性、复性；Southen/Northen印迹杂交的特点及应用（二）一般介绍：核酸探针的纯化、检测、标记；其他杂交技术模块5分子克隆一、目的和要求（一）掌握：分子克隆的基本步骤（二）熟悉：分子克隆的工具酶和克隆载体（三）了解：表达载体和穿梭载体（一）重点讲解：分子克隆的工具酶（限制性核酸内切酶、DNA聚合酶）的作用特点；常用克隆载体（质粒、噬菌体）的特点；分子克隆技术的五大基本步骤（二）一般介绍：其他分子克隆的工具酶；其他克隆载体的特点；表达载体、穿梭载体的特点模块6生物芯片技术一、目的和要求（一）掌握：生物芯片、基因芯片和蛋白质芯片的概念及基因芯片的原理和分析步骤（二）熟悉：基因芯片的分析步骤和应用（二）了解：基因芯片的制作和蛋白质芯片二、教学内容（一）重点讲解：基因芯片的概念、原理和分析步骤；基因芯片的测定和应用（二）一般介绍：基因芯片的制作和蛋白质芯片模块7 DNA测序测定一、目的和要求（一）掌握：链末端终止法和化学降解法测序的基本原理（二）熟悉：主要测序技术的方法特点（三）了解：其他DNA测序技术和自动化测序二、教学内容（一）重点讲解：链末端终止法；化学降解法（二）一般介绍：其他DNA测序新技术的原理；自动化测序的原理模块8核酸扩增技术一、目的和要求（一）掌握：PCR的概念、基本原理和反应体系，实时荧光定量PCR的概念、基本原理（二）熟悉：PCR产物的检测方法；PCR的常见问题及体系优化；实时荧光定量PCR技术；常见PCR衍生技术（三）了解：PCR技术的发展变化；其他PCR衍生技术；PCR相关的扩增技术；临床PCR 实验室的标准化和质量控制（一）重点讲解：PCR的概念和基本原理；PCR反应体系的组成；PCR产物的检测方法; 实时荧光定量PCR的概念、原理和荧光示踪方法（二）一般介绍：PCR技术的发展变化和PCR相关的扩增技术；临床PCR实验室的标准化和质量控制模块9蛋白质组学研究技术一、目的和要求（一）掌握：蛋白质组学的基本概念；双向凝胶电泳技术的基本概念、原理（二）熟悉：蛋白质相互作用的研究技术（三）了解：生物质谱的基本原理；蛋白质的鉴定二、教学内容（一）重点讲解：蛋白质组学的基本概念；双向凝胶电泳技术的基本概念、原理及计算机图像分析；酵母双杂交技术的基本原理（二）一般介绍：生物质谱的基本原理，肽质量指纹图谱法与肽序列标签鉴定法的基本原理；其他蛋白质相互作用的研究技术模块10 感染性疾病的分子诊断一、目的和要求（一）掌握：基因病的概念和分类；基因病的分子诊断技术；感染性疾病的分子诊断策略; 感染性疾病的分子标志物（二）熟悉：HBV、HCV的基因检测；结核杆菌的基因检测（三）了解：细菌耐药基因的检测；其他感染性疾病病原体的基因检测二、教学内容（一）重点讲解：基因病的概念和分类；基因病的分子诊断技术；感染性疾病的分子诊断策略；HBV、HCV的基因检测；结核杆菌的基因检测（二）一般介绍：其他病毒的基因检测；其他细菌性疾病的分子诊断；细菌耐药基因的检测；衣原体、支原体、螺旋体、原虫的基因检测模块11 单基因遗传性疾病的分子诊断一、目的和要求（一）掌握：单基因疾病的概念，血红蛋白病的分子诊断（二）熟悉：血友病的分子诊断（三）了解：其他遗传性疾病的分子诊断二、教学内容（一）重点讲解：单基因疾病的概念，血红蛋白基因的特点；镰状细胞贫血病的分子诊断，地中海贫血的分子诊断；甲型血友病及其分子诊断（二）一般介绍：苯丙酮尿症等其他遗传性疾病的分子诊断；乙型血友病及其分子诊断模块12复杂基因疾病的分子诊断和分子诊断在移植配型中的应用一、目的和要求（一）掌握：肿瘤相关基因的分子诊断；分子诊断在移植配型中的应用（二）了解：其他多基因疾病的分子诊断二、教学内容（一）重点讲解：癌基因、抑癌基因、肿瘤耐药基因、糖尿病的分子诊断；分子诊断在移植配型中的应用（二）一般介绍：其他肿瘤标志物的分子诊断；家族性高脂血症、高血压支气管哮喘的分子诊断模块13线粒体疾病的分子生物学检验一、目的和要求（一）掌握：线粒体基因组及其表达系统；线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系（二）熟悉：线粒体基因组变异与疾病（三）了解：线粒体基因组与耳聋；线粒体与Leber遗传性视神经病变；线粒体与糖尿病二、教学内容（一）重点讲解：线粒体基因组及其表达系统；线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系；线粒体基因组变异与疾病（二）一般介绍：线粒体基因组与耳聋；线粒体与Leber遗传性视神经病变；线粒体与糖尿病第十四章生物信息学在分子诊断中的应用一、目的与要求（一）掌握：生物信息学概论；生物信息数据库；核酸序列的分析（二）熟悉：计算机和互联网的基本知识；数据的获得（三）了解：蛋白质序列分析；二、教学内容（一）重点讲解：生物信息学概论；三大生物信息数据库及其检索工具；核酸序列的分析；引物设计（二）一般介绍：计算机和互联网的基本知识；蛋白质、核酸的结构、序列等数据的获得核酸序列的功能预测；蛋白质序列分析、结构功能预测及进化分析《分子生物学检验技术》实验教学大纲。
