常规液相色谱柱测定早熟素Ⅱ的方法探讨

生态环境学报 2009, 18(5): 1914-1916 Ecology and Environmental Sciences E-mail: editor@基金项目：国家自然科学基金项目(No.30860066)；海南省自然科学基金项目(No.30612)；中国热带农业科学院博士启动基金 作者简介：张桂花（1983年生），女（内蒙古兴安盟人），硕士研究生。

E-mail: zhangguihua123123@ *通讯作者，李勤奋，E-mail: qinfenli@ 收稿日期：2009-08-04常规液相色谱柱测定早熟素Ⅱ的方法探讨张桂花1, 2，李光义2，文少白1, 2，李勤奋2 *1. 海南大学环境与植物保护学院，海南 儋州 571737；2. 农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室//中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南 儋州571737摘要：通过使用市售的常规C18液相色谱柱（规格：150 m m×4.6 mm ，5 μm ），探讨了早熟素Ⅱ的分析方法并对其进行了可行性论证。

以V (甲醇)∶V (水)=80∶20为流动相，流量1 mL·min -1，检测波长为224 nm ，柱温35 ℃。

得出早熟素Ⅱ在8～108 μg·mL -1的范围内呈良好的线性关系（相关系数r 为0.99997），最低检出限为1.0379 μg·mL -1（信噪比为3），加标回收率为93.3%～104.98%，变异系数为0.12%~4.41%。

与使用非常规色谱柱分析早熟素Ⅱ的方法相比，该方法采用了市售常规柱，能够更大限度地满足实验条件，通用性更强。

关键词：早熟素Ⅱ；高效液相色谱法；常规柱中图分类号：X703 文献标识码：A 文章编号：1674-5906（2009）05-1914-03早熟素Ⅱ别名6,7-二甲氧基-2,2-二甲基-3-色烯，分子式如图1是一类抗保幼激素类似物[1]。

该物质首次于20世纪70年代由Bowers 等从观赏植物熊耳草（Ageratum houstorianum ）中分离得到,与其同时发现的还有早熟素Ⅰ，由于这两种物质能够使某些半翅目若虫提前变态，故命名早熟素[2]。

早熟素Ⅱ是苯并吡喃类化合物，为浅黄色针状晶体或油状液体，易溶于石油醚、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂，难溶于水[3]。

早熟素Ⅱ除了可以使某些昆虫提前变态外，还被证明具有较强的化感作用[4]。

近年来利用高效液相色谱法测定早熟素Ⅱ的方法已有报道[5]，但该方法中采用的液相色谱柱为市售非常规柱(规格：125 mm ×4.0 mm ，5 μm)，因此其应用范围具有一定的局限性。

为寻找适用范围较广的检测早熟素Ⅱ含量的方法，本文探讨了利用市售常规液相色谱柱测定早熟素Ⅱ的方法，从而使该物质的分析测定更加简便。

1 仪器与材料Dionex 高效液相色谱仪：P680泵，Ultimate3000自动进样器，PDA-100光电二极管阵列检测器。

岛津AUY220电子天平，DL-360B 智能超声波清洗器，XW-80A 漩涡混合器，隔膜真空泵，BuchiR-215旋转蒸发仪。

试剂：甲醇（色谱纯），甲醇（分析纯），超纯水，石油醚（分析纯）。

标准品：早熟素Ⅱ标准品购于上海波以尔化工有限公司。

样品：按照胡飞等人的方法[6](略有改动)制备胜红蓟鲜样水提液，将浓缩后的水溶液多次用柱色谱分离（200~300 目硅胶，以石油醚为淋洗液），收集含早熟素Ⅱ的黄色溶液，将该溶液旋转蒸发浓缩，用甲醇（分析纯）溶解浓缩液后过自装层析柱，把过柱后的溶液再旋转蒸发，用甲醇（色谱纯）定容，即得供试用样品溶液。

自装层析柱（10 mm ×300 mm ）：由下到上分别装入1 g 无水硫酸钠（650 ℃灼烧4 h ），1 g 柱层析硅胶（200~300 目，130 ℃活化8 h ），0.5 g 无水硫酸钠。

