分子生物学基因的体外转录和翻译共46页
体外转录与翻译
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
1、基因体内转录的过程 、
原核基因转录
真核基因转录
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
2、基因体外转录的原理 、 基本的工作原理是以DNA为模板，在转录体系中 的一系列转录因子的作用下，经RNA聚合酶合成 RNA RNA。 基因体外转录体系在1976年由 年由PELHAM和 基因体外转录体系在 年由 和 JACKSON建立。体外转录体系逐渐成熟。 建立。 建立 体外转录体系逐渐成熟。
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
3、基因体外转录的操作 、 聚合酶（ （1）RNA聚合酶（RNA Polymerases ） ） 聚合酶
常用的聚合酶为噬菌体来源的RNA聚合酶 聚合酶 常用的聚合酶为噬菌体来源的 T7 、SP6、T3 、 特异识别模板启动子 转录效率比大肠杆菌的聚合酶效率高 酶的来源及质量高
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
3、基因体外翻译系统 、 （2）麦芽提取物 Wheat Germ Extract ） 麦芽提取物是不同于网织红细胞裂解物的另一个无细胞 体外合成体系。由于内源的mRNA很少，这个系统可用于各种 病毒、酵母、高等植物乃至哺乳动物蛋白的合成。当表达产物 较难与球蛋白区分（12—15kD）、或者表达产物正好可能是 哺乳动物细胞中富含而植物中没有的调控因子一类的蛋白时、 或者是不明原因表达不出时，就不妨尝试麦芽提取物体系。不 过要记住，这个体系要求RNA有帽子结构才能更好的翻译。 如果上述情况又无法给RNA加帽，就只好借助大肠杆菌体系 了。
基因的体外转录和翻译 共47页
23.07.2019
5
基因体外转录体系在分子生物学和 细胞生物学研究中的用途和意义：
1、快速检测目的基因的转录情况； 2、分析转录因子调节基因转录的过程； 3、分析启动子序列的活性； 4、分析转录因子、DNA结合蛋白和RNA 剪切因子的组成和作用；
5、染色质结构调整与基因转录的关系；
6、制备RNA探针。
23.07.2019
6
一、基因体外转录的基本原理
基本原理：以DNA为模板，在无细 胞体系中一系列转录因子的作用下 经RNA聚合酶合成RNA的过程。
质粒DNA
模 板
线性DNA
核小体形式存在的DNA
23.07.2019
7
能用于体外转录的质粒载体
31
基因体外翻译的基本原理 基因体外翻译的基本原理是以基因 转录产物RNA为模板，在核糖体上 进一步生产蛋白质的过程。
基因体外翻译的模板：
1、直接来自体外基因转录实验； 2、细胞内提取的mRNA； 3、通过PCR或RT-PCR产物转录后 的RNA。
23.07.2019
32
利用不同模板和翻译体系进行翻译
23.07.2019
18
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、 Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳 香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法 用于不同蛋白质测定时有较大的偏差， 在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白 为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
基因的表达转录和翻译
DNA mRNA
你现在学习的是第30页，课件共59页
信使RNA（mRNA）通过核孔从细胞核中出来，到细胞质中。
细胞核
A A T C AA T AG U U A G AU AUC
mRNA
核孔
细胞质
你现在学习的是第31页，课件共59页
二、遗传信息的翻译
U U A G AU AUC
mRNA
碱基序列
翻译
RNA的种类和功能
英文缩写
形状
功能
mRN A
作为翻译 的模板
转运RNA tRNA
携带氨基酸
三叶草形
核糖体RNA rRNA
你现在学习的是第11页，课件共59页
与蛋白质、Mg2+
组成核糖体
1. 转录的定义
转录
在细胞核中，以DNA的一条链为模 板合成RNA的过程。
转录可以分为几个步骤？
2. 转录的过程
你现在学习的是第12页，课件共59页
1、DNA分子复制与遗传信息转录的相同之处（ ） D
A 利用的模板都相同 B 利用的原料都相同
C 所利用的酶都相同 D 都遵循碱基互补配对原则
2、DNA的复制、转录和蛋白质合成分别发生在（ ）B
A 细胞核 细胞质 核糖体 B 细胞核 细胞核 核糖体 C 细胞质 核糖体 细胞核 D 细胞质 细胞核 核糖体
多肽链
（先合成肽链，然后在内质网、高尔基体加工成蛋白质）
你现在学习的是第51页，课件共59页
区分：遗传信息、密码子、反密码子
• 遗传信息：
（定位）
