POD、PPO活性测定：
植物五种酶活性检测方法
植物五种酶活性检测方法Modified by JACK on the afternoon of December 26, 2020选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点(0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。
1、多酚化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定适量茶鲜叶（3g）,料液比1:2，加入内含5%PVP（w/v）经遇冷的pH为的柠檬酸-磷酸盐缓冲液（L）,冰浴研磨，隔夜浸提12h，于4℃、9000r/min离心35min，取上清液，过滤得到初酶液。
取200ml初酶液，加入L柠檬酸-磷酸盐缓冲液200uL,混合反应液（L柠檬酸-磷酸盐缓冲液：脯氨酸：1%邻苯二酚=10:2:3），反应30min（37℃恒温水浴锅），6mol尿素终止反应，460nm波长测吸光度。
对照为不加邻苯二酚的反应混合液。
酶活性单位：本实验条件下，以邻苯二酚反应液在460nm处吸光度值每分钟增加为一个活性单位。
2、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定称取新鲜样品于预冷研钵中，加入6ml L（）硼酸钠-硼酸缓冲液，加入适量的石英砂，冰浴研磨后转入离心管中。
混匀后在4℃冰箱中浸提4h。
4℃10000r/min离心20min，取上清液即为酶提取液。
取酶提取液，加入由硼酸钠缓冲液配制的L L-苯丙氨酸，蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。
PAL的酶活性以每小时在290nm处吸光度变化为一个活力单位。
3、脂氧合酶(linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX)活性的测定取新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。
POD、PPO活性测定：
POD、PPO活性测定：POD 、PPO 活性测定试剂：磷酸缓冲液（代号PBS ）配制A ：Na 2HPO 4?12H 2O 17.91g 加⽔ 1000ml 定容B ：NaH 2PO4?2H 2O 7.8g 加⽔ 1000ml 定容 0.05mol ·l -1PH6PBS 123mlA+877mlB 1000ml 定容即可 0.05mol ·l -1 PH7.8 915 ml A+ 85mlB 1000ml1%PVP （聚⼄烯吡咯烷酮） 10gPVP ——加PBSPH7.8——1000ml （⽤来提取酶液）②愈创⽊酚（即0.02mol ·l -1邻甲氧基苯酚）③30%H 2O 2④25mmol ·l -1焦性没⾷⼦酸（焦培酸）POD 反应液：取50ml0.05mol ·l -1PH6PBS 加⼊ 28µl （愈创⽊粉）加⼊19µl30%H 2O 2 棕⾊瓶PPO 反应液：取50ml0.05mol ·l -1PH6PBS 加⼊ 100µl 焦培酸棕⾊瓶酶液提取：称取0.5g 样品放⼊研钵，分三次共加8ml1%PVP 冰浴研磨全部倒进离⼼管放进离⼼机 4℃、10000r ·min 离⼼15min →取上清夜备⽤（1）POD 测定：3ml 反应液µl 酶液混匀 A470⽐⾊ (以反应液做对照) 每⼀分钟记录⼀次计算：POD 活性（U ·g -1FW ·min -1）=OD470×N 总体积/t ×n ×w ×0.01（2）PPO 测定：3ml 加⼊ 100µl 酶液混匀 30℃⽔中15min A420⽐⾊(以反应液做对照)计算：PPO 活性（U ·g -1FW ·min -1）=OD420×N 总体积/t ×n ×w ×0.001（反应液调零点，⼀个酶单位u 定义为0.001A 值变化）POD 、PPO 、多酚氧化酶的测定试剂：磷酸缓冲液（代号PBS ）配制A ：Na 2HPO 4?12H 2O 17.91g 加⽔ 1000ml 定容B ：NaH 2PO4?2H 2O 7.8g 加⽔ 1000ml 定容 0.05mol ·l -1PH6PBS 123mlA+877mlB 1000ml 定容即可 1%PVP （聚⼄烯吡咯烷酮） 1gPVP 100ml 定容②愈创⽊酚（即0.05 mol ·l -1邻甲氧基苯酚）:取0.6208 g 的愈创⽊酚定容到100ml 容量瓶摇匀即可③0.1mol/LH2O2 5.68ml 稀释⾄1000ml ④25mmol ·l -1焦性没⾷⼦酸（焦培酸）⑤0.1mol/L ⼉茶酚溶液：取0.5506克⼉茶酚溶于50毫升蒸馏⽔中，定容摇匀即可。
过氧化物酶（POD）活性检测试剂盒说明书
Beijing Solarbio Science & Technology Co., LtdTel: 400-968-6088过氧化物酶（POD）活性检测试剂盒说明书微量法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0095规格：100T/96S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体110 mL×1瓶2-8℃保存试剂一液体20 mL×1瓶2-8℃保存试剂二液体0.04 mL×1瓶2-8℃保存试剂三液体3 mL×1瓶2-8℃保存溶液的配制：1、试剂二：液体置于试剂瓶内EP管中，使用前需先离心。
2、试剂二工作液：取0.01mL试剂二加入3.2 mL试剂一混合备用（约106T），现配现用，也可根据样本量按比例配制。
产品说明：POD（EC 1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
