原核表达系统PPT课件
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外源基因的原核表达培训课件
1、原核生物：选择一个RNase缺失 的工程菌株。
2、真核生物：提高mRNA的正确加 工
2/11/2024
外源基因的原核表达
27
外源基因mRNA的有效翻译 为使外源基因有效翻译，在构建表
达体系时应考虑以下问题：
1、AUG为首选起始密码子 2、SD序列为与核糖体结合位点
3、SD序列与起始密码子之间的距离为 3～9个碱基 4、在翻译起始区周围的序列不易形成 明显的二级结构 5、选择合适的终止密码子
都是异源基因，甚至是真核生物基
因，而在细胞内积累大量的异源蛋 白极易被降解。造成重组异源蛋白 在大肠杆菌中不稳定的原因有： 1、大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加 工和蛋白质折叠系统；
2/11/2024
外源基因的原核表达
39
2、大肠杆菌不具备类似真核细胞 的亚细胞结构和表达产物稳定因子；
3、大量的异源重组蛋白在大肠杆 菌细胞中形成高浓度微环境，导致 蛋白质分子之间的作用增强。
• 3、宿主本身杂蛋白质多，纯化步骤复 杂。
2/11/2024
外源基因的原核表达
7
大肠杆菌基因表达载体
理想的大肠杆菌表达载体的特征 1、稳定的遗传和复制能力，在无选
择压力下保存于大肠杆菌细胞内 2、具有显性的转化筛选标记 3、转录可以调控，抑制时本底转录
水平较低 4、转录的mRNA能够在适当的位置
终止且转录不影响载体的复制 5、具备适用于外源基因插入酶切位
点
2/11/2024
外源基因的原核表达
8
大肠杆菌基因表达载体构成
1、复制子：是一段包含起始位点和 反式因子作用区在内的DNA片段。 其功能是通过复制使载体稳定存在 于大肠杆菌细胞。
2/11/2024
2、真核生物：提高mRNA的正确加 工
2/11/2024
外源基因的原核表达
27
外源基因mRNA的有效翻译 为使外源基因有效翻译，在构建表
达体系时应考虑以下问题：
1、AUG为首选起始密码子 2、SD序列为与核糖体结合位点
3、SD序列与起始密码子之间的距离为 3～9个碱基 4、在翻译起始区周围的序列不易形成 明显的二级结构 5、选择合适的终止密码子
都是异源基因，甚至是真核生物基
因，而在细胞内积累大量的异源蛋 白极易被降解。造成重组异源蛋白 在大肠杆菌中不稳定的原因有： 1、大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加 工和蛋白质折叠系统；
2/11/2024
外源基因的原核表达
39
2、大肠杆菌不具备类似真核细胞 的亚细胞结构和表达产物稳定因子；
3、大量的异源重组蛋白在大肠杆 菌细胞中形成高浓度微环境，导致 蛋白质分子之间的作用增强。
• 3、宿主本身杂蛋白质多，纯化步骤复 杂。
2/11/2024
外源基因的原核表达
7
大肠杆菌基因表达载体
理想的大肠杆菌表达载体的特征 1、稳定的遗传和复制能力，在无选
择压力下保存于大肠杆菌细胞内 2、具有显性的转化筛选标记 3、转录可以调控，抑制时本底转录
水平较低 4、转录的mRNA能够在适当的位置
终止且转录不影响载体的复制 5、具备适用于外源基因插入酶切位
点
2/11/2024
外源基因的原核表达
8
大肠杆菌基因表达载体构成
1、复制子：是一段包含起始位点和 反式因子作用区在内的DNA片段。 其功能是通过复制使载体稳定存在 于大肠杆菌细胞。
2/11/2024
原核表达 PPT课件
融合蛋白的亲和纯化
运载蛋白 ß-半乳糖苷酶 GST MBP 多聚组氨酸 蛋白A 聚精氨酸 FLAG
亲和配基 APTG IPEG 谷胱甘肽 交联直链淀粉 固化Zn2+或Ni2+ IgG S-琼脂糖凝胶 FLAG特异抗体
洗脱方法 硼酸钠 还原性谷胱甘肽 麦芽糖 酸性梯度咪唑 0.5mol/L 乙酸 NaCl梯度 中性EDTA或pH3.0苷氨酸 缓冲液
（4）1200 rpm，离心2min，收集菌体。 （5）弃上清，向沉淀中加入500ml Starting buffer（20mM磷酸缓冲液
（Na2HPO4和NaH2PO4），200mM NaCl，10%甘油，pH 7.0）， 充分悬浮洗涤菌体。
（6）12000 rpm，离心2min，收集菌体。 （7）向沉淀中加入15ml的starting buffer，重悬菌体。 （8）冰浴条件下超声波处理3min，每处理30sec间隔1min使菌液冷却，
