中药制剂检测技术 第五章 中药制剂的卫生学检查

2．固体供试品： 供试品10g+pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 定容至100ml 混匀 匀浆仪或其他适宜方法 1:10供试液 必要时加适量无菌聚山梨酯80，并置45℃以下水浴适当加 温，使供试品分散均匀。
3．需用特殊方法制备的供试品
非水溶性供试品 膜剂供试品 肠溶或结肠溶制剂供试品 气雾剂、喷雾剂供试品
2.验证方法 (1)试验组：1ml最低稀释级供试液+50～100cfu试验菌 (2)菌液组：测定所加的试验菌数
(3)供试品对照组：规定量的供试液
(4)稀释剂对照组：稀释液+试验菌（加入了入乳化剂、分 散剂及中和剂等除稀释液外的试剂或需薄膜过滤处理时）
3.结果判断 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率应 均不低于70%。 若试验组的菌数回收率均不低于70%，则计数方法可靠； 若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%，则应消除 供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证
二、微生物限度检验原则
（一）环境 1．洁净度1万级以下局部100级的单向流空气区域内进行 ； 2．检验过程严格无菌操作； 3．严防第二次污染。
课堂互动 中国药品生产洁净级别有哪些？其标准要求是什么？
（二）供试品抽。每批抽样应至 少含有2个以上最小包装单位。 检验量系指每次检验所需的供试品量(g、ml或cm2)。 固体和半固体制剂的检验量为10g；液体制剂10ml； 膜剂为100cm2 (不得少于4片)。
上述培养基用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为 50～100cfu（“Colony forming units”的缩写，菌落形成单 位，代表含有的菌落数）的菌悬液。
2.菌液制备 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中， 培养5～7天，加入3～5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌 氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液至无菌试管 中，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～ 100cfu的孢子悬液。
麦康凯琼脂(或曙红亚甲蓝琼脂)培养基 18～24h
三糖铁琼脂培养基
4. 铜绿假单胞杆菌((Pseudomonas aeruginosa) 1:10供试液10ml
可能的大肠菌群数N
(个/g或ml) ＞103 102＜N＜103 10＜N＜102 ＜10
3.沙门菌(Salmonella) 供试品10g或10ml 不少于200ml的营养肉汤 18～24h
18～24h
1ml
10ml四硫磺酸钠亮绿培养基 18～24h
胆盐硫乳琼脂(或 沙门、志贺菌属琼 脂)培养基
18～24h
4.结果判断 同时满足以下两个条件可判定培养基的适用性检查符合规 定：
①
②菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
（二）计数方法的验证 1.菌种与菌液的制备 2. 验证方法 同培养基的适用性检查。
验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算 各试验菌每次试验的回收率；
可与供试品的细菌，霉菌及酵母菌计数同时进行。
（三）检查方法 1. 大肠埃希菌(Escherichia coli)
供试品检查 1:10供试液10ml 100ml的胆盐乳糖培养基
18～24h
0.2ml
靛基质试液 5小时、24小时 5mlMUG 有无荧光 366nm紫外光灯下 阳性对照 1:10供试液10ml 1ml 10～100cfu大肠埃希菌
（三）检查方法：平皿法和薄膜过滤法 1. 平皿法 适用于无明显抑菌作用的制剂。
供试液的稀释
取2 ～3个适宜稀释级，加入1ml至平皿中
倾注培养基 体积：15～20ml,倾注平板数：2个及以上 培养及计数
细菌3天，霉菌、酵母菌5～7天
菌落报告 注意：平皿法计数时还需做阴性对照，要求均不得有菌生长。
菌数报告规则：宜选取细菌、酵母菌平均菌落数小于300cfu、 霉菌平均菌落数在小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两 位有效数字）的依据。 以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2 供试品中所含的菌数。
贴膏剂供试品
其制备方法按药典规定操作。
4.具抑菌活性供试品：采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、 薄膜过滤法、中和法等消除其抑菌活性。 注意：供试液制备若需加温时，应均匀加热，温度不超过 45℃，时间不得超过30分钟。 （四）检验条件 培养温度：细菌及控制菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母 菌培养温度为23～28℃。 阴性对照：以确定无菌技术的可靠性 阳性对照：检查供试品对控制菌生长有无干扰，培养条件是 否适宜
第一节 第二节 第三节 第四节
微生物限度检查法 无菌检查法 热原检查法 细菌内毒素检查法
甘淋玲老师编写
《中国药典》规定：
1.各种非规定灭菌制剂应进行微生物限度检查法； 2.无菌制剂应依法进行无菌检查； 3.静脉滴注用注射剂应进行无菌、热原及细菌内毒 素检查
一、基本知识
（一）基本概念 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、 辅料受微生物污染程度的方法。 非规定灭菌制剂主要指口服制剂、一般外用制剂。 （二）检查项目 1．染菌量（细菌数、霉菌数及酵母菌数） 2．控制菌检查 （包括大肠埃希菌、大肠菌群、沙门 菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌以及白色念 珠菌等）