分子诊断在感染性疾病中的应用
感染性疾病的分子诊断临床价值
• 分子生物学检验技术在感染性疾病中的应用主要 包括对病原生物进行鉴定、分型、耐药诊断和治 疗过程中的疗效监测等
• 动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判断和 病情预后评价提供客观的依据
• 目前已经应用于一些重要的感染性疾病，如结核 病、病毒性肝炎、艾滋病、、人禽流感等
实验室诊断现状
分子生物学检测方法
• 近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发 展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验 提供了极大的方便，可将诊断时间从几周 降低到几天。
• 结核病基因诊断技术主要包括聚合酶链反 应()、核酸探针杂交、序列测定、基因芯片、 基因分型等。
现代分子生物学快速诊断
基因结构 分子诊断
一、感染性疾病的诊断和治疗监测
变异株与耐药突变检测
• 可能发生自然变异 • 在人体活疫苗接种和抗病毒治疗等压力下发生变
异 • 基因组的变异常引起病毒生物学特性的改变，从
而导致感染发病机制的变化、血清学检测指标的 改变以及免疫逃逸，给乙型肝炎的诊断和治疗带 来困难
耐药突变类型及其核苷酸、氨基酸变化
12
分枝杆菌菌种鉴定（微阵列芯片法）
检测范围：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、 土、龟-脓肿、草、不产色、海-溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍、耻垢。
➢ 高 效： 同时检测 17 种分枝杆菌（包括） ➢ 快 速：＞4周（菌种鉴定） 6 小时 ➢ 灵 敏： 103 个菌/反应
13
结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒
基因组特点
共价封闭环状结构 标准株结核分枝杆菌 基因组全长4.4,
包含4000个蛋白质编码基因 和50个编码基因
分枝杆菌分子诊断系统
实时荧光
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长江以北
D基因型
少数民族较多的地区(西藏、新疆、宁夏等)
12
病毒分型检测的意义
HBV基因型与HBV流行病学特点、HBV标志物 的表达、致病性、乙型肝炎的病程、转归及对 药物的敏感性有关。
不同基因型对抗病毒药物的效果存在一定差异 用拉米夫定抗病毒治疗时，基因型B比基因型C 有更好的应答： 用普通IFN-a治疗时，基因型B比基因型C对干 扰素治疗的应答率高。
4
分子诊断
❖严格病原体 ❖不可培养或难以培养的病原体 ❖需要快速得到检验结果 ❖需要获得定量数据
5
第一节 病毒性疾病的临床分子诊断
病毒的概况： 人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、脑
炎、流行性感冒等等，占人类传染疾病的75%左右。 400多种不同病毒。 病毒结构：大 小：20-300nm
核心区：核酸（DNA或RNA） 外周衣壳：蛋白质 包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）
❖3.2kb双链DNA病毒 ❖不完全双连环状DNA
长链L为负链：有4个开放阅读框S、C、P、X S区编码外膜蛋白（HBsAg） C区编码HBeAg 、HBcAg p区编码DNA聚合酶 X区位编码X蛋白，可能与病毒蛋白表 达有关。-s1
pre-s2
HBV基因组结 构
S
P
6
一、乙型肝炎病毒
我国是HBV高流行区，50%－70%的人 受过感染，8%－12%是HBV携带者，肝 炎患者中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬 变，HBV又与原发性肝癌密切相关。 外壳（HBsAg): 外壳蛋白成分为表面抗原 核心（HBcAg)： DNA
DNA 聚合酶 HBcAg
7
（一）乙型肝炎病毒基因组结构
17
18
HBV核酸检测的意义
1.早期诊断
免疫学检测敏感性： 0.1µg/ml
核酸杂交检测敏感性：0.1pg/ml
PCR检测：
0.1fg/ml
因此，在感染早期即可通过DNA检测证实 病毒的存在。
19