2 含T7噬菌体启动子的表达载体（例如pET系列载体） 外源基因表达受T7噬菌体RNA聚合酶调控，具有氨苄或者卡 那抗性，多克隆位点置于T7噬菌体RNA聚合酶启动子之后
3 带有&噬菌体PL 启动子的表达载体（ pPLc系列 pKC30 等） 受温度敏感性阻抑物cIts857调控，低温时能抑制PL 驱动的转录，高温不能
ß-半乳糖苷酶的表达很容 易检测，IPTG，诱导
phoA信号肽利于蛋白质向 周质转运
IPTG诱导启动子，有切割 序列
IPTG诱导地东子MBP信号 肽利于蛋白质向周质分泌
T7启动子（IPTG 诱导）有 化学切割，酶切割位点
IPTG诱导启动子，有肠激 酶切割序列
• 融合蛋白里的伴侣蛋白(运载蛋白)高亲和力 的与特定配基结合，使得纯化融合蛋白 ， 一步就可以达到目的
原核基因的表达PPT幻灯片
基因调控是现阶段分子生物学研 究的中心课题。要了解动、植物 生长发育的规律、形态结构特征 和生物学功能，就必须弄清楚基 因表达调控的时间和空间概念。
基因表达调控(gene regulation)： 对从DNA到mRNA再到蛋白质这个过程 的调节就称为基因表达调控。
原核细胞基因的表达调控主要在转 录水平上进行。
某一代谢途径最终产物合成酶的基因 可以被这个产物本身所关闭。这种基 因被称为可阻遏基因，这些酶被称为 可阻遏酶，这个现象被称为可阻遏现 象，这些起阻遏作用的小分子被称为 阻遏物。
可阻遏基因
它们是一些合成各种细胞代谢过程 中所必须的小分子物质(如氨基酸、 嘌呤和嘧啶等)的基因，由于这类物 质在生命过程中的重要地位，这些 基因总是打开着的。只有当细菌生 活环境中有充分供应时，才关闭这 些基因，停止其合成。
正转录调控(Positive transcription regulation)。
负转录调控系统
负转录调控：调节基因产生阻遏蛋白 (repressor) ，与操纵区结合阻止结构 基因转录。作用部位是操纵区。
负控诱导： 阻遏蛋白不与诱导物结合时， 阻遏蛋白与操纵区相结合，结构基因不 转录，阻遏蛋白结合上诱导物时，阻遏 蛋白与操纵区分离，结构基因转录。
引言
原核生物和单细胞真核生物没有核膜和明 显的核结构，直接暴露在变幻莫测的环境 中，本身既无足够的能源储备，又无高等 植物那种制造有机物的本领，食物供应毫 无保障，只有能根据环境条件的改变合成 各种不同的蛋白质，使代谢过程适应环境 的变化，才能维持自身的生存和繁衍。它 有一套准确地调节基因表达和蛋白质合成 的机制。
当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的 空载的tRNA，会激活焦磷酸转移酶，使 ppGpp大量合成。
《原核表达实验》课件
克隆表达载体
选择合适的表达载体，根据载体和目标基因序列的特点进行克隆操作。注意 避免操作中可能发生的错误。
转化表达宿主菌
根据实验要求选择适当的表达宿主菌，通过化学方法、热激转化等方式将表 达载体导入宿主菌中，并对转化结果进行鉴定。
培养表达
根据所选宿主菌的特性和表达需求，进行培养条件的优化。添加适当的诱导 剂，控制表达过ห้องสมุดไป่ตู้的时机和水平。
《原核表达实验》PPT课 件
原核表达实验PPT课件
简介
原核表达实验是一种常用的生物学实验方法，用于在原核生物中大量表达蛋 白质。通过本课程，了解原核表达实验的重要性和应用。
实验流程
1
克隆表达载体
2
选择合适的表达载体，并进行克隆操作，
确保载体和目标基因的正确组装。
3
培养表达
4
在适当的培养条件下，添加诱导剂，使
宿主菌表达目标蛋白质。
5
制备DNA模板
从适当来源获取DNA模板，构建表达载体， 为实验做好准备。
转化表达宿主菌
选择合适的表达宿主菌，通过转化方法 将表达载体导入宿主菌中。
纯化蛋白质
根据需要选择合适的方法进行蛋白质纯 化，以获取高纯度的目标蛋白质。
制备DNA模板
DNA模板的来源包括基因库、PCR产物等。构建表达载体，并根据实验需要制备适量的DNA模板，为后续实验 做好准备。
纯化蛋白质
根据目标蛋白质的特性和实验要求，选择适当的纯化方法，例如亲和层析、离子交换层析等，保证纯度和活性。
结论
通过学习原核表达实验，我们可以更好地理解蛋白质的结构和功能，并为未来的科研工作提供有力的支持。 总结原核表达实验的优缺点，展望其在未来科学研究中的应用前景。
原核表达系统
05
原核表达系统的研究进展
研究现状
基因克隆技术