一般指DNA分子中的脱氧核苷酸序列（碱基序列） • 密码子：
mRNA分子上相邻的三个碱基决定1个氨基酸，
这样的三个碱基叫做1个密码子。 • 反密码子：
生物学中的基因转录和翻译
生物学中的基因转录和翻译基因是造物主赐予生命的重要物质，它们决定了个体的所有特征。
然而，我们对基因的认识和理解并不如我们想象中的那样深入，转录和翻译是人类科学探究基因的关键步骤之一。
转录是指从DNA分子向mRNA分子进行信息转移的过程。
简单来说，就是将DNA中的基因序列转换为RNA分子。
转录的过程中，DNA序列的一部分（称为基因）可以被RNA聚合酶识别并拷贝到RNA链中。
这个过程分为三个步骤：启动、延伸和终止。
启动子的序列通常被认为是转录启动的位置，也就是说，RNA聚合酶在这个位置附近停止了它的滑动，并开始将RNA链加到DNA模板上。
延伸步骤中，RNA聚合酶在DNA模板上移动，不断地向RNA链添加新的核苷酸。
在终止过程中，RNA聚合酶接近终止信号，然后释放聚合链和模板DNA，形成了一个mRNA分子。
与转录不同，翻译是指从mRNA链向蛋白质分子进行信息转移的过程。
在翻译过程中，mRNA链被翻译成一系列氨基酸，最终形成一个特定的蛋白质。
这个过程分为三个步骤：起始、扩展和终止。
在起始步骤中，mRNA链与小亚基结合并与大亚基结合，形成完整的核糖体。
在扩展过程中，核糖体将氨基酸转移到正在形成的蛋白质链的尾部。
在终止步骤中，到达终止密码子的核糖体受到启发，释放合成的蛋白质链。
对于人类和其他物种来说，转录和翻译至关重要。
这两个过程正式生物体内进行基因表达的方式。
基因表达确定了个体的所有特征，包括生长、发育和形态等等。
通过研究基因表达的过程，科学家们能够更好地了解许多重要的生物过程。
总之，转录和翻译是两个非常关键的生物学过程，是人类和其他物种生命的基础。
我们仍然有很多要学习和研究的，科学家们在不断坚持不懈地努力着，希望能够更好地理解这些过程，并在未来的研究中提供更多有用的发现。
基因表达遗传信息的转译与翻译
基因表达遗传信息的转译与翻译基因是生命的基本单位，它承载着生物所有的遗传信息。
然而，这些遗传信息并不能直接被生物体所利用。
基因表达是指这些遗传信息被转录成RNA后续转译成蛋白质的过程，这一过程包括转录和翻译两个环节。
本文将探讨基因表达的转译与翻译过程。
一、基因的转录过程基因的转录是指DNA的一部分信息被转录成RNA分子的过程。
转录过程包括三个主要步骤：起始、延伸和终止。
1. 起始转录的起始需要一个起始位点，这个位点通常由转录因子识别和结合。
转录因子是一种特殊的蛋白质，它能够结合到某一具体的DNA序列上，并招募其他转录因子和RNA聚合酶。
一旦形成复合物，RNA聚合酶就会开始进行转录。
2. 延伸在转录延伸过程中，RNA聚合酶将合成RNA链，同时脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）会与RNA链的末端碱基（核苷酸）形成磷酸二酯键，从而延伸RNA链。
这个过程会一直进行，直到到达转录终止位点。
3. 终止终止是指转录的停止。
在DNA序列上存在特殊的终止位点，当RNA聚合酶到达这个位点时，转录过程会停止，并释放出合成的RNA 链。
二、基因的翻译过程基因的翻译是指转录生成的RNA分子被翻译成蛋白质的过程。
这一过程是通过蛋白质合成机器——核糖体来完成的。
1. 起始翻译的起始需要一个起始密码子，起始密码子通常为AUG（码子的一种）。
在翻译的起始过程中，起始密码子被核糖体识别，并与起始tRNA结合。
起始tRNA上携带着甲硫氨酸（methionine），它将成为翻译的第一个氨基酸。
2. 延伸在翻译延伸过程中，核糖体会接受新的tRNA，并将其上携带的氨基酸与前一个氨基酸形成肽键。
这个过程会一直进行，直到到达终止密码子。
3. 终止终止是指翻译的停止。
当核糖体到达终止密码子时，翻译过程会停止，并释放出合成的多肽链。
终止密码子不编码任何氨基酸，它只是一个信号，告诉核糖体停止翻译。
三、转译与翻译的调控转译和翻译过程都受到调控。
在转录过程中，转录因子的结合与特定的启动子序列有关，通过信号通路的激活和调节，转录因子的结合能够被增强或抑制。
分子生物学：基因的体外转录和翻译ppt课件
2019/12/19
13
(4)收集核提取物：25000g离心 30min，收集上清液后，用缓冲液 透析2h后，4℃，25000g离心20min， 上清液置-70℃保存。
(5)核提取物的蛋白定量：核抽提物 总蛋白浓度采用Bradford法测定， 以牛白蛋白为参照。
2019/12/19
14
2019/12/19
18
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、 Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳 香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法 用于不同蛋白质测定时有较大的偏差， 在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白 为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