2.监测治疗效果: ❖ HBVDNA>107拷贝/ml提示病毒复制活跃； ❖ HBVDNA＜104拷贝/ml治疗有一定疗效； ❖ HBVDNA＜103拷贝/ml、HBeAg阴转、
13
（三） HBV核酸检测
常用的免疫学检测方法，即二对半的检测存在 窗口期，不易早期诊断。
1.普通PCR技术
传统PCR方法检测HBV DNA的灵敏度可以达到 ng级水平，检测结果能直接反应HBV病毒的 复制程度，为临床提供从分子水平上对病原 体进行诊断提供依据。
14
引物是PCR扩增的关键，决定扩增的特异性和 敏感度。PCR引物常根据其S、C、P 和X 基因 中的高度保守序列来设计。 不足：不能进行准确的基因定量、重复性差、 扩增产物间污染所到的假阳性多、强致癌物溴 化乙啶的使用等。
pre-S1
pre-S2
HBV DNA 3.2 kb C
S pre-C C
P
pre-c
X
X
pre-S1蛋白 pre-S2蛋白 HBsAg HBeAg HBcAg DNAP HBxAg
9
乙型肝炎病毒的复制周期
10
（三）乙型肝炎病毒的基因分型
对致病的乙型肝炎病毒可用不同的血清型或基因型 进行描述。 根据 HBsAg 抗原性差异，将HBV分为10个血清型， 其中主要的有adr 、adw、ayw和ayr 。血清型分 布有明显的地区与种族差异，和国汉族以adr为主， adw次之。 根据HBV全核苷酸序列差异在8%或以上，或S基因 序列差异在4%或以上的原则 ，可将HBV划分为不同 的基因型，目前已经发现A、B、C、D、E、F、G、 H共8种基因型。不同基因型序列长度不同，主要是 前S1区的不同。
第十章 感染性疾病的临床分子诊断
1
课程内容
❖病毒性疾病的临床分子诊断 ❖细菌性疾病的临床分子诊断 ❖特殊病原体的临床分子诊断 ❖医院感染的临床分子诊断
2
传统病原体的检验程序
收集临床标本
形态学检查
免疫学检测
分离培养及鉴定
形态学鉴定 生化反应 药敏试验
动物试验
血清学鉴定
3
微生物学检验
❖发现传染源的最主要手段 ❖病原体诊断的金标准 ❖检测时限长（2～42天） ❖某些病原体不能被培养 ❖受多种因素影响
21
乙型肝炎病毒的耐药性产生重要原因是HBV本身 是一种变异较高的病毒。
HBV在复制过程中必须经过经过RNA中间体的逆转录过 程中，由于HBV DNA 多聚酶具有逆转录酶的性质，即 缺乏严格的校正功能，使其自发突变率高达10-5。慢性 HBV感染者由于长期抗病毒治疗也会诱发病毒基因变异。 人体免疫应答或疫苗接种等压力下HBV也可发生突变。
11
我国流行的主要是A、B、C、D四种HBV基因型， 另有混合型。中国大陆地区HBV基因型分布
D 8%
Others A 1 % 4%
B 30 %
C 57 %
n = 694
四种HBV基因型在中国地域分布的主要概况
HBV基因型
主要分布地域
A基因型
仅见于少数地区(广西壮族自治区)
B 基因型
长江以南
C基因型
转氨酶正常为乙型肝炎临床治愈指标；
3.判断病情，指导制定合理的治疗方案
20
HBV的耐药突变和检测
常用的抗HBV药物为核苷（酸）类似物，如拉 米夫定、阿德福韦等，但在长期用药过程中， 部分患者对药物产生了耐药性。HBV一旦出现 耐药突变后肝功能恶化比例显著增高。随着服 用拉米夫定时间的延长，患者的耐药性随之增 加，服药 5 年的耐药性可高过约69%。因此， 对乙型肝炎病毒的耐药性分析在指导临床用药 和监测病情等方面都具有重要意义。
C基因 5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’ 258 5’-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3’
16
2．荧光定量PCR技术
荧光定量PCR法的应用，可以在在进行HBV DNA检 测的同时使其进行相对的量化，这对于乙肝患者体 内HBV的复制及传染性有更直接的了解，能准确地 反映HBV DNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情 况等。其特异性高，灵敏度可达001fg，检测范围为 2.5ⅹ102~2.5ⅹ109copies/ml。
15
扩增位置 引物序列 扩增片断（bp)
P、X基因 5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’
278
5’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’
C基因 5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’ 477
5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’