POD在有过氧化氢存在的情况下，能使愈创木酚发生氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm有最大光吸收。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细菌、细胞或组织样本的制备细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
酶的测定
一、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚比色法测定）酶液的制取称取0.5g鲜重叶片，加入1ml磷酸缓冲液（PH=7.8,0.05mol/L），冰浴研磨，研磨后再加入4ml磷酸缓冲液。
将研磨液倒入离心管中，平衡。
12000r/min、0-4℃下离心20min，上清液即为酶提取液。
离心后冷藏保存。
POD: 取上清液20微升加入比色杯中（对照加20微升磷酸），加3ml反应液，马上读470nm 下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0，1，2min的OD值）。
反应液：PH＝6.0的磷酸缓冲液50ml，加入愈创木酚28微升，于磁力搅拌器上加热溶解，加入30％H2O219微升混合保存于冰箱中。
POD活性=ΔA470*V/（a*W）V-酶液总体积（ml）；a-测定时酶液体积（ml）；W-样品重（g）可溶性蛋白含量的测定取上清夜20微升（对照加20微升水），加3ml考马斯亮蓝，放置2min后，马上于595mn 下比色。
样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=（C*V/a）/(W*1000)C-查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；V-提取液总体积（ml）；a-测定所取提取液体积（ml）；W-取样量（g）。
可溶性蛋白含量（ug）：y=0.0061x－0.0359（R2=0.9563）二、多酚氧化酶（PPO）活性测定（比色法测定）PPO活性的测定参照李焕秀（1994）的方法进行改进。
一、原理：多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌。
多酚氧化酶活性可以用氧电极测量反应耗氧的速度，或用比色法测量产物的形成，常用的底物如邻苯二酚（儿茶酚）和多巴。
二、材料：树皮韧皮部（分别在压条育苗前期、愈伤组织形成期、根原基形成期和不定根生长期进行取样）三、仪器与用具：高速低温台式离心机；分光光度计；1mL 、5mL的移液管；5mL离心管；研钵；试管数支；10mL容量瓶；秒表；水浴锅；四、试剂：1、0.1mol·L-1，pH 6.0的磷酸柠檬酸缓冲液；2、1%（10g/L）的邻苯二酚（1g用蒸馏水定容至100 mL）；3、0.1%(1/L)的脯氨酸（0.1g（0.05）用蒸馏水定容至100 mL（50））；4、石英砂；五、方法步骤1、酶液提取取鲜样0. 5－1.0g, 加1 mL 磷酸柠檬酸缓冲液（0.1mol·L-1，pH 6.0），加少量石英砂，在冰浴中研磨成匀浆,加缓冲液9mL稀释（按100mg鲜重材料加1mL提取液的比例），使终体积为10mL（研完冰盘放回冰箱）。
酶活性测定方法
一、过氧化物酶（POD）活性的测定POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。
测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。
然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。
在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。
以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。
△470 ×V TPOD活性=0.01×t×Vs×W式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）t----反应的时间（min）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）W----样品鲜重（g）二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。
酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。
PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。
混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。
PPO活性= O D×V T0.01×t×0.5g×V s= O D×V T0.005OD——反应时间内吸光值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）T———反应时间(min)；三、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的测定参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。
POD活性测定
可见光的范围350-770，紫外A 400-315nm，B 315-280nm，C 280-190nm酶活单位=△ODmg一1·FW·min一11. POD活性测定：称取组织1g放于研钵中，加5mL0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH5.5）在冰浴中研磨成匀浆。
将匀浆全部转入离心管中，在3000rpm，4℃条件下离心10min，上清液为酶粗提液，4℃保存备用。