菌液保存 制备好的菌液以当天使用为宜。若在室温下放置，应在2小 时内使用；若保存在 2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉 孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
3.适用性检查
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50～100cfu， 分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌 平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数； 取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立 即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混 匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数； 取白色念珠菌50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注酵母 浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，混匀，凝固， 置23～28℃培养72小时，计数。 用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
三、细菌、霉菌及酵母菌计数
（一）计数培养基的适用性检查
（二）计数方法的验证
（三）检查方法 （四）注意事项
（一）计数培养基的适用性检查
基本知识 计数用培养基：营养琼脂、玫瑰红营养琼脂和酵母浸出 粉葡萄糖琼脂 对照培养基：系指培养基处方特别制备、质量优良的培 养基，由中国药品生物制品鉴定所研制及分发。 检查方法：通过检验用培养基与对照培养基的比较，以 阳性菌的生长状态或特征来评价检验用培养基是否符合 检验要求。
是否玫瑰红色
100ml的胆盐乳糖培养基
此后同法操作
阴性对照 10ml稀释液 100ml的胆盐乳糖培养基 此后同法操作
结果判断
靛基质反应 判断结果
+
− + −
+
− − +
检出大肠埃希菌
未检出大肠埃希菌 需进一步验证 需进一步验证
验证试验 划线接种：取胆盐乳糖培养基的培养物接种至曙红亚 甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基，观察 革兰氏染色镜检：革兰阴性无芽胞杆菌 适宜的鉴定试验：发酵乳糖产酸； IMViC实验反应为++−−或−+−−。
3. 适用性检查项目：
促生长能力 抑制能力 指示能力 具体方法参照中国药典2010年版附录。
（二）控制菌检查方法的验证 成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应 检查。 验证方法： 取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中， 依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取 规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗 液中，滤过后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养 基中。 结果判断： 若上述试验中检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检 查法进行供试品的该控制菌检查；
（一）计数培养基的适用性检查 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 营养琼脂培养基
白色念珠菌
黑曲霉 白色念珠菌
玫瑰红营养琼脂
酵母浸出粉葡萄糖琼脂
2. 菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的新 鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，培养18～24 小时； 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良 马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。
2. 菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞 菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中； 接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养24～48 小时。 接种白色念珠菌的新鲜培养物至马丁肉汤培养基或改良马丁琼脂培养 基上，培养24～48小时。 用0.9%无菌氯化钠溶液制成1ml含含菌数为500～1000cfu的菌悬液。
滤膜的菌面朝上贴于相应的培养基
阴性对照：取试验用的稀释剂1ml同法操作，作为。阴性对 照不得有菌生长。 规定：每片滤膜上的菌落数应不超过100cfu。 菌数报告原则：以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数。 若滤膜上无菌落生长，以＜1报告菌数(每张滤膜滤过1g或1ml 供试品)，或以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
其中，大肠埃希菌、大肠菌群是口服药品的控制菌之一； 铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌是外用药品和滴眼剂的控 制菌。
（一）控制菌检查用培养基的适用性检查 成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应 检查。 1.菌种（6种） 大肠埃希菌〔CMCC(B) 44102〕 金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26003〕 乙型副伤寒沙门菌〔CMCC(B) 50094〕 铜绿假单胞菌〔CMCC(B) 10104〕 生孢梭菌〔CMCC(B) 64941〕 白色念珠菌〔CMCC(F) 98001〕
2. 大肠菌群(Coliform)
4 个装有 >10ml 乳糖胆 盐发酵培养基管 1 、 2 、 3、4