2 实验方法2.1 色谱条件色谱柱：Luna-C18柱(150 mm ×4.6 mm ，5 μm)，柱温35 ℃，流量：1 mL·min -1，进样量：10 μL 。

2.1.1 检测波长的选择在190～380 nm 范围内对早熟素Ⅱ标准品的紫外吸收进行了波长扫描，早熟素Ⅱ的最大吸收波长为224 nm ，因此选择224 nm 作为早熟素Ⅱ的检测波长。

2.1.2 流动相的选择在波长224 nm 、流量1 mL·min -1、进样量10 μL 的条件下，选用了不同配比的甲醇/水为流动相进行图1 早熟素Ⅱ的分子结构图 Fig.1 Molecular structure of Precocene Ⅱ张桂花等：常规液相色谱柱测定早熟素Ⅱ的方法探讨 1915实验，结果表明，流动相V (甲醇)∶V (水)=80∶20时早熟素Ⅱ的保留时间为3.317 min ，峰形良好。

在此条件下，对含早熟素Ⅱ的供试样品进行分析表明，早熟素Ⅱ与其他组分分离良好。

因此，最终选定流动相为V (甲醇)∶V （水）=80∶20。

早熟素Ⅱ标准品与样品的色谱图见图2。

2.2 标准溶液的配制精密称取早熟素Ⅱ标准品5 mg 于50 mL 容量瓶中，以甲醇为溶剂定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度为0.1 mg·mL -1的标准溶液。

3 结果与讨论3.1 线性关系考察分别精确吸取早熟素Ⅱ标准溶液0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 mL 于5 mL 容量瓶中，以甲醇为溶剂定容摇匀。

按上述确定的色谱条件测定，以峰面积对早熟素Ⅱ的含量做线性回归。

回归方程为y =1.0548x +0.1357，相关系数r =0.99997，表明早熟素Ⅱ质量浓度的线性范围为8～108 μg·mL -1。

早熟素Ⅱ的标准曲线如图3所示。

3.2 精密度实验按1中的方法制备早熟素Ⅱ供试样品，将该样品精确等量吸取5份配制等体积的供试溶液，每份重复测定3次，取平均值。

在选定的色谱条件下操作，测定峰面积值，以峰面积计算RSD 。

结果见表1，求得早熟素Ⅱ样品溶液峰面积的RSD 为0.08%，表明该方法精密度良好。

3.3 稳定性实验精确吸取供试样品溶液10 μL ，每隔2 h 进样，每次重复进5针，测定峰面积值，结果见表2。

求得早熟素Ⅱ峰面积的RSD 为0.32%，表明供试样品至少在10 h 内稳定。

3.4 加标回收率实验在早熟素Ⅱ样品溶液中分别加入相当于0.06、0.3、0.6 mg 的早熟素Ⅱ标准品，每个浓度设置3个重复和空白对照，按上述方法步骤及选定的色谱条件分析测定并计算添加回收率。

结果表明，早熟素Ⅱ标准品在样品中的平均回收率在93.3%～104.98%之间，变异系数为0.12%～4.41%，详见表3。

(a)早熟素Ⅱ标准品色谱图(b)早熟素Ⅱ样品色谱图图2 早熟素Ⅱ标准品与样品的色谱图 Fig.2 HPLC chromatogram of Precocene standard Ⅱand Precocene Ⅱ sample表2 供试样品稳定性实验 Table 2 The stability test of sample 时间t /h平均峰面积积分值0 245.048 2 246.406 4 244.938 6 245.129 8 244.427 10 246.205 RSD/% 0.32102030405060708090100浓度/（ug•mL-1）m A U图3 早熟素Ⅱ的标准曲线Fig.3 The calibration curve of Precocene Ⅱ表1 方法精密度实验 Table 1 The precision test of method 试验号峰面积积分值1 27.9682 27.963 3 27.9534 27.965 27.912 RSD/% 0.08质量浓度/(μg·mL -1)1916 生态环境学报 第18卷第5期（2009年9月）4 结论通过实验建立了利用市售常规的液相色谱柱测定早熟素Ⅱ含量的方法。