取酶液100μL，加反应混合液1. 2.9ml 0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH5.5)2. 1mL 0.05mol/L愈创木酚溶液，0.05mol/L愈创木酚溶液,0.06207g愈创木酚定容10ml3. 1.0 ml 2%H2O2, 30% H2O2670μL，加水至10ml.在37℃水浴中混合均匀，于470nm处测定其吸光度，连续记录3min。
以不加酶的反应混合液作对照，每30秒钟读一次数，以每分钟吸光度值变化值0.01为一个酶活单位。
酶活计算: OD290。
g- 1.FW.h- 1=OD变化值/材料鲜重/反应时间POD的酶活性增加倍数与抗病性呈正相关2. CAT活性测定：设置两个重复一个对照,测定体系包括1. 0.2 ml酶液、2. 1.5 ml磷酸缓冲液pH7.0、3. 1 ml蒸馏水，4. 25℃预热后逐管加入300μL 0.1 mol/L的H2O2 (30% H2O256.8μL加水至10ml.)在240 nm下测定吸光度，每隔1 min读一次，共测3 min，以1 min内减少0.1的酶量为1个酶活单位。
3. SOD活性的测定：采用改进的高灵敏度的氯化硝基氮兰四唑（NBT）光还原法测定SOD活性。
每处理取3个小烧杯，分别加入3mLSOD反应液（参照附录B），A）0.lmol/L pH7.8磷酸缓冲液准确称取0.72gNa2HPO4·12H2O溶于20ml水中取18.3mL；准确称取0.312gNaH2PO4·2H2O 溶于20mL水中取1.7mL，混合并定容至20mL。
植物五种酶活性检测方法
欢迎阅读选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点(0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。
1、多酚化酶（Polyphenoloxidase ，PPO ）活性的测定适量茶鲜叶（3g ）,料液比1:2，加入内含5%PVP （w/v ）经遇冷的pH 为7.2的柠檬酸-，取上取 1.2ml （（37℃恒合液。
0.01为2离心20min 取酶提取液0.2ml ，加入由硼酸钠缓冲液配制的0.1mol/LL-苯丙氨酸，2.8ml 蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min ，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。
PAL 的酶活性以每小时在290nm 处吸光度变化0.01OD 为一个活力单位。
3、脂氧合酶(linoleate:oxygenoxidoreductase ，LOX )活性的测定取0.2g新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（pH7.6）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。
4℃、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液。
Lox酶活性单位以每分钟在234nm处吸光度变化0.01OD作为一个活力单位。
4、过氧化物酶（PDA）的活性测定（愈创木酚法）取0.5克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质0.05mol/LPH7.8的磷酸缓冲液（含1%PVP[取2-3ml5分ΔA470积（ml，5取（含1%PVP12h。
1000r/min离心20min,得到酶初提液。
取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。
取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）。
（测定30s读数一次，5分钟）。
酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。
过氧化物酶活性的测定POD
过氧化物酶活性的测定POD一、原理： 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。
本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H 2O 2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚红棕色的物质可用分光光度计在470nm 处测定其消光值，即可求出该酶的活性。
，二、实验准备仪器：分光光度计、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器试剂：愈创木酚、30%H 2O 2、0.2mol/L 磷酸缓冲液（7.8）、0.1mol/L 磷酸缓冲溶液（PH6.0，见附录） 反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲溶液（PH6.0）50ml ，加入愈创木酚28μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解、待溶液冷却后，加入（待溶液冷却后再加入，否则引起分解）30%H 2O 2 19μl ，混合均匀，保存于冰箱中。
]三、步骤：1、粗酶液的提取：称取植物材料0.4-0.5g ，加磷酸缓冲液（7.8）5ml （分几次加入），于研钵中研磨成匀浆，以8000r/min 离心10min ，收集上清液于冷处（冰箱4度保存）。
2、酶活性的测定：一个试管入反应混合液3ml ，磷酸缓冲液（7.8） 1ml ，作为校零对照，另外加入反应混合液3ml ，上述酶液1ml （龙麦26酶液稀释10倍，克旱16酶液稀释15倍），立即开启秒表计时，于470nm 测OD 值，每隔15秒读1次值，读45秒，以为每15秒钟OD 变化值测酶活性的大小，以△OD/min.mg 蛋白质表示。