随着基因克隆技术的发展，越来 越多的基因被成功克隆并用于原 核表达系统中，为生物制品的制 备提供了更多选择。
表达载体构建
原核表达系统中的表达载体是关 键因素，目前已经构建了多种高 效表达载体，能够实现外源基因 的高水平表达。
宿主菌选择
宿主菌的选择对原核表达系统的 表达效果至关重要，经过不断筛 选和改良，已成功应用于生产实 践的宿主菌种类不断增加。
通过原核表达系统可以大量制 备蛋白质，用于研究蛋白质之 间的相互作用和复合物组装。
蛋白质工程改造
利用原核表达系统可以对蛋白 质进行体外进化、定向改造等 ，提高蛋白质的特性和功能。
在生物科学研究中的应用
蛋白质组学研究
生物信息学研究
原核表达系统可用于蛋白质组学研究， 大量制备蛋白质并进行分析，揭示蛋 白质的结构和功能。
原核表达系统
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原核表达系统的基本原理 • 原核表达系统的应用 • 原核表达系统的优缺点 • 原核表达系统的研究进展 • 结论
01
引言
主题简介
原核表达系统是一种利用原核生物（如细菌）作为宿主细胞进行 目的基因表达的技术。
它具有操作简便、成本低廉、表达量高等优点，广泛应用于基因 工程、蛋白质工程等领域。
翻译过程中，宿主菌的 核糖体识别mRNA上 的起始密码子，开始翻 译目的基因，合成蛋白 质。
通过调控启动子和终止 子等元件，可以控制目 的基因的表达水平和方 向。
03
原核表达系统的应用
在生物制药领域的应用
80%
生产重组蛋白药物
原核表达系统可用于生产重组蛋 白药物，如胰岛素、生长激素等 ，用于治疗各种疾病。
原核表达实验 ppt课件
目标蛋白的纯化 目标蛋白的鉴定—Western biotting
PPT课件
4
融合蛋白诱导表达流程图
XylB
CK
37 ℃, O/N
1ml LB+Kan
37℃, O/N
37 ℃, 2.7h
3ul
3ul 3ul
1ml LB+Kan
37 ℃, 2.7h
100mM IPTG
3ul
50ml LB+Kan
150ul
• 用TBS-T漂洗：15分钟，1次；5分钟，2次。
PPT课件
26
操作步骤4 一抗杂交
• 在室温条件下，将NC膜转入含有1％脱脂牛奶和合 适稀释度的一抗的TBS-T溶液中（1:1000），孵育 1至2小时；
• 用TBS-T漂洗：15分钟，1次；5分钟，2次。
PPT课件
27
操作步骤5 二抗进行杂交
• 各样品在室温以10000rpm离心1分钟，取上清10-20ul SDS-PAGE蛋白电泳。
PPT课件
22
操作步骤2 蛋白质的半干式电转移
（戴手套操作）
• 将蛋白胶的积层胶切除(当胶上的样品较少时，不含目 的蛋白的胶应都切除，使剩下的胶块尽可能小)，然后 浸入Towbin buffer中平衡；
• 预先准备专用的滤片2张(或18张滤纸)和1张硝酸纤维
素滤膜，其大小都应与凝胶大小吻合；用铅笔在滤膜 一角做好标记；
• 将 1张滤片(或9张滤纸)在Towbin buffer中浸润后放 置在电极上(如用9张滤纸则应逐张叠放整齐) ，用玻 璃棒挤出所有气泡。（具体摆放顺序见下图）
PPT课件
23
• 于Towbin buffer中浸润硝酸纤维素滤膜，然后置于滤纸/片 上，排出气泡；
PPT课件
4
融合蛋白诱导表达流程图
XylB
CK
37 ℃, O/N
1ml LB+Kan
37℃, O/N
37 ℃, 2.7h
3ul
3ul 3ul
1ml LB+Kan
37 ℃, 2.7h
100mM IPTG
3ul
50ml LB+Kan
150ul
• 用TBS-T漂洗：15分钟，1次；5分钟，2次。
PPT课件
26
操作步骤4 一抗杂交
• 在室温条件下，将NC膜转入含有1％脱脂牛奶和合 适稀释度的一抗的TBS-T溶液中（1:1000），孵育 1至2小时；
• 用TBS-T漂洗：15分钟，1次；5分钟，2次。
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27
操作步骤5 二抗进行杂交
• 各样品在室温以10000rpm离心1分钟，取上清10-20ul SDS-PAGE蛋白电泳。
PPT课件
22
操作步骤2 蛋白质的半干式电转移
（戴手套操作）
• 将蛋白胶的积层胶切除(当胶上的样品较少时，不含目 的蛋白的胶应都切除，使剩下的胶块尽可能小)，然后 浸入Towbin buffer中平衡；
• 预先准备专用的滤片2张(或18张滤纸)和1张硝酸纤维