缺点：分离过程中一些特殊的试剂 破坏了细胞核膜，造成核内容物的 部分流失及操作过程中精胺易使 DNA模板产生沉淀
2019/12/19
21
过程：
收集细胞：收集一定数量的培养细 胞，300g离心5min，沉淀用分离 液清洗2次。 裂解细胞纯化细胞核：沉淀中加入 预冷的匀浆液1/10(原体积)，冰浴 10min后，匀浆，镜检，至90%细
5、染色质结构调整与基因转录的关系；
6、制备RNA探针。
2019/12/19
6
基因体外转录体系
DNA模板：含有转录启动子及必要 的调控序列(起始和终止序列等)的 DNA及为研究基因转录调控的需要, 在体外组装成的核小体链(注意避免 RNase的污染)。
2019/12/19
9
细胞核抽提物的制备：
2019/12/19
1
什么是基因的体外转录和翻译
基因的体外转录和翻译是20世纪70 年代发展起来的一项分子生物学和 细胞生物学实验技术，是研究离体 条件下(非细胞体系)基因表达情况 的理想体系。
基因的体外转录和翻译PPT演示文稿
嗪乙磺酸) pH 7.9,10mmol/LKCl，
1.5mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，0.2mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)]，冰浴30min，用 玻璃匀浆器匀浆，3000rpm离心15min 得细胞核沉淀。
10.10.2020
11
10.10.2020
19
（2）仍有一些物质干扰此法的测 定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 （SDS）和0.1N的NaOH （3）标准曲线也有轻微的非线性， 因而不能用Beer定律进行计算，而 只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。
10.10.2020
1
什么是基因的体外转录和翻译
基因的体外转录和翻译是20世纪70 年代发展起来的一项分子生物学和 细胞生物学实验技术，是研究离体 条件下(非细胞体系)基因表达情况 的理想体系。
10.10.2020
2
基因表达包括：转录和翻译两个过 程。
基因表达的调控包括：染色体结构 的调节、DNA结构的调节、转录过 程的调控、转录后的调控、翻译过 程的调控及翻译后的调控。
DNA模板：含有转录启动子及必要 的调控序列(起始和终止序列等)的 DNA及为研究基因转录调控的需要, 在体外组装成的核小体链(注意避免 RNase的污染)。
10.10.2020
9
细胞核抽提物的制备：
细胞核抽提物：DNA转录由RNA聚合酶、 各种转录因子及必要的环境条件等，这 一切必需由细胞提供。常用于制备细胞 核抽提物的细胞有酵母细胞、兔网织红 细胞和Hela细胞
10.10.2020
12
(3)裂解细胞核：向细胞核沉淀中加
入2倍体积的低盐缓冲液(20mmol/L
基因的体外转录与翻译
2020年10月10日星期六
16
Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法 约高四倍，这是因为蛋白质与染料 结合后产生的颜色变化很大，蛋白 质－染料复合物有更高的消光系数， 因而光吸收值随蛋白质浓度的变化 比Lowry法要大的多。
2020年10月10日星期六
17
（2）测定快速、简便，只需加一种 试剂。完成一个样品的测定，只需 要5分钟左右。由于染料与蛋白质结 合的过程，大约只要2分钟即可完成， 其颜色可以在1小时内保持稳定，且 在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定 性最好。因而完全不用像Lowry法那 样费时和严格地控制时间。
2020年10月10日星期六
19
（2）仍有一些物质干扰此法的测 定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 （SDS）和0.1N的NaOH （3）标准曲线也有轻微的非线性， 因而不能用Beer定律进行计算，而 只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。
2020年10月10日星期六
3、分离得到的细胞核比较纯且没有核蛋 白的流失。
2020年10月10日星期六
25
体外基因转录反应
体外基因转录一般用硅化的1.5ml塑 料管，在24~32℃条件下进行，为 了保证产物的稳定，反应体系中必 须加入RNase抑制剂，终止反应时，
可加入蛋白酶以降解核提取物中的 RNase。同时加入酵母tRNA作为产 物RNA的载体起到保护作用。反应
32
利用不同模板和翻译体系进行翻译
时，应匹配相应的翻译起始序列。 如用原核细胞翻译体系时RNA模板 应含有SD序列，应用真核翻译体 系时，应有帽子结构；在RNA的3ˊ 未端含有合适的终止信号。
2020年10月10日星期六