四、计算公式W t t ⋅⋅⋅∆=01.0V VA 活性POD 470 ΔA 470：反应时间内吸光值的变化W ：样品重量V ：提取液总体积，即5mlVt ：测定时所用体积,即1mlt ：反应时间注意：一般来说，都需要稀释，如果酶液稀释了，应在计算时乘上相应的倍数。
——张志良，瞿伟菁，P 123-124,2004高教版《植物生理学实验指导》——李玲主编，P 97-98，科学出版社，2009,《植物生理学模块实验指导》磷酸缓冲液配置A 0.2mol/l NaH2PO4 27.8g NaH2PO4•H2O 1000mlB 0.2mol/l Na2HPO4 71.7g Na2HPO4•12H2O 1000mlA(ml) B(ml)PH7.8 8.5 91.5200mlPH6.0 87.7 12.3。
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POD 、PPO 活性测定
试剂：磷酸缓冲液（代号PBS ）配制
A ：Na 2HPO 4•12H 2O 17.91g 加水 1000ml 定容
B ：NaH 2PO4•2H 2O 7.8g 加水 1000ml 定容 0.05mol ·l -1
PH6PBS 123mlA+877mlB 1000ml 定容即可 0.05mol ·l -1 PH7.8 915 ml A+ 85mlB 1000ml
1%PVP （聚乙烯吡咯烷酮） 10gPVP ——加PBSPH7.8——1000ml （用来提取酶液）
②愈创木酚（即0.02mol ·l -1
邻甲氧基苯酚） ③30%H 2O 2
④25mmol ·l -1
焦性没食子酸（焦培酸）
POD 反应液：
取50ml0.05mol ·l -1
PH6PBS 加入 28μl （愈创木粉）加入19μl30%H 2O 2 棕色瓶
PPO 反应液：
取50ml0.05mol ·l -1
PH6PBS 加入 100μl 焦培酸 棕色瓶
酶液提取：
称取0.5g 样品放入研钵，分三次共加8ml1%PVP 冰浴研磨 全部倒进离心管 放进离心机 4℃、10000r ·min 离心15min →取上清夜备用
（1）POD 测定：
3ml 反应液μl 酶液 混匀 A470比色 (以反应液做对照) 每一分钟记录一次
计算：POD 活性（U ·g -1
FW ·min -1
）=OD470×N 总体积/t ×n ×w ×0.01
（2）PPO 测定：
3ml 加入 100μl 酶液 混匀 30℃水中15min A420比色(以反应液做对照)
计算：PPO 活性（U ·g -1
FW ·min -1
）=OD420×N 总体积/t ×n ×w ×0.001
（反应液调零点，一个酶单位u 定义为0.001A 值变化）
POD 、PPO 、多酚氧化酶的测定
试剂：磷酸缓冲液（代号PBS ）配制
A ：Na 2HPO 4•12H 2O 17.91g 加水 1000ml 定容
B ：NaH 2PO4•2H 2O 7.8g 加水 1000ml 定容 0.05mol ·l -1
PH6PBS 123mlA+877mlB 1000ml 定容即可 1%PVP （聚乙烯吡咯烷酮） 1gPVP 100ml 定容
②愈创木酚（即0.05 mol ·l -1
邻甲氧基苯酚）:取0.6208 g 的愈创木酚定容到100ml 容量瓶摇匀即可
③0.1mol/LH2O2 5.68ml 稀释至1000ml ④25mmol ·l -1
焦性没食子酸（焦培酸）
⑤0.1mol/L 儿茶酚溶液：取0.5506克儿茶酚溶于50毫升蒸馏水中，定容摇匀即可。
POD 反应液：
取20ml0.05mol ·l -1
PH6PBS 加入10ml （愈创木酚）加入10ml30%H 2O 2 棕色瓶
PPO 反应液：
取25ml0.05mol ·l -1
PH6PBS 加入 50 l 焦培酸 棕色瓶
多酚氧化酶反应液：
取20ml0.05mol ·l -1
PH6PBS 加入 10ml 儿茶酚
测定步骤：
0.5g 烟叶 5mlPBS 冰浴研磨 12000g 离心30min 上清夜
POD 0.5ml 酶液 3ml 反应液，470nm 比色，每一分钟纪录吸光值 PPO 420nm 比色
多酚氧化酶420nm 比色，每一分钟纪录吸光值
△A 470*Vt
酶活性= 〔u/(g ·min)〕 W*V s *0.01*T
△A 470为反应时间内吸光度的变化; V t ：酶提取液总量(5ml)
V s ：测定时所取提取液的量(0.5ml)
W ：样品重量（g ） T ：反应时间（5min ）
离心管
PPO 测定
试剂：
165mmol/LPH7.0磷酸缓冲液（PBS ） 1%(w/v)PVP 60%乙醇 无水乙醇
底物：100ml 柠檬酸-磷酸缓冲液（PH6.3）加入吐温20 0.1ml ，摇匀，加入0.25ml 亚油酸（0.0075mol/L ）摇匀乳化。
测定步骤：
0.2g 烟叶 PBS PVP 研磨，匀浆，单层纱布过滤 4℃ 1000*g
离心5min 除去残渣 15000*g 离心20min ，取上清夜
0.3ml 酶液 0.7ml 底物，摇匀，30℃保温5min 2ml 无水乙醇，摇匀 3ml60%乙醇，摇匀 取1ml ，用60%乙醇稀释至10ml 234nm 比色
对照：0.3ml 酶液 70-80℃水浴加热5-10min 0.7ml 底物，摇匀，30℃保温5min
2ml 无水乙醇，摇匀 3ml60%乙醇，摇匀 取1ml ，用60%乙醇稀释至10ml 234nm 比色
酶活性（ g/FW ）=10*(OD234-OD ’234)*V/t*Vx*W
V 提取液总体积，Vx 测定时取酶液体积，t 为反应时间。
OD 不杀死酶的吸光值，OD ‘为杀死酶作对照。