素滤膜，其大小都应与凝胶大小吻合；用铅笔在滤膜 一角做好标记；
• 将 1张滤片(或9张滤纸)在Towbin buffer中浸润后放 置在电极上(如用9张滤纸则应逐张叠放整齐) ，用玻 璃棒挤出所有气泡。（具体摆放顺序见下图）
PPT课件
23
• 于Towbin buffer中浸润硝酸纤维素滤膜，然后置于滤纸/片 上，排出气泡；
克隆基因表达--原核表达ppt课件
的表达产量高、表达产物稳定、生物
活性高和表达产物容易分离纯化。这
就要求选择合适的宿主细胞，合适的
表达载体和适当的纯化方案。
4
宿主细胞应满足以下要求：
容易获得较高浓度的细胞且利用易得廉价原料 不致病、不产生内毒素 发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态 容易进行DNA重组技术操作和代谢调控 产物的产量、产率高且易于提取纯化
8
大肠杆菌表达体系的特点
• 经过长期的研究，已经掌握了有关大肠杆菌基础生物学、 遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对基 因表达调控的分子机理； • 被发展成为安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的 寄主菌株和不同类型的载体系列；
• 许多克隆的真核基因，如生长素和胰岛素基因等已实现 有效的、高水平的表达； • 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进 行工业化批量生产。
9
（一）对外源目的基因的要求
真核基因含有的内含 子，可在基因转录过 真核启动子缺乏结合 程被RNA酶催体系剪 细菌核糖体所必须的 真核基因 mRNA分子 辑删除掉 SD 序列；细菌的 的 5’端帽子和 3’端尾 细菌缺乏对真核基 RNA 聚合酶不能识别 巴结构影响其在原核 （1）利用大肠杆菌表达真核基因存在问题 因的蛋白产物正确 真核启动子 中的稳定性和与核糖 折叠和组装过程， 结构上存在很大的区别 体结合的能力 表达产物要经过复 转译起始信号不同 性异源性蛋 白 mRNA分子结构的不同 原核生物缺乏转译后的修饰过程
细菌的蛋白酶能识别目的蛋白并将其降解
10
（一）对外源目的基因的要求
（2） 外源目的基因的基本要求
不含有内含子结构（cDNA或是mRNA） 不具有5´端非编码区
11
（二）原核生物表达载体
活性高和表达产物容易分离纯化。这
就要求选择合适的宿主细胞，合适的
表达载体和适当的纯化方案。
4
宿主细胞应满足以下要求：
容易获得较高浓度的细胞且利用易得廉价原料 不致病、不产生内毒素 发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态 容易进行DNA重组技术操作和代谢调控 产物的产量、产率高且易于提取纯化
8
大肠杆菌表达体系的特点
• 经过长期的研究，已经掌握了有关大肠杆菌基础生物学、 遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对基 因表达调控的分子机理； • 被发展成为安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的 寄主菌株和不同类型的载体系列；
• 许多克隆的真核基因，如生长素和胰岛素基因等已实现 有效的、高水平的表达； • 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进 行工业化批量生产。
9
（一）对外源目的基因的要求
真核基因含有的内含 子，可在基因转录过 真核启动子缺乏结合 程被RNA酶催体系剪 细菌核糖体所必须的 真核基因 mRNA分子 辑删除掉 SD 序列；细菌的 的 5’端帽子和 3’端尾 细菌缺乏对真核基 RNA 聚合酶不能识别 巴结构影响其在原核 （1）利用大肠杆菌表达真核基因存在问题 因的蛋白产物正确 真核启动子 中的稳定性和与核糖 折叠和组装过程， 结构上存在很大的区别 体结合的能力 表达产物要经过复 转译起始信号不同 性异源性蛋 白 mRNA分子结构的不同 原核生物缺乏转译后的修饰过程
细菌的蛋白酶能识别目的蛋白并将其降解
10
（一）对外源目的基因的要求
（2） 外源目的基因的基本要求
不含有内含子结构（cDNA或是mRNA） 不具有5´端非编码区
11
（二）原核生物表达载体
《原核表达系统》课件
详细描述