结果表明该方法准确度好、精密度高、线性范围宽、回收率高，是一种实用、有效的检测方法，可用于早熟素Ⅱ的定量分析。

参考文献：[1] 李乾君, 管致和, 龚和. 早熟素Ⅱ对家蝇卵黄发生的影响[J]. 昆虫学报, 1993, 36(2): 129-137.LI Qianjun, GUAN Zhihe, GONG He. Effect of Precocene on vite Ⅱl-logenesis of housefly Musca domestica vicina [J]. Acta Entomologica Sinica, 1993, 36(2): 129-137.[2] 傅贻玲, 项秀芬, 关雪辰. 早熟素Ⅱ处理粘虫蛾对两性吸引的影响[J]. 昆虫学报, 1986, 29(1): 1-11.FU Yiling, XIANG Xiufen, GUAN Xuechen. Effect of PrecoceneⅡon sex attractancy in the moths of armyworm Mythimna sepa-rate (Walker)[J]. Acta Entomologica Sinica, 1986, 29(1): 1-11. [3] 韦琦, 曾任森, 孔垂华, 等. 胜红蓟地上部化感作用物的分离与鉴定[J]. 植物生态学报, 1997, 21(4): 360-366.WEI Qi, ZENG Rensen, KONG Chuihua, et al. The isolation and identification of allelochemicals from aerial parts of tropical Agera-tum [J]. Acta Phytoecologica Sinica, 1997, 21(4): 360-366.[4] 孔垂华, 徐涛, 胡飞. 胜红蓟化感作用研究Ⅱ主要化感物质的释放途径和活性[J]. 应用生态学报, 1998, 9(3): 257-260.KONG Chuihua, XU Tao, HU Fei. Allelopathy of Ageratum cony-zoides .Ⅱ Releasing mode and activity of main allelochemicals[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 1998, 9(3): 257-260.[5] 孔垂华, 徐效华, 陈建军, 等. 胜红蓟化感作用研究.Ⅸ主要化感物质在土壤中的转化[J]. 生态学报, 2002, 22(8): 1189-1195.KONG Chuihua, XU Xiaohua, CHEN Jianjun, et al. Allelopathy of Ageratum conyzoides .Transformation of Ⅸmain allelochemical in the Soil[J]. Acta Ecologica Sinica, 2002, 22(8): 1189-1195.[6] 胡飞, 孔垂华. 胜红蓟化感作用研究.Ⅰ水溶物的化感作用及其化感物质分离鉴定[J]. 应用生态学报, 1997, 8(3): 304-308.HU Fei, KONG Chuihua. Allelopathy of Ageratum conyzoides . A Ⅰl-lelopathy of Ageratum conyzoides aqueous extract and isolation and identification of its allelochemicals[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 1997, 8(3): 304-308.Method for determination of precocene Ⅱwith conventionalliquid chromatographic columnZHANG Guihua 1, 2, LI Guangyi 2, WEN Shaobai 1, 2，LI Qinfen 2*1. College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Danzhou Hainan 571737, China;2. Key Laboratory of Monitoring and Control of Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests, Ministry of Agriculture//Environment and Plant Protection Institute, CATAS, Danzhou Hainan, 571737, ChinaAbstract: A method for determination of precocene was developed by HPLC with Ⅱconventional C18 column(150 mm ×4.6 mm, 5 um)and its feasibility assessment was made. The samples were analyzed on a Luna C18 column using methyl alcohol- ultrapure water (80∶20, V/V ) as the mobile phase at a flow rate of 1 mL·min -1. The detection wavelength was 224 nm and the column tem-perature was 35 . ℃Well linear relationship was showed at the range of 8～108 μg·mL -1 and correlation coefficient of the calibration curve was 0.99997. The detection limit was 1.0379 μg·mL -1 (S/N=3). The recovery of added sample ranged from 93.3% to 104.98% with the relative standard deviations of 0.12%~4.41%. Comparing with other measuring methods using unconventional column, bet-ter versatility was manifested by the method in which a conventional liquid chromatographic column which was easily available in the market was employed and expetimental conditions were met to a great extent. Key words: precocene Ⅱ; HPLC; conventional liquid chromatographic column表3 早熟素Ⅱ加标回收率实验 Table 3 The recovery test of Precocene Ⅱ添加量/mg平均回收量/mg回收率/%变异系数/%0.06 0.063 104.98 4.41 0.3 0.283 94.33 0.63 0.6 0.56 93.3 0.12。