原核表达系统是一种利用原核生物（如细菌）进行基因表达的方法。通过将外源基因插入到原核生物的质粒或染 色体DNA中，利用这些生物的转录和翻译系统合成目的蛋白。原核表达系统广泛应用于基因工程、蛋白质工程、 药物研发等领域。
原核表达系统的应用领域
总结词
原核表达系统广泛应用于基因工程、蛋白质工程、药物研发等领域，用于生产重组蛋白、抗体、疫苗 等生物制品。
药物设计与筛选
蛋白质结晶研究有助于揭示蛋白质的结构与功能关系，为药物设计与筛选提供理论依据 。利用原核表达系统可以快速获得大量具有特定功能的蛋白质，为药物研发提供有力支
持。
蛋白质相互作用研究
互作蛋白的鉴定
通过原核表达系统可以获得与目标蛋白 相互作用的互作蛋白，为互作蛋白的鉴 定提供有力支持。
VS
互作机制的研究
利用原核表达系统可以深入研究蛋白质之 间的相互作用机制，揭示互作蛋白在生命 过程中的作用。
05
原核表达系统的改进 与发展
提高表达产物的产量
探索新的宿主菌
通过选择或改良宿主菌，提高表达产物的产量。例如，使用具有更 强蛋白表达能力的菌株或对现有菌株进行基因改造。
优化培养条件
通过调整培养基成分、温度、pH等条件，促进宿主菌的生长和蛋 白质的表达。
详细描述：原核表达系统的优点包括操作简便、成本低 廉、表达量高等。由于原核生物的遗传背景和生理特征 比较简单，因此在进行基因表达时不需要太过复杂的操 作。此外，原核生物具有较高的繁殖速度，可以快速地 生产大量的目的蛋白。但是，原核表达系统也存在一些 缺点，如表达产物可能存在免疫原性、翻译后修饰功能 不足等。此外，由于原核生物的转录和翻译机制与真核 生物存在差异，因此有些真核生物基因在原核表达系统 中可能无法得到理想的表达效果。
原核表达系统是一种利用原核生物（如细菌）进行基因表达的方法。通过将外源基因插入到原核生物的质粒或染 色体DNA中，利用这些生物的转录和翻译系统合成目的蛋白。原核表达系统广泛应用于基因工程、蛋白质工程、 药物研发等领域。
原核表达系统的应用领域
总结词
原核表达系统广泛应用于基因工程、蛋白质工程、药物研发等领域，用于生产重组蛋白、抗体、疫苗 等生物制品。
药物设计与筛选
蛋白质结晶研究有助于揭示蛋白质的结构与功能关系，为药物设计与筛选提供理论依据 。利用原核表达系统可以快速获得大量具有特定功能的蛋白质，为药物研发提供有力支
持。
蛋白质相互作用研究
互作蛋白的鉴定
通过原核表达系统可以获得与目标蛋白 相互作用的互作蛋白，为互作蛋白的鉴 定提供有力支持。
VS
互作机制的研究
利用原核表达系统可以深入研究蛋白质之 间的相互作用机制，揭示互作蛋白在生命 过程中的作用。
05
原核表达系统的改进 与发展
提高表达产物的产量
探索新的宿主菌
通过选择或改良宿主菌，提高表达产物的产量。例如，使用具有更 强蛋白表达能力的菌株或对现有菌株进行基因改造。
优化培养条件
通过调整培养基成分、温度、pH等条件，促进宿主菌的生长和蛋 白质的表达。
详细描述：原核表达系统的优点包括操作简便、成本低 廉、表达量高等。由于原核生物的遗传背景和生理特征 比较简单，因此在进行基因表达时不需要太过复杂的操 作。此外，原核生物具有较高的繁殖速度，可以快速地 生产大量的目的蛋白。但是，原核表达系统也存在一些 缺点，如表达产物可能存在免疫原性、翻译后修饰功能 不足等。此外，由于原核生物的转录和翻译机制与真核 生物存在差异，因此有些真核生物基因在原核表达系统 中可能无法得到理想的表达效果。
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与信肠激酶
12
13
原核表达宿主菌的选择
BL21（DE3）：为 λ DE3 溶原菌，其染色体上带有一拷 贝由 lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。
命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶 （为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性质粒。 带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产 生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合 酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力 的目标蛋白的 pET 重组体。
molecular mass of about 20KD. The samples were collected 2h, 4h, 6h after induction by IPTG from pET32b
(lane1,4,7) and from pET32b-SCMRP (lane2,5,8), respectively. The samples were collected 2h, 4h, 6h from pET32b-SCMRP (lane3,6,9), respectively. M：Protein Molecular Weight Marker.
Fig.3.6 SDS-PAGE result of SCMRP recombinant protein in E. coli strain DE3.
The results showed the fused proteins are expressed in E. coli by IPTG induction. The fused protein has a
基因原核表达系统
1
2
转录载体 翻译载体
4
LIC （连接非 依赖的克隆）
5
6
图3.5 SCMRP基因原核表达 M：蛋白质分子量标准；泳道1：IPTG诱导BL21(DE3 pET-32b)总蛋白；泳道2~4：IPTG诱导 BL21(DE3 pET-32bS)总蛋白。
Fig. 3.5 Prokaryotic expression of gene SCMRP
M: protein marker; lane1: purification protein through Ni-NTA; lane2: the whole cell protein expressed by
BL21(DE3 pET-32b) induced by IPTG; lane3: the whole cell protein expressed by BL21(DE3 pET-32bS)
Fig. 3.7 The dissolvability analysis of prokaryotic expression product of the gene SCMRP
M: protein marker; lane1-2: dissolvable group of fusion protein by BL21(DE3 pET-32bS); lane3: dissolvable
group of fusion protein by BL21(DE3 pET-32b); lane5-7: insolvable group of fusion protein by BL21(DE3
pET-32bS); lane8: insolvable group of fusion protein by BL21(DE3 pET-32b).
M: Protein Molecular Weight Marker; lane1: the whole cell protein of BL21(DE3 pET-32b) induced by IPTG;
lane 2~4: the whole cell protein of BL21(DE3 pET-32bS) induced by IPTG.
图3.6 SCMRP融合蛋白大肠杆菌中表达的SDS-PAGE电泳图 M：蛋白质分子量标准；1、4、7泳道分别是IPTG诱导pET32b表达2、4、6小时的DE3的总蛋白；2、5、 8泳道分别是IPTG诱导重组质粒pET32bS表达2、4、6小时的DE3的总蛋白；3、6、9泳道分别是无 IPTG诱导时，重组质粒pET32bS表达2、4、6小时的DE3的总蛋白。
图3.8 SCMRP原核表达产物Western blot分析 M：蛋白质分子量标准；泳道1：Ni-NTA纯化SCMRP；泳道2：IPTG诱导BL21(DE3 pET-32b)总蛋白； 泳道3：IPTG诱导BL21(DE3 pET-32bS)总蛋白；泳道4：无IPTG诱导BL21(DE3 pET-32bS)总蛋白。 Fig. 3.8 Western blot analysis of prokaryotic expression product of SCMRP
induced by IPTG; lane4: the whole cell protein expressed by BL21(DE3 pET-32bS) without IPTG induction.
蛋白质溶解方式调节
与溶解性高的蛋白质序列融合 如GST、Trx（硫氧还蛋白 ）、NusA
与催化二硫键形成的酶融合 如Trx、DsbA、DsbC
14
Rosetta （DE3）： Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来， 可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该 菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。这样 Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠 杆菌密码子使用频率导致的表达限制。
图3.7 SCMRP基因原核表达产物溶解形式分析 M：蛋白质分子量标准；泳道1、2：BL21(DE3 pET-32bS)表达蛋白质的可溶组分；泳道3：BL21(DE3 pET-32b)表达蛋白质的可溶组分；泳道5、6、7：BL21(DE3 pET-32bS)表达蛋白质的不溶组分；泳道8： BL21(DE3 pET-32b)表达蛋白质的不溶组分。
12
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原核表达宿主菌的选择
BL21（DE3）：为 λ DE3 溶原菌，其染色体上带有一拷 贝由 lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。
命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶 （为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性质粒。 带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产 生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合 酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力 的目标蛋白的 pET 重组体。
molecular mass of about 20KD. The samples were collected 2h, 4h, 6h after induction by IPTG from pET32b
(lane1,4,7) and from pET32b-SCMRP (lane2,5,8), respectively. The samples were collected 2h, 4h, 6h from pET32b-SCMRP (lane3,6,9), respectively. M：Protein Molecular Weight Marker.
Fig.3.6 SDS-PAGE result of SCMRP recombinant protein in E. coli strain DE3.
The results showed the fused proteins are expressed in E. coli by IPTG induction. The fused protein has a
基因原核表达系统
1
2
转录载体 翻译载体
4
LIC （连接非 依赖的克隆）
5
6
图3.5 SCMRP基因原核表达 M：蛋白质分子量标准；泳道1：IPTG诱导BL21(DE3 pET-32b)总蛋白；泳道2~4：IPTG诱导 BL21(DE3 pET-32bS)总蛋白。
Fig. 3.5 Prokaryotic expression of gene SCMRP
M: protein marker; lane1: purification protein through Ni-NTA; lane2: the whole cell protein expressed by
BL21(DE3 pET-32b) induced by IPTG; lane3: the whole cell protein expressed by BL21(DE3 pET-32bS)
Fig. 3.7 The dissolvability analysis of prokaryotic expression product of the gene SCMRP
M: protein marker; lane1-2: dissolvable group of fusion protein by BL21(DE3 pET-32bS); lane3: dissolvable
group of fusion protein by BL21(DE3 pET-32b); lane5-7: insolvable group of fusion protein by BL21(DE3
pET-32bS); lane8: insolvable group of fusion protein by BL21(DE3 pET-32b).
M: Protein Molecular Weight Marker; lane1: the whole cell protein of BL21(DE3 pET-32b) induced by IPTG;
lane 2~4: the whole cell protein of BL21(DE3 pET-32bS) induced by IPTG.
图3.6 SCMRP融合蛋白大肠杆菌中表达的SDS-PAGE电泳图 M：蛋白质分子量标准；1、4、7泳道分别是IPTG诱导pET32b表达2、4、6小时的DE3的总蛋白；2、5、 8泳道分别是IPTG诱导重组质粒pET32bS表达2、4、6小时的DE3的总蛋白；3、6、9泳道分别是无 IPTG诱导时，重组质粒pET32bS表达2、4、6小时的DE3的总蛋白。
图3.8 SCMRP原核表达产物Western blot分析 M：蛋白质分子量标准；泳道1：Ni-NTA纯化SCMRP；泳道2：IPTG诱导BL21(DE3 pET-32b)总蛋白； 泳道3：IPTG诱导BL21(DE3 pET-32bS)总蛋白；泳道4：无IPTG诱导BL21(DE3 pET-32bS)总蛋白。 Fig. 3.8 Western blot analysis of prokaryotic expression product of SCMRP
induced by IPTG; lane4: the whole cell protein expressed by BL21(DE3 pET-32bS) without IPTG induction.
蛋白质溶解方式调节
与溶解性高的蛋白质序列融合 如GST、Trx（硫氧还蛋白 ）、NusA
与催化二硫键形成的酶融合 如Trx、DsbA、DsbC
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Rosetta （DE3）： Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来， 可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该 菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。这样 Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠 杆菌密码子使用频率导致的表达限制。
图3.7 SCMRP基因原核表达产物溶解形式分析 M：蛋白质分子量标准；泳道1、2：BL21(DE3 pET-32bS)表达蛋白质的可溶组分；泳道3：BL21(DE3 pET-32b)表达蛋白质的可溶组分；泳道5、6、7：BL21(DE3 pET-32bS)表达蛋白质的不溶组分；泳道8： BL21(DE3 pET-32b)表达蛋白质的不